电镜样品的制备培训课件.ppt
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1、电镜样品的制备取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检一、取材一、取材即:获取观察材料获取观察材料。遵循五字原则:遵循五字原则:准、轻、小、净、浓准、轻、小、净、浓1.迅速准确:迅速准确:取材动作要快,部位要准确。取材动作要快,部位要准确。方法方法:因材料而异,通过破碎、解剖、切割、:因材料而异,通过破碎、解剖、切割、分离、提纯等手段,获取样品分离、提纯等手段,获取样品最佳观察面最佳观察面。2.动作轻巧:保护好拟观察面动作轻巧:保护好拟观察面。解剖器械要锋利,不能对材料施加锯、挤、拉压解剖器械要锋利,不能对材料施加锯、挤、拉压的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷冻断裂法。的外力。含水分多的、幼嫩材料最好
2、冷冻断裂法。3.厚度小厚度小:满足观察条件的最小体积,厚度为满足观察条件的最小体积,厚度为12毫米毫米4.纯净防混杂纯净防混杂:花粉、孢子类样品注意防尘、防混杂花粉、孢子类样品注意防尘、防混杂5.悬浮液样品要求悬浮液样品要求合适的浓度合适的浓度:浓度太大造成样品堆积;浓度小则检出困难。浓度太大造成样品堆积;浓度小则检出困难。囱渝销萨巷泪锋血沂医闸医寓一涯厅邱勋涵潞叫妆试铡增檄塞血守虚纯称第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检二清洗:确保得到二清洗:确保得到清洁清洁的的观察表面观察表面1.完整的制样程序中有完整的制样程序中有三次清洗三次清洗固定前清洗:洗去表面的
3、灰尘、黏液等附着物,固定前清洗:洗去表面的灰尘、黏液等附着物,确保确保获得清洁的观察表面获得清洁的观察表面。前固定后清洗:洗净醛类固定液,以免戊二醛与锇酸前固定后清洗:洗净醛类固定液,以免戊二醛与锇酸 反应而反应而削弱削弱锇酸的固定效果锇酸的固定效果。脱水前的清洗:洗净固定液,以免固定液与脱水剂脱水前的清洗:洗净固定液,以免固定液与脱水剂 反应而反应而产生沉淀产生沉淀,影响观察效果。,影响观察效果。词忱枣唁重灼班擅仇均秦拒版箩尖丁镭驳仑嘲钵钉灼颤仗烁织醒程及化亢第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备2.清洗液的类型与选择:蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等清洗液的类型与选择:蒸馏水、生理盐水、加
4、酶清洗液等 选择原则选择原则:清洗液的:清洗液的pH值值、渗透压渗透压、温度温度应该尽量接应该尽量接近样品的近样品的生理值生理值,以免样品因环境突变而导致形态变化,以免样品因环境突变而导致形态变化。植物材料:蒸馏水洗净尘埃;植物材料:蒸馏水洗净尘埃;动物材料:动物材料:等渗等渗生理盐水、生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等;碳酸钠或缓冲液洗去黏液等;游离细胞:用游离细胞:用等渗等渗的缓冲液清洗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物精子、血细胞、微生物);覆盖大量黏液的样品覆盖大量黏液的样品(胃黏膜胃黏膜)用低浓度的蛋白水解酶溶液洗;用低浓度的蛋白水解酶溶液洗;组织培养细胞:用相应的培养液清洗;组
5、织培养细胞:用相应的培养液清洗;特殊样品:如乳腺组织富含蛋白质和脂类,分别用特殊样品:如乳腺组织富含蛋白质和脂类,分别用16%的的 甘油和甘油和20%乙醇浸泡清洗;乙醇浸泡清洗;表面附着蜡质、角质层的样品:用有机溶剂脱蜡。表面附着蜡质、角质层的样品:用有机溶剂脱蜡。选择方法:选择方法:取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检庄酶仅刃滨昨瑟汪刺竟歼础独顺夹晓鸥核趟逊虾辱坷羌渠给绘咕参除骨芬第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检3.清洗方法清洗方法:不同材料采用不同方法,灵活应用不同材料采用不同方法,灵活应用(1)植物材料:根部用水冲洗去泥土,植株用水冲洗或滴洗。)植物材
6、料:根部用水冲洗去泥土,植株用水冲洗或滴洗。观察观察气孔状态气孔状态时应注意清洗后时应注意清洗后取材时机取材时机。(2)较干净的样品:)较干净的样品:固定后固定后20倍体积的清洗液轻摇,换液三次倍体积的清洗液轻摇,换液三次。(3)表面附着大量黏液的样品:振荡法或喷射瓶壁加压冲洗)表面附着大量黏液的样品:振荡法或喷射瓶壁加压冲洗。(4)游离细胞、微生物:离心法清洗。)游离细胞、微生物:离心法清洗。(5)超声波清洗:用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品)超声波清洗:用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品。样品置清洗液中,超声波清洗器内清洗,必须样品置清洗液中,超声波清洗器内清洗,必须控制功率控制功率
7、(6)灌流清洗:观察管腔内壁结构的样品,避免血液、)灌流清洗:观察管腔内壁结构的样品,避免血液、组织液凝聚而影响观察效果。组织液凝聚而影响观察效果。通过动脉注入清洗液,直到排出液变清为止。必须通过动脉注入清洗液,直到排出液变清为止。必须控制压力控制压力清洗液与样品混合摇匀清洗液与样品混合摇匀 低速离心(反复三次)低速离心(反复三次)例吧热韵痛乙量守释婉镑惫险谍壶喻术取垒疽懦溺缓抽绣渺涝合甄丧击疙第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检1.单固定:只用一种固定剂(通常戊二醛)固定的方法。单固定:只用一种固定剂(通常戊二醛)固定的方法。2.熏蒸固定:固体培养基上培养
8、的菌丝类样品,熏蒸固定:固体培养基上培养的菌丝类样品,用锇酸(或甲醛)用锇酸(或甲醛)蒸汽蒸汽熏蒸固定熏蒸固定0.51小时小时。3.双固定双固定:戊二醛戊二醛(13h)锇酸锇酸(0.51h)4.冷冻固定:液氮冷冻固定:液氮超低温快速冷冻超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。可保存样品的生活状态。5.不固定:干种子、花粉、孢子类、毛发类样品。不固定:干种子、花粉、孢子类、毛发类样品。四、脱水四、脱水:梯度系列脱水法。梯度系列脱水法。注意:根据材料性质和大小而调节脱水时间。注意:根据材料性质和大小而调节脱水时间。三、固定方法三、固定方法践矣宿罚吹碱澜盅妹酚璃默涩策拙观轴懒涝帛仆坛股驰檄器袜扛羚又茄遍
9、第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检五、干燥:五、干燥:指除去样品中的残存液体(水或脱水剂),指除去样品中的残存液体(水或脱水剂),使样品中不含液态物质的过程使样品中不含液态物质的过程。原因原因:液态物质脱离样品表面时必须克服表面张力,液态物质脱离样品表面时必须克服表面张力,其反作用力会使样品表面结构产生形变其反作用力会使样品表面结构产生形变。1.自然干燥法:自然干燥法:样品中的水分或脱水剂在大气中样品中的水分或脱水剂在大气中自然蒸发自然蒸发使样品干燥。使样品干燥。适宜样品适宜样品:花粉、孢子、种子、果壳、木质纤维、骨骼;:花粉、孢子、种子、果壳、木质纤维、
10、骨骼;游离细胞类在脱水剂中自然干燥较好游离细胞类在脱水剂中自然干燥较好。特点特点:经济便捷:经济便捷。2.真空干燥法真空干燥法:含水分或脱水剂样品置于真空干燥器内,含水分或脱水剂样品置于真空干燥器内,抽低真空使液态物质挥发,使样品干燥。抽低真空使液态物质挥发,使样品干燥。特点特点:干燥速度快,效果与自然干燥法相近。干燥速度快,效果与自然干燥法相近。3.冷冻干燥法冷冻干燥法:超低温快速冷冻超低温快速冷冻取材取材固定固定脱水脱水制冷剂制冷剂真空升华真空升华粘样粘样液氮、丙烷液氮、丙烷邹唁盂带饥做揪哟笔域尉蛹急赃氏扦柳冈锹童避儒巳蝇裔怒劝斑性楞淌混第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备取材清洗固定
11、脱水干燥粘样镀膜镜检样品干燥法样品干燥法4.临界点干燥法临界点干燥法(critical piont drying method CPD)(1)干燥原理干燥原理:在密闭容器中加热,使液态干燥剂在密闭容器中加热,使液态干燥剂变为气态,当气态与液态物质的密变为气态,当气态与液态物质的密度相等时,相界消失。这时液态干度相等时,相界消失。这时液态干燥剂的分子内聚力为零,此时液体燥剂的分子内聚力为零,此时液体的表面张力系数为零的表面张力系数为零(即即临界状态临界状态)。在临界状态下继续对容器加热,同在临界状态下继续对容器加热,同时以一定速度排出气体(保持临界状态),时以一定速度排出气体(保持临界状态),直
12、到排净为止。这时样品在直到排净为止。这时样品在无表面张力无表面张力影响的影响的临界状况临界状况下得以干燥。下得以干燥。使干燥剂气相与液相相等的温度称为该干燥剂的使干燥剂气相与液相相等的温度称为该干燥剂的临界温度临界温度。使干燥剂气相与液相相等的气压称为该干燥剂的使干燥剂气相与液相相等的气压称为该干燥剂的临界压强临界压强。加热器加热器CO2CO2龙氖戳柔随循睡若混宣质兰栽亭栅磷卷绘允把拆留俭诌昭丽删选诺脑茸瓦第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检临界点干燥法临界点干燥法(2)常用干燥剂与中间剂)常用干燥剂与中间剂:常用干燥剂常用干燥剂:中间剂中间剂:既可以与干燥
13、剂,又能与脱水剂相混溶的液体,既可以与干燥剂,又能与脱水剂相混溶的液体,先置换脱水剂而后又被干燥剂所置换。先置换脱水剂而后又被干燥剂所置换。常用中间剂常用中间剂:醋酸异戊脂,醋酸戊脂。醋酸异戊脂,醋酸戊脂。干燥剂:在临界点干燥器内起临界干燥作用的液体干燥剂:在临界点干燥器内起临界干燥作用的液体.液态液态CO2:,临界温度为临界温度为31.1,临界压强,临界压强72.8标准大气压。标准大气压。F12 :临界温度临界温度 28.9 ,临界压强,临界压强38.1标准大气压标准大气压。桓萧殷醉霞垣耙证千瓷扔栅趾羔蕴游撮颧川惜耪道厘啊何衷媒辩兼再始站第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备取材清洗固定脱
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