免疫学方法及其应用 (2)精选课件.ppt

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1、关于免疫学方法及其应用(2)第一页，本课件共有69页病原微生物感染病原微生物感染机体对抗机体对抗免疫免疫免疫学几个基本概念免疫学几个基本概念免疫免疫(immunity)：是人和动物机体的一种是人和动物机体的一种保护性反应，保护性反应，其作用是其作用是“识别识别”和排除抗原性和排除抗原性“异物异物”，以维持机体生，以维持机体生理的平衡和稳定。理的平衡和稳定。免疫学：免疫学：研究机体自我识别和对抗原性异物排斥反应研究机体自我识别和对抗原性异物排斥反应的一门科学。的一门科学。传统的免疫概念：传统的免疫概念：机体抵抗病原微生物的能力，即机体抵抗病原微生物的能力，即抗传染免疫抗传染免疫1.1.免疫免疫和

2、免疫学和免疫学第二页，本课件共有69页2.2.免疫系统免疫系统免疫系统：免疫系统：具有自身的运行机制并可与其他系统相互配具有自身的运行机制并可与其他系统相互配合、相互制约，共同维持机体在生命过程中总的生理平合、相互制约，共同维持机体在生命过程中总的生理平衡。衡。免疫系统的任务是消灭免疫系统的任务是消灭“异己异己”“异己异己”来自两个方面来自两个方面:(1)(1)外来的入侵者：外来的入侵者：(2)(2)侵入身体的各种侵入身体的各种致病菌致病菌包括哪些？包括哪些？(3)(3)(2)“(2)“变坏了的变坏了的”自身细胞。自身细胞。(4)(4)细胞癌变细胞癌变第三页，本课件共有69页免疫系统的生理功能

3、免疫系统的生理功能免疫防御免疫防御机体机体排斥排斥外源性抗原异物的能力。外源性抗原异物的能力。免疫自稳免疫自稳机体机体识别和清除识别和清除自身衰老残损的组织自身衰老残损的组织 、细胞，维持正常内环境稳定。、细胞，维持正常内环境稳定。免疫监视免疫监视机体机体杀伤和清除杀伤和清除异常突变细胞，机体异常突变细胞，机体 监视和抑制恶性肿瘤在体内生长。监视和抑制恶性肿瘤在体内生长。第四页，本课件共有69页机机体防御机制体防御机制人体第一道防线人体第一道防线天然免疫天然免疫(非特异性免非特异性免疫疫)屏障结构、非特异性免疫细胞和免疫分子组成。屏障结构、非特异性免疫细胞和免疫分子组成。人体第二道防线人体第二

4、道防线获得性免疫获得性免疫(特异性免特异性免疫疫)分类：分类：n体液免疫体液免疫 n细胞免疫细胞免疫第六页，本课件共有69页 抗感染免疫的构成因素抗感染免疫的构成因素天然免疫与获得性免疫的关系天然免疫与获得性免疫的关系在抗感染免疫过程中，天然免疫与获得性免疫相互依赖与协在抗感染免疫过程中，天然免疫与获得性免疫相互依赖与协作，共同发挥消除病原微生物感染的作用作，共同发挥消除病原微生物感染的作用。第七页，本课件共有69页吞噬细胞的吞噬和杀菌过程示意图吞噬细胞的吞噬和杀菌过程示意图第八页，本课件共有69页第三节第三节特异性免疫特异性免疫包括两个基本内容：包括两个基本内容：（1 1）免疫原性：免疫原性

5、：抗原刺激有机体产生特异性免疫反抗原刺激有机体产生特异性免疫反 应的能力；应的能力；（2 2）反应原性：反应原性：抗原与相应抗体在体内或体外发生抗原与相应抗体在体内或体外发生 特异性结合反应的能力；特异性结合反应的能力；抗原性：抗原性：免疫原性和反应原性的统称。免疫原性和反应原性的统称。三免疫分子及其在体液免疫中的作用三免疫分子及其在体液免疫中的作用、抗原与抗体简介抗原与抗体简介抗抗原原(antigen)定义：定义：凡是能刺激有机体凡是能刺激有机体(人或人或动物体动物体)产生抗体，产生抗体，并能与相应抗体发生特异性并能与相应抗体发生特异性结合的物质。结合的物质。第九页，本课件共有69页(一一)

6、、抗、抗原原1 1、抗原的基本性质、抗原的基本性质（1 1）异物性）异物性 （2 2）大分子量）大分子量 （3 3）特异性）特异性 抗原刺激机体后只能产生相应的抗体并能与之结合。抗原刺激机体后只能产生相应的抗体并能与之结合。特异性是由抗原表面的抗原决定基特异性是由抗原表面的抗原决定基(簇簇)决定的。决定的。抗原决定基（表位）：抗原决定基（表位）：抗原分子中决定抗原特异性的基抗原分子中决定抗原特异性的基 本结构或具有化学活性的基团。本结构或具有化学活性的基团。抗原决定基抗原决定基是与抗体特异性结合的基本单位。是与抗体特异性结合的基本单位。（4 4）化学结构复杂）化学结构复杂 免疫原性的形成还要求

7、蛋白质分子的化学结构复杂。极性基团愈多或含支链氨基酸愈多，以及带芳香族氨基酸多的蛋白质抗原性愈强。第十页，本课件共有69页2、抗原的种类、抗原的种类按抗原性的完整与否及其在机体内刺激抗体产生的特点，按抗原性的完整与否及其在机体内刺激抗体产生的特点，可分为完全抗原和不完全抗原。可分为完全抗原和不完全抗原。（1 1）完全抗原与不完全抗原）完全抗原与不完全抗原 完全抗原完全抗原 既有免疫原性又有反应原性。即能刺激机体产生抗体，并既有免疫原性又有反应原性。即能刺激机体产生抗体，并 与产生的抗体在体内或体外与产生的抗体在体内或体外(试管内试管内)发生反应的抗原。发生反应的抗原。如细菌、病毒、外毒素、血清

8、白蛋白、花粉蛋白、不完全抗原（半抗原）不完全抗原（半抗原）只有反应原性而没有免疫原性。即不能单独刺激机体产生只有反应原性而没有免疫原性。即不能单独刺激机体产生 抗体，若与蛋白质或胶体颗粒结合，形成大分子复合物成抗体，若与蛋白质或胶体颗粒结合，形成大分子复合物成 为完全抗原，则可刺激机体产生抗体。为完全抗原，则可刺激机体产生抗体。如各种低分子量的药物、脂类和多糖等都属于不完全抗原。第十一页，本课件共有69页（2 2）细菌抗原）细菌抗原第十二页，本课件共有69页菌体抗原菌体抗原 （O O抗原）抗原）在细胞壁上，主要抗原。主要成分为脂多糖。根据在细胞壁上，主要抗原。主要成分为脂多糖。根据O O抗原的

9、抗原的组成不同进行分群。组成不同进行分群。O O抗原抗原耐热耐热，121121，2h2h不被破坏。不被破坏。如沙门氏菌属的O抗原不同分成67个血清群。鞭毛抗原（鞭毛抗原（H H抗原）抗原）在鞭毛中，由蛋白质组成，具有不同的种和型特异性，可作在鞭毛中，由蛋白质组成，具有不同的种和型特异性，可作菌型鉴别。菌型鉴别。H H抗原不耐热，抗原不耐热，56568080，303040min40min即被破坏。即被破坏。在制备O抗原时常用煮沸法消除H抗原。2 2、抗原的种类、抗原的种类（2 2）细菌抗原）细菌抗原第十三页，本课件共有69页表面抗原（表面抗原）表面抗原（表面抗原）包围在细菌细胞壁最外面，故称。表

10、面抗原随菌种和结构的包围在细菌细胞壁最外面，故称。表面抗原随菌种和结构的不同可有不同的名称。不同可有不同的名称。如肺炎链球菌荚膜抗原；大肠杆菌、痢疾志贺氏菌 包膜抗原或K抗原，沙门氏菌属Vi抗原等。菌毛抗原菌毛抗原 存在于菌毛中的抗原，也具有特异的抗原性。存在于菌毛中的抗原，也具有特异的抗原性。外毒素和类毒素外毒素和类毒素 细菌外毒素具有很强的抗原性，能刺激机体产生抗毒素抗体。细菌外毒素具有很强的抗原性，能刺激机体产生抗毒素抗体。外毒素经外毒素经0.3%0.3%0.4%0.4%甲醛溶液处理后使其失去毒性，但仍保持甲醛溶液处理后使其失去毒性，但仍保持抗原性，即成为类毒素。抗原性，即成为类毒素。2

11、 2、抗原的种类、抗原的种类（2 2）细菌抗原）细菌抗原第十四页，本课件共有69页(二二)、抗、抗体体(antibody,Ab)定义：定义：抗原刺激有机体抗原刺激有机体(人或动物人或动物)所产生的具有特异性的免疫球蛋所产生的具有特异性的免疫球蛋白。白。抗体是由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类糖蛋白，能与相应抗原表位结合，是介导体液免疫的重要免疫分子。分泌型分泌型(secreted Ig,sIg)：膜型膜型(membrane Ig,mlg)：在在血清血清和组织液中，和组织液中，占全部机体血清的占全部机体血清的20%25%。具有抗体的各种免疫功能具有抗体的各种免疫功能是是B细胞表面的抗

12、原受体。细胞表面的抗原受体。含有免疫球蛋白的血清，称为含有免疫球蛋白的血清，称为免疫血清或抗血清。免疫血清或抗血清。第十五页，本课件共有69页(二二)、抗、抗体体1 1、抗体的性质、抗体的性质（1 1）免疫球蛋白是一种糖蛋白，具有蛋白质的通性。）免疫球蛋白是一种糖蛋白，具有蛋白质的通性。凡能破坏球蛋白的各种理化因素均能使之灭活；能被多 种蛋白水解酶裂解；可以在乙醇、三氯醋酸或中性盐类 中沉淀，生产上常用50%饱和硫酸铵或硫酸钠从免疫血 清中提取抗体球蛋白。（2 2）在体外）在体外(试管内试管内)，抗体可与相应的抗原发生特异性结，抗体可与相应的抗原发生特异性结 合并出现可见反应；合并出现可见反应

13、；在体内，与其他防御机能协同作用下杀灭病原菌，起在体内，与其他防御机能协同作用下杀灭病原菌，起 到抗感染作用。到抗感染作用。但某些抗体在机体内与相应的抗原相遇时，能引起变态反应变态反应。如青霉素过敏等。第十六页，本课件共有69页（3 3）由不同细胞克隆产生的抗体具有不均一性和结构的）由不同细胞克隆产生的抗体具有不均一性和结构的 多样性。多样性。例如将血清电泳时，免疫球蛋白主要分布于球蛋白区，因而曾称抗体为球蛋白，也有少量延伸到区和2区。抗体作为一种球蛋白，对异种动物又是很好抗原。因此抗体作为一种球蛋白，对异种动物又是很好抗原。因此,抗体抗体 即是抗体，又是抗原。利用此种特性可以制备抗免疫球蛋白

14、即是抗体，又是抗原。利用此种特性可以制备抗免疫球蛋白 抗体抗体(或或称抗抗体称抗抗体)，用于荧光抗体技术中，用于荧光抗体技术中(间接法间接法)。1 1、抗体的性质、抗体的性质第十七页，本课件共有69页2 2、抗体的基本结构、抗体的基本结构两条重链两条重链(H(H链链)两条轻链两条轻链(H(H链链)440440个氨基酸残基组成，分子量约个氨基酸残基组成，分子量约505070kD70kD220220个氨基酸组成，分子量约个氨基酸组成，分子量约22.5kD22.5kD。二硫键二硫键(-SS-)(-SS-)根据重链的氨基酸顺序同源程度的差异，可将根据重链的氨基酸顺序同源程度的差异，可将IgIg分为类和

15、亚类。分为类和亚类。人的免疫球蛋白共人的免疫球蛋白共5 5类：类：IgG IgG、IgA IgA、Ig MIg M、IgDIgD和和IgEIgE第十八页，本课件共有69页2 2、抗体的基本结构、抗体的基本结构N N端端可变区可变区恒定区恒定区键间二硫键键间二硫键轻链轻链重链重链C C端端CDR区区识别抗原识别抗原构架区构架区第十九页，本课件共有69页2 2、抗体的基本结构、抗体的基本结构第二十页，本课件共有69页免疫抗体免疫抗体3 3、抗体的种类、抗体的种类 （1 1）根据抗体获得方式分类）根据抗体获得方式分类天然抗体天然抗体自身抗体自身抗体（2 2）根据抗体作用对象分类）根据抗体作用对象分类

16、抗菌性抗体抗菌性抗体抗毒性抗体抗毒性抗体抗病毒性抗体抗病毒性抗体过敏性抗体过敏性抗体动物患传染病后或经人工注射疫苗后产生动物先天就有的抗体，可以遗传给后代 机体对自身组织成分产生的抗体 细菌或内毒素刺激机体所产生的抗体 细菌外毒素刺激机体产生的抗体 病毒刺激机体而产生的抗体，阻止病毒侵害异种动物血清进入机体后所产生的使动物发生过敏反应的抗体 第二十一页，本课件共有69页4 4、人工制备抗体、人工制备抗体（1 1）多克隆抗体）多克隆抗体(polyclonal antibody，PoAb)定义：定义：将抗原免疫动物，刺激动物体内多个将抗原免疫动物，刺激动物体内多个B B细胞克隆产生细胞克隆产生 的

17、抗体，是针对多种抗原决定基的混合抗体。的抗体，是针对多种抗原决定基的混合抗体。特点：特点：来源广泛、制备容易，但不易大量制备；来源广泛、制备容易，但不易大量制备；特异性不高，常出现交叉反应；特异性不高，常出现交叉反应；评价：评价：应用受到限制。应用受到限制。第二十二页，本课件共有69页4 4、人工制备抗体、人工制备抗体（2 2）单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibody(monoclonal antibody，McAbMcAb)原理原理:淋巴细胞增殖分化的浆细胞淋巴细胞增殖分化的浆细胞 (来自脾脏，有抗原特异性来自脾脏，有抗原特异性,能产生抗体，但短寿能产生抗体，但短寿)骨髓

18、瘤细胞骨髓瘤细胞 (无抗原特异性，但长寿，能在体外无限繁殖无抗原特异性，但长寿，能在体外无限繁殖)利用原生质体融合技术进行细胞融合，利用原生质体融合技术进行细胞融合，获得既能在体外培养又能产生单一抗体的杂交瘤细胞。获得既能在体外培养又能产生单一抗体的杂交瘤细胞。特点：特点：纯度高、特异性强、效价高、无或少血清交叉反应，纯度高、特异性强、效价高、无或少血清交叉反应，制备成本低等特性。制备成本低等特性。已广泛用作临床诊断试剂或生化治疗剂。已广泛用作临床诊断试剂或生化治疗剂。第二十三页，本课件共有69页4 4、人工制备抗体、人工制备抗体单克隆抗体制备示意图单克隆抗体制备示意图第二十四页，本课件共有6

19、9页4 4、人工制备抗体、人工制备抗体（2 2）单克隆抗体）单克隆抗体(monoclonal antibody(monoclonal antibody，McAbMcAb)应用：应用：已广泛用作临床诊断试剂或生化治疗剂。已广泛用作临床诊断试剂或生化治疗剂。对微生物病原体的鉴定。对微生物病原体的鉴定。特异性抗原或特异性抗原或肿瘤相关蛋白质的检测和鉴定。肿瘤相关蛋白质的检测和鉴定。疾病的被动免疫治疗和生物导向药物的制备。疾病的被动免疫治疗和生物导向药物的制备。检测血液中的药物含量。检测血液中的药物含量。分离某些昂贵的生物活性物质。分离某些昂贵的生物活性物质。第二十六页，本课件共有69页4 4、人工制

20、备抗体、人工制备抗体（3 3）基因工程抗体）基因工程抗体（重组抗体）重组抗体）在基因水平上对在基因水平上对IgIg分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成的新型抗体分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成的新型抗体分子。分子。特点：特点：保留天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少保留天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少 了无关结构，并可赋予抗体分子以新的生物学活性。了无关结构，并可赋予抗体分子以新的生物学活性。迄今已成功构建多种基因工程抗体，如人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(ScFv)、双特异性抗体(BsAb)及噬菌体抗体等。第二十七页，本课件共有69页一一.抗原与抗体反应的一般规

21、律抗原与抗体反应的一般规律抗原抗体反应：抗原抗体反应：抗原与相应抗体之间在体内或体外所发生的抗原与相应抗体之间在体内或体外所发生的 特异性结合反应。特异性结合反应。体内反应体内反应：介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；：介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应体外反应：根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的：根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的 介质不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体结介质不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体结 合反应及中和反应等各种不同的反应类型。合反应及中和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多用血清作因抗体主要存在于血

22、清中，在抗原或抗体的检测中多用血清作试验，故体外抗原抗体反应亦称为试验，故体外抗原抗体反应亦称为血清学反应。血清学反应。第四节第四节 免疫学方法及其应用免疫学方法及其应用第二十八页，本课件共有69页抗原抗体反应的一般特点抗原抗体反应的一般特点1.1.特异性与交叉性特异性与交叉性 特异性：一种抗原只能与它相应的抗体结合。特异性：一种抗原只能与它相应的抗体结合。交叉性：两种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、交叉性：两种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗体间构型部分相同，就可出现交叉反应。抗体间构型部分相同，就可出现交叉反应。2.2.可逆性可逆性 抗体与抗原的结合是分子表面的一种物

23、理结合即非共价键的结抗体与抗原的结合是分子表面的一种物理结合即非共价键的结合，在一定条件下可以发生解离。分开后，二者的性质不变。合，在一定条件下可以发生解离。分开后，二者的性质不变。3.3.定比性定比性 抗原物质是多价的；抗体是双价的。抗原物质是多价的；抗体是双价的。抗抗原原抗抗体体的的结结合合是是抗抗原原抗抗体体抗抗原原抗抗体体这这样样顺顺次次结结合合，只只有有当两者比例合适时，聚集成较大的复合物才能出现可见反应。当两者比例合适时，聚集成较大的复合物才能出现可见反应。第二十九页，本课件共有69页抗原抗体反应的一般特点抗原抗体反应的一般特点3.3.定比性定比性图图7-4 7-4 沉淀反应的沉淀

24、反应的曲线每一个每一个Y Y字形的字形的IgIg单体单体分子能结合分子能结合2 2个抗原表个抗原表位，称之为两价；位，称之为两价；分分泌型泌型IgAIgA为为4 4价；五聚价；五聚体体IgMIgM理论上为理论上为1010价，价，但由于立体构型但由于立体构型 的空的空间阻位，一般只能结间阻位，一般只能结合合5 5个抗原表位。个抗原表位。第三十页，本课件共有69页抗原抗体反应的一般特点抗原抗体反应的一般特点4.4.阶段性阶段性 第一阶段：发生特异性反应，特点是反应快，不被肉眼所见。第一阶段：发生特异性反应，特点是反应快，不被肉眼所见。第二阶段：可见阶段，是非特异性的。反应较慢，受到电解第二阶段：可

25、见阶段，是非特异性的。反应较慢，受到电解 质、质、pHpH值和温度的影响。值和温度的影响。5.5.敏感性敏感性 高度的敏感性，用于定性，还可用于定量和定位。高度的敏感性，用于定性，还可用于定量和定位。第三十一页，本课件共有69页影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的因素1.1.电解质电解质4.4.杂质异物杂质异物0.850.85的的NaClNaCl生理盐水生理盐水2.2.温度温度 37 37水浴水浴3.pH3.pH值值多数血清学反应的适宜多数血清学反应的适宜pHpH值为值为6 68 8第三十二页，本课件共有69页二、抗原二、抗原、抗体间的主要反应抗体间的主要反应1 1、凝集反应、凝集反应2

26、2、沉淀反应、沉淀反应3 3、免疫电泳、免疫电泳4 4、补体结合实验、补体结合实验 第三十三页，本课件共有69页三、主要抗原抗体反应三、主要抗原抗体反应(一一)、凝集反应、凝集反应 定义：定义：颗粒性抗原与相应的抗体在有电解质合适条件下反应颗粒性抗原与相应的抗体在有电解质合适条件下反应 并出现肉眼可见的凝集团现象。（并出现肉眼可见的凝集团现象。（凝集原，凝集素）一般稀释抗体一般稀释抗体(抗血清抗血清)，使其与抗原有一合适比例。，使其与抗原有一合适比例。1 1 直接凝集反应直接凝集反应 玻片法玻片法 定性试验。用已知抗体检测未知抗原。定性试验。用已知抗体检测未知抗原。用途：鉴定菌种，菌种分型，测

27、定ABO血型等。试管法试管法 定量试验。用已知抗原测定血清中抗体有无及相对含量定量试验。用已知抗原测定血清中抗体有无及相对含量 发生明显凝集现象的最高血清稀释度（抗体效价，滴度发生明显凝集现象的最高血清稀释度（抗体效价，滴度 )，以表示血清中抗体的相对含量。，以表示血清中抗体的相对含量。用途：测定患传染病的人或家畜血清中的抗体，诊断第三十四页，本课件共有69页三、主要抗原抗体反应三、主要抗原抗体反应2.2.间接凝集反应间接凝集反应定义：定义：利用某些与免疫无关的均一的小颗粒物质作为载体，利用某些与免疫无关的均一的小颗粒物质作为载体，将可溶性抗原将可溶性抗原(或抗体或抗体)吸附于表面，如与相应的

28、抗体吸附于表面，如与相应的抗体 (或抗原或抗原)结合，在有电解质存在的适宜条件下，发生结合，在有电解质存在的适宜条件下，发生 凝集现象。凝集现象。表面吸附抗原表面吸附抗原(或抗体或抗体)的载体微球称为免疫微球。的载体微球称为免疫微球。特点：特点：增大体积，敏感，可检测极微量抗原。增大体积，敏感，可检测极微量抗原。根据所用载体不同，常用的间接凝集反应有间接血球凝集反根据所用载体不同，常用的间接凝集反应有间接血球凝集反应，碳凝集反应，乳胶凝集反应等。还有间接凝集抑制反应，应，碳凝集反应，乳胶凝集反应等。还有间接凝集抑制反应，第三十五页，本课件共有69页第三十六页，本课件共有69页三、主要抗原抗体反

29、应三、主要抗原抗体反应(二二)、沉淀反应、沉淀反应 定义：定义：可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在条可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在条 件下，形成肉眼可见的沉淀物。（件下，形成肉眼可见的沉淀物。（沉淀原，沉淀素）凝集反应与沉淀反应的区别：凝集反应与沉淀反应的区别：凝集反应的抗原是颗粒性抗原，总表面积小，做抗体稀释。凝集反应的抗原是颗粒性抗原，总表面积小，做抗体稀释。沉淀反应的抗原是可溶性的胶体溶液，单位面积抗原多，需沉淀反应的抗原是可溶性的胶体溶液，单位面积抗原多，需 抗体量多，抗原稀释。抗体量多，抗原稀释。以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价

30、。类型：类型：环状法、絮状法和琼脂扩散法（单向和双向）。环状法、絮状法和琼脂扩散法（单向和双向）。第三十七页，本课件共有69页三、主要抗原抗体反应三、主要抗原抗体反应图图7-5 7-5 琼脂双向扩散的几种不同方式结果示意图琼脂双向扩散的几种不同方式结果示意图第三十八页，本课件共有69页 3 3、免疫电泳、免疫电泳 将琼脂扩散和电泳技术相结合的血清学检验方法。将琼脂扩散和电泳技术相结合的血清学检验方法。特点：特点：特异性强、很高的灵敏性和分辨力。特异性强、很高的灵敏性和分辨力。用途：用途：分析抗原或抗体纯度。分析抗原或抗体纯度。类型：类型：对流免疫电泳、火箭电泳、双向免疫电泳、琼脂免疫对流免疫电

31、泳、火箭电泳、双向免疫电泳、琼脂免疫 电泳。电泳。（1 1）对流免疫电泳）对流免疫电泳 这是一种将双向扩散与电泳技术结合而成的方法。这是一种将双向扩散与电泳技术结合而成的方法。原理：原理：抗原与抗体分别置于凝胶板电场负、正极附近的小孔抗原与抗体分别置于凝胶板电场负、正极附近的小孔 中，通电后，抗原向正极移动，而抗体则向负极移动中，通电后，抗原向正极移动，而抗体则向负极移动 ，结果在两孔间合适的抗原、抗体浓度处会形成一条，结果在两孔间合适的抗原、抗体浓度处会形成一条 沉淀线。沉淀线。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲种胎儿蛋白(AFP)等的检测。第三十九页，本课件共有69页3 3、免疫电泳、免疫

32、电泳（2 2）火箭免疫电泳）火箭免疫电泳定义：定义：抗原在含定量抗抗原在含定量抗体的琼脂中向一个方向体的琼脂中向一个方向泳动，两者比例合适时泳动，两者比例合适时，在较短时间内生成如，在较短时间内生成如火箭状或锥状的沉淀火箭状或锥状的沉淀线。线。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。图图7-6 7-6 火箭电泳结果示意图火箭电泳结果示意图第四十页，本课件共有69页（3 3）双向免疫电泳）双向免疫电泳这是一种将火箭电泳与血清免疫电泳相结合的方法这是一种将火箭电泳与血清免疫电泳相结合的方法定义：定义：先将血清用电泳分离出各成分，然后切下凝胶板

33、转移先将血清用电泳分离出各成分，然后切下凝胶板转移 至另一已加有抗血清的凝胶上，进入垂直方向的第二至另一已加有抗血清的凝胶上，进入垂直方向的第二 次电泳，形成呈连续火箭样的沉淀线。次电泳，形成呈连续火箭样的沉淀线。图图7-7 7-7 双向免疫电泳示意图双向免疫电泳示意图 第四十一页，本课件共有69页3 3、免疫电泳、免疫电泳（4 4）琼脂免疫电泳）琼脂免疫电泳先进行琼脂平板电泳再做双向琼脂先进行琼脂平板电泳再做双向琼脂扩散的血清学检验技术。扩散的血清学检验技术。定定义义：先先将将抗抗原原样样品品在在琼琼脂脂凝凝胶胶中中电电泳泳，不不同同抗抗原原成成分分因因其其迁迁移移率率的的不不同同而而分分离

34、离成成区区带带，挖挖一一条条平平行行的的抗抗体体槽槽，加加入入抗抗血血清清做做双双向向扩扩散散，在在两两者者比比例例适合处形成可见的弧形沉淀线。适合处形成可见的弧形沉淀线。根根据据沉沉淀淀线线的的数数量量、位位置置和和形形状状，即即可分析样品中所含的抗原成分和含量。可分析样品中所含的抗原成分和含量。琼脂免疫电泳示意图第四十二页，本课件共有69页(三三)、补体结合实验、补体结合实验定义：定义：有补体参与，并以绵羊红血球和溶血素有补体参与，并以绵羊红血球和溶血素(红细胞的红细胞的 特异抗体特异抗体)是否发生溶血反应作指示的一种高灵敏是否发生溶血反应作指示的一种高灵敏 度的抗原与抗体结合反应。度的抗

35、原与抗体结合反应。原理：原理：补体没有特异性，可与任何抗原抗体复合物发生结补体没有特异性，可与任何抗原抗体复合物发生结 合合(即不能与单独的抗原或抗体结合即不能与单独的抗原或抗体结合)，一旦结合后，一旦结合后 并不再游离，但不能显示肉眼可见现象。并不再游离，但不能显示肉眼可见现象。通常应用通常应用溶血系统作为指示剂溶血系统作为指示剂，以判定补体是否已被抗原抗，以判定补体是否已被抗原抗体复合物结合。游离补体，就会出现肉眼可见的溶血反应。体复合物结合。游离补体，就会出现肉眼可见的溶血反应。补体结合试验补体结合试验有抗原、抗体、补体、红血球、溶血素有抗原、抗体、补体、红血球、溶血素5 5种种成分参加

36、，并分属于反应系统和指示系统。成分参加，并分属于反应系统和指示系统。第四十三页，本课件共有69页4 4、补体结合实验、补体结合实验 图图7-9 7-9 补体结合实验示意图补体结合实验示意图 第四十四页，本课件共有69页4 4、补体结合实验、补体结合实验（1 1）反应系统）反应系统(试验系统、结合系统试验系统、结合系统)由已知抗原由已知抗原(或抗体或抗体)、被检抗体、被检抗体(或抗原或抗原)和补体组成。和补体组成。先加入抗原、抗体，再加入补体，混合后作用一定时间。先加入抗原、抗体，再加入补体，混合后作用一定时间。如果抗原和抗体相对应，形成抗原抗体复合物，则补体就被如果抗原和抗体相对应，形成抗原抗

37、体复合物，则补体就被结合，否则即为游离状态。结合，否则即为游离状态。（2 2）指示系统）指示系统(溶血系统溶血系统)由红血球由红血球(抗原抗原)和溶血素和溶血素(抗体抗体)组成。组成。在反应系统完毕后，再向试管内加入绵羊红血球和溶血素。在反应系统完毕后，再向试管内加入绵羊红血球和溶血素。不发生溶血：不发生溶血：补体被抗原抗体复合物结合，阳性反应。补体被抗原抗体复合物结合，阳性反应。发生溶血：发生溶血：液体中的抗原抗体不相对应，没有发生结合，液体中的抗原抗体不相对应，没有发生结合，补体依然游离存在，反应阴性。补体依然游离存在，反应阴性。第四十五页，本课件共有69页三、免疫标记技术三、免疫标记技术

38、现代免疫学技术包括免疫标记技术、免疫定位分析、免疫亲现代免疫学技术包括免疫标记技术、免疫定位分析、免疫亲和层析和免疫生物传感器技术等，其中尤以免疫标记技术发和层析和免疫生物传感器技术等，其中尤以免疫标记技术发展最快，应用最广。展最快，应用最广。免疫标记技术免疫标记技术：将某些小分子物质作为标记剂（如荧光素、：将某些小分子物质作为标记剂（如荧光素、酶、放射性同位素或电子致密物质等）结合到抗原或抗体上酶、放射性同位素或电子致密物质等）结合到抗原或抗体上，不，不 抗原抗体反应，更容易观察，提高检测的灵敏度。抗原抗体反应，更容易观察，提高检测的灵敏度。标记剂：与抗原或抗体结合的小分子物质。标记剂：与抗

39、原或抗体结合的小分子物质。优点：优点：特异性强，灵敏度高，应用范围广，反应速度快，容特异性强，灵敏度高，应用范围广，反应速度快，容 易观察；易观察；既可用于定性、定量分析，又可用于分子定位等工作既可用于定性、定量分析，又可用于分子定位等工作 第四十六页，本课件共有69页现代免疫技术现代免疫技术免疫标记技术免疫标记技术1 1、免疫荧光技术、免疫荧光技术2 2、免疫酶技术、免疫酶技术3 3、放射免疫测定法、放射免疫测定法4 4、免疫电镜技术、免疫电镜技术第四十七页，本课件共有69页定义：定义：一种将结合有荧光素的荧光抗体与抗原反应，以提高一种将结合有荧光素的荧光抗体与抗原反应，以提高 免疫反应灵敏

40、度和适合显微镜观察的免疫标记技术。免疫反应灵敏度和适合显微镜观察的免疫标记技术。荧光素浓度在荧光素浓度在1010-8-8时，仍可受激发而射出肉眼可见的荧光。时，仍可受激发而射出肉眼可见的荧光。原理：原理：在一定条件下以化学方法将荧光素与抗体结合，制成在一定条件下以化学方法将荧光素与抗体结合，制成 荧光素抗体，但不影响抗体的免疫活性。如果标本中荧光素抗体，但不影响抗体的免疫活性。如果标本中 的抗原与荧光素抗体结合着染后，在荧光显微镜下成的抗原与荧光素抗体结合着染后，在荧光显微镜下成 为发出荧光的可见物体，即可达到检出抗原的目的。为发出荧光的可见物体，即可达到检出抗原的目的。常用的荧光素有异硫氰酸

41、荧光素常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)(FITC)和罗丹明和罗丹明(RB200)(RB200)，在蓝紫光激发下，分别发出鲜明的绿色荧光和橙黄色荧光。在蓝紫光激发下，分别发出鲜明的绿色荧光和橙黄色荧光。基本方法：基本方法：直接法，间接法、补体结合法和标记法。直接法，间接法、补体结合法和标记法。(一一)、免疫荧光技术、免疫荧光技术（荧光抗体法）荧光抗体法）第四十八页，本课件共有69页(一一)、免疫荧光技术、免疫荧光技术（荧光抗体法）（荧光抗体法）（1 1）直接法）直接法（2 2）间接法）间接法（3 3）补体结合法）补体结合法（4 4）标记法）标记法图图7-10 7-10 免疫荧光抗体法原理

42、示意图免疫荧光抗体法原理示意图第四十九页，本课件共有69页直接免疫荧光法直接免疫荧光法第五十页，本课件共有69页间接接免疫荧光法间接接免疫荧光法第五十一页，本课件共有69页 免疫荧光技术基础上发展起来的血清学检验方法。免疫荧光技术基础上发展起来的血清学检验方法。一种酶作标记的抗体或抗抗体的一种酶作标记的抗体或抗抗体的高灵敏度高灵敏度的免疫标记技术。的免疫标记技术。原理：原理：利用酶与抗原或抗体结合后，既不改变抗原或抗体的利用酶与抗原或抗体结合后，既不改变抗原或抗体的 疫学反应特异性，也不影响酶本身的活性，在特异抗疫学反应特异性，也不影响酶本身的活性，在特异抗 原抗体反应后，于相应而合适的酶底物

43、作用下，产生原抗体反应后，于相应而合适的酶底物作用下，产生 可见的不溶性可见的不溶性有色产物有色产物。与免疫荧光技术区别：与免疫荧光技术区别：有色的沉淀物可在光学显微镜下进行细胞水平的抗原追踪，有色的沉淀物可在光学显微镜下进行细胞水平的抗原追踪，也可在电子显微镜下进行分子水平的观察，又能用分光光度也可在电子显微镜下进行分子水平的观察，又能用分光光度计定量测定酶作用底物分解的量。计定量测定酶作用底物分解的量。(二二)、免疫酶技术、免疫酶技术（酶免疫测定技术）（酶免疫测定技术）目前常用辣根过氧化物酶目前常用辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)，也有用碱性磷酸酶标记抗体，也有用碱性磷酸酶标记抗体第五十

44、二页，本课件共有69页(二二)、免疫酶技术、免疫酶技术（酶免疫测定技术）（酶免疫测定技术）1.1.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbant assay，ELISAELISA，酶标法，酶标法)ELISA ELISA 是目前应用最广泛的生物学技术之一。是目前应用最广泛的生物学技术之一。原理：原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持免疫活性。使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标 抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。抗原或抗体既

45、保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISAELISA试验中需要有试验中需要有3 3种试剂：种试剂：固相的抗原或抗体。固相的抗原或抗体。目前多用聚苯乙烯酶标板目前多用聚苯乙烯酶标板(微量滴定板微量滴定板)作为固相载体作为固相载体酶标记的抗原或抗体。酶标记的抗原或抗体。酶作用的底物。酶作用的底物。第五十三页，本课件共有69页抗原捕获抗原捕获ELISAELISA第五十四页，本课件共有69页第五十六页，本课件共有69页ELISA for HIV antibodyMicroplate ELISA for HIV antibody:coloured wells indicate reactivity第五十

46、七页，本课件共有69页(二二)、免疫酶技术、免疫酶技术（酶免疫测定技术）（酶免疫测定技术）1.1.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法优点：优点：灵敏度高，特异性强。灵敏度高，特异性强。酶标抗体制备容易，且高度稳定而有效期长。酶标抗体制备容易，且高度稳定而有效期长。操作简便操作简便应用范围广泛。应用范围广泛。ELISA技术用于检测多种病原菌抗原或抗体、血液及其 他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。在食品加工领域，ELISA技术可用于测定蛋白质，也可 用于测定各种生物活性成分，如异黄酮半抗原。在食品安全方面，用于检测食品中农药残留，以及检测食品中的病原菌及其毒素，如沙门氏菌及其内毒素和肠毒素、大肠杆菌及其

47、肠毒素和肠细胞出血毒素、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、霉菌和真菌毒素。第五十八页，本课件共有69页1.1.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法ELISAELISA方法：方法：将可溶性抗体或抗原吸附到聚苯乙烯等固相载体将可溶性抗体或抗原吸附到聚苯乙烯等固相载体 上，再滴加酶标记的抗原或抗体，然后添加底物上，再滴加酶标记的抗原或抗体，然后添加底物 ，进行免疫酶反应，以酶标仪测定。，进行免疫酶反应，以酶标仪测定。双抗体夹心法双抗体夹心法 本法用于检测抗原。本法用于检测抗原。图图7-11 7-11 双抗体夹心法测抗原示意图双抗体夹心法测抗原示意图标本（含标本（含抗体）抗体）酶标酶标抗体抗体底物底物固相抗体固相抗体

48、第五十九页，本课件共有69页1.1.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法间接法间接法 图图7-11 7-11 间接法测抗原示意图间接法测抗原示意图标本标本（含抗体）（含抗体）酶标酶标抗体抗体底物底物固相抗原固相抗原第六十页，本课件共有69页1.1.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法斑点酶免疫吸附法斑点酶免疫吸附法 (dot-ELISA)(dot-ELISA)本法原理与上述两法相同，方法上的不同之处是：本法原理与上述两法相同，方法上的不同之处是：A A 用硝酸纤维薄膜取代上述微量滴定板；用硝酸纤维薄膜取代上述微量滴定板；B B 最终显色反应是不溶于水的有色沉淀物，最终显色反应是不溶于水的有色沉淀物，例如，碱性

49、磷酸酶的底物不能用对硝基酚磷酸盐，而要用氮蓝四唑(NBT)等。最终可从薄膜上沉淀物颜色的有无或多少确定结果。优点：优点：灵敏度高灵敏度高(比普通比普通ELISAELISA高高1010100100倍倍)，与放射免疫测定相当。，与放射免疫测定相当。第六十一页，本课件共有69页1.1.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法生物素生物素-亲和素系统（亲和素系统（BAS)BAS)在在ELISAELISA中的应用中的应用 亲亲和和素素是是存存在在于于蛋蛋清清中中的的碱碱性性糖糖蛋蛋白白，一一个个亲亲和和素素分分子子由由4 4个个亚亚基组成，可与基组成，可与4 4个生物素分子稳定结合；个生物素分子稳定结合；生生物物素

50、素是是存存在在于于蛋蛋黄黄中中的的维维生生素素H H，化化学学方方法法制制成成的的生生物物素素衍衍生生物物生生物物素素-羟羟基基琥琥珀珀亚亚胺胺酯酯(BNHS)(BNHS)可可与与蛋蛋白白质质性性质质的的抗抗原原、抗抗体体、酶酶、荧荧光光素、核苷酸等结合形成生物素化的分子。素、核苷酸等结合形成生物素化的分子。生生物物素素与与亲亲和和素素结结合合具具有有高高度度亲亲和和力力，且且均均能能耦耦联联抗抗体体、抗抗原原和和辣辣根根过氧化物酶而不影响其生物学活性。过氧化物酶而不影响其生物学活性。第六十二页，本课件共有69页1.1.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法生物素生物素-亲和素系统（亲和素系统（BAS)