医用分子遗传学DNA复制.ppt
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1、第三章第三章 DNA 复制复制(Replication of DNA)DNA DNA 复制一般特征复制一般特征参与参与DNADNA复制的酶类复制的酶类DNADNA复制基本过程复制基本过程DNADNA复制的调控复制的调控DNADNA损伤与修复损伤与修复第一节第一节 DNA复制的一般特征复制的一般特征一、一、DNA的生物学功能的生物学功能1、储存遗传信息、储存遗传信息2、复制遗传信息、复制遗传信息3、表达遗传信息、表达遗传信息4、遗传变异、遗传变异1962,Nobel PrizeWatson(Nature,1953):Watson(Nature,1953):我们假设的特异的(碱基)配对方式我们假设
2、的特异的(碱基)配对方式我们假设的特异的(碱基)配对方式我们假设的特异的(碱基)配对方式提示了遗传物质可能的复制机制:每一条链均可作为合成提示了遗传物质可能的复制机制:每一条链均可作为合成提示了遗传物质可能的复制机制:每一条链均可作为合成提示了遗传物质可能的复制机制:每一条链均可作为合成一条新链的模板,就使子代双螺旋与母本完全一致。一条新链的模板,就使子代双螺旋与母本完全一致。一条新链的模板,就使子代双螺旋与母本完全一致。一条新链的模板,就使子代双螺旋与母本完全一致。二、二、DNA复制方式复制方式全保留全保留半保留半保留分散式分散式DNA如何进行复制?如何进行复制?15NP0P1P2P3P4P
3、0P2P0P414N 15N/14N 15NMeselson-Stahl experiment1958,PNAS根据实验结果:根据实验结果:根据实验结果:根据实验结果:第一代第一代第一代第一代DNADNA仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能DNA的半保留复制的半保留复制 Semiconservative Replication DNA双链解开,以单链做模板,碱基互补双链解开,以单链做模板,碱基互补原则,各自合成一条链。在新合成的原则,各自合成一条链。在新合成的DNA双链分子中,双链分子中,一条是原来的老
4、链,一条是原来的老链,一条是新链一条是新链。第二代出现两条带,一条完全轻带一条中带第二代出现两条带,一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能,证明否定了分散式复制的可能,证明DNA只能是只能是半保留方式进行复制半保留方式进行复制2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性复制时复制时DNA链延伸可能有三种方式:链延伸可能有三种方式:12 3 1967年,日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生年,日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生1001000bp的短片段的短片段没有从没有从3 5 延长延长DNA链的聚合酶链的聚合酶2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性一一条条链链连连续续合合成成,称称
5、主主导导链链,Leading Leading Strand Strand 另另 一一 条条 链链 分分 段段 合合 成成,称称 随随 从从 链链Lagging StrandLagging Strand 。原原因因:DNADNA双双螺螺旋旋分分子子两两条条链链方方向向相相反反,新新链链合成的方向只能合成的方向只能5 533一个方向合成。一个方向合成。3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行,形成两个复制叉在两个方向同时进行,形成两个复制叉(Replication Fork).概括:概括:半保留半保留半不连续性半不连续性双向性双向性第三节第三节 参与参与DNA复制的酶类复制的酶类参与
6、参与DNA复制的酶或蛋白因子:复制的酶或蛋白因子:1 DNA聚合酶聚合酶 催化催化DNA的合成的合成2 引物酶引物酶 起始起始RNA的合成的合成3 连接酶连接酶 连接冈崎片段连接冈崎片段4 DNA解链,解旋酶解链,解旋酶5 DNA结合蛋白结合蛋白一一 DNA聚合酶聚合酶(Polymerase)1956年,大肠杆菌年,大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 1959,Nobel Prize(一)(一)作用机制作用机制 以以DNA做模板,碱基互补配对,做模板,碱基互补配对,催化催化4种种dNTP之间形成磷酸二酯之间形成磷酸二酯键,从而延长键,从而延长DNA链。链。Mg2+在在模板模板链上进行链上进行 不能从头
7、合成,在不能从头合成,在引物引物的的3 3OHOH端上延端上延长长新链延长方向为新链延长方向为5 533延长延长 (二)(二)原核生物原核生物DNA聚合酶聚合酶 有有3 3种:种:DNADNA聚合酶聚合酶 I I,IIII,IIIIII。多功能酶多功能酶:合成合成DNADNA的活性的活性 聚合酶作用聚合酶作用,延长延长DNADNA链。链。水解水解DNADNA的活性的活性 外切核酸酶活性外切核酸酶活性,切除不配对切除不配对碱基,起校读作用碱基,起校读作用1、DNA聚合酶聚合酶 I大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I:单链多肽蛋白质单链多肽蛋白质,分子量为分子量为109KD.109KD.
8、性质:多功能酶性质:多功能酶大亚基:大亚基:5 533聚合酶活性聚合酶活性 3 355外切酶活性外切酶活性小亚基:小亚基:5 533外切酶活性。外切酶活性。1000nt/min1000nt/min35外切酶活性外切酶活性 从游离从游离3OH端切割端切割,识别和消除不识别和消除不配对的核苷酸,保证了配对的核苷酸,保证了DNA复制的忠实复制的忠实性。性。53外切酶活性外切酶活性 DNA聚合酶聚合酶I中的小亚基带有中的小亚基带有5外切酶外切酶活性,从双链活性,从双链DNA的的5端降解释放出单端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸。核苷酸或寡聚核苷酸。35外切活性示意图外切活性示意图DNA聚合酶特有活性聚合
9、酶特有活性 DNA聚合酶聚合酶I 在在DNA复制中所起的作用复制中所起的作用不是不是主要的复制酶主要的复制酶RNARNA引物的切除引物的切除DNADNA损伤的修复:紫外线作用形成的损伤的修复:紫外线作用形成的TTTT二二 聚体的切除聚体的切除链置换:链置换:可能参与遗传重组可能参与遗传重组切口平移(切口平移(nick translationnick translation)探针标记探针标记2 DNA聚合酶聚合酶II不是复制酶,主要在不是复制酶,主要在DNADNA修复中起作用,无修复中起作用,无5 533外切酶活性。外切酶活性。5%DNA5%DNA聚合酶聚合酶I I的活性的活性3 DNA聚合酶聚
10、合酶 III 1972 1972年发现年发现催化效率高,主要复制酶。由催化效率高,主要复制酶。由1010种种亚基组成亚基组成:(1 1)核心聚合酶:)核心聚合酶:5 53 3DNADNA聚合酶活聚合酶活性性 :3 3-5-5外切酶活性,外切酶活性,控制控制 复制忠实性复制忠实性 :核心酶的组建:核心酶的组建 (2 2)二聚体:二聚体:构成滑动钳,将全酶构成滑动钳,将全酶固定在固定在DNADNA模板上,提高合成速率(模板上,提高合成速率(20/20/秒秒-750/-750/秒。秒。(3 3)复合物复合物 :2 2 协助协助 二聚体结合到二聚体结合到 DNADNA E.coli DNA 聚合酶聚合
11、酶不对称二聚体不对称二聚体 DNA聚合酶聚合酶 III形成不对称的二聚体,与形成不对称的二聚体,与DNADNA双链结合,后随双链结合,后随链折叠链折叠1801800 0,使后随链的物理方向,使后随链的物理方向与主导链与主导链一一致,同时催化两条链的复制。致,同时催化两条链的复制。3 5 3 5 3535解链方向解链方向领头链领头链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)35DNA 聚合酶聚合酶 pol pol pol 亚基数目亚基数目 1 7 105 3 聚合聚合酶酶活性活性 +3 5 外切酶活性外切酶活性 +5 3 外切酶活性外切酶活性 +-聚合速度聚合速
12、度(核苷酸核苷酸/分分)1 000-1 200 2 400 15 000-60 000 持续合成能力持续合成能力 3-200 1 500 500 000功能功能 切除引物切除引物,修复修复 修复修复 复制复制大肠杆菌大肠杆菌3种种DNA聚合酶性质比较聚合酶性质比较(三)(三)真核生物真核生物DNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 的作用的作用DNADNA聚合酶聚合酶 :多亚基、多功能酶。多亚基、多功能酶。大亚基:大亚基:DNADNA聚合酶活性。聚合酶活性。100nt/100nt/次次小亚基:引物酶活性,小亚基:引物酶活性,合成合成RNARNA。起始起始DNADNA的合成:合成的合成:合成
13、RNARNA引物和在引物和在RNA3RNA3羟基端合成一段羟基端合成一段DNADNA。DNADNA聚合酶聚合酶 的作用的作用DNADNA聚合酶聚合酶 的的结构结构多亚基组成:多亚基组成:P125 P125 大亚基,催化亚基,含聚合酶和大亚基,催化亚基,含聚合酶和 外切酶活性外切酶活性P50 P50 与增殖细胞核抗原与增殖细胞核抗原(PCNA)(PCNA)结合相关结合相关P66P66P12P12DNA聚合酶聚合酶 的的功能功能主要主要DNADNA复制酶:复制酶:DNADNA聚合酶活性,延伸聚合酶活性,延伸DNADNA链。链。与与RFCRFC和和PCNAPCNA形成形成“全酶全酶”,在,在RFCR
14、FC和和PCNAPCNA等的协同下,促使等的协同下,促使DNADNA聚合酶聚合酶 的解离的解离,DNADNA聚聚合酶合酶 接替接替DNADNA聚合酶聚合酶 继续继续DNADNA链的合成链的合成-DNADNA聚合酶聚合酶 向向DNADNA聚合酶聚合酶 的转换。的转换。复制校正功能:复制校正功能:3 3-5-5外切核酸酶活性外切核酸酶活性DNADNA聚合酶聚合酶 、主要功能:主要功能:DNADNA修复。修复。DNADNA聚合酶聚合酶:线粒体:线粒体DNADNA复制复制 二、真核生物DNA聚合酶附属蛋白 1 1、PCNA:增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nucle
15、ar Proliferating Cell Nuclear Antigen)Antigen),DNADNA聚合酶的附属蛋白,参聚合酶的附属蛋白,参与与DNADNA的合成,类似的合成,类似 二聚体。二聚体。2 2、RFC:复制因子:复制因子C(Replication C(Replication Factor C)Factor C)。多亚基复合物,。多亚基复合物,DNADNA聚合酶聚合酶的附属蛋白,的附属蛋白,识别引物末端识别引物末端,参与链的延参与链的延长。类似长。类似 复合物。复合物。3、PRP1和和PRP2 Primer Recognition Protein 增加增加DNA聚合酶聚合酶 与
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