蛋白组学二维电泳(1).ppt

《蛋白组学二维电泳(1).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白组学二维电泳(1).ppt（83页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、蛋白质组学浙江大学浙江大学生命科学学院生命科学学院江江 辉辉密码：密码：shenghua蛋白质组学研究思路和技术蛋白质组学研究思路和技术二维电泳质谱技术生物信息学第二章 二维电泳与蛋白质分离n一、蛋白质的提取与样品制备一、蛋白质的提取与样品制备n二、二维等电聚焦二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n三、胶上蛋白质检测技术三、胶上蛋白质检测技术一、蛋白质的提取与样品制备一、蛋白质的提取与样品制备n从生物材料中获得所需蛋白质样品的过程从生物材料中获得所需蛋白质样品的过程n意义意义n蛋白质组分析的基础，也是研究工作第一步蛋白质组分析的基础，也是研究工作第一步n制备的完整性、

2、纯度、浓度对下面分析非常重要制备的完整性、纯度、浓度对下面分析非常重要n无完全通用技术（技术和大量经验的结合）无完全通用技术（技术和大量经验的结合）n包括分离、提取、纯化（分开、结合、省略）包括分离、提取、纯化（分开、结合、省略）n分离：生物样品提取液中的蛋白质与其它大量杂质分开分离：生物样品提取液中的蛋白质与其它大量杂质分开n提取：将已经与其它物质分开的蛋白质提取出来（如沉淀等）提取：将已经与其它物质分开的蛋白质提取出来（如沉淀等）n纯化：对提取的蛋白质进一步清除杂质成为纯度高的蛋白质样品纯化：对提取的蛋白质进一步清除杂质成为纯度高的蛋白质样品（如亲和纯化等）（如亲和纯化等）二维电泳分析中的

3、样品制备二维电泳分析中的样品制备（目标蛋白在细胞中的存在方式）（目标蛋白在细胞中的存在方式）n稳定性（热、稳定性（热、pH、蛋白酶、化学试剂等）、蛋白酶、化学试剂等）n丰度丰度n定位（膜、细胞质、细胞器等）定位（膜、细胞质、细胞器等）n溶解性（可溶、微溶、难溶、不溶）溶解性（可溶、微溶、难溶、不溶）n分离难易程度分离难易程度n制备变性、活性蛋白制备变性、活性蛋白二维电泳分析中的样品制备二维电泳分析中的样品制备制备原则制备原则：n尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质损失。尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质损失。（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。）明确研究目标，获得尽

4、可能多的感兴趣蛋白。（2）不同类型的蛋白质需要不同的方法）不同类型的蛋白质需要不同的方法（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法n应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋白）在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。白）在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。n防止在样品制备过程中发生样品降解（如酶性或化学性降解等）。防止在样品制备过程中发生样

5、品降解（如酶性或化学性降解等）。n防止发生化学修饰（加入尿素之后，加温不要超过防止发生化学修饰（加入尿素之后，加温不要超过37C，以防蛋白质氨，以防蛋白质氨甲酰化）。甲酰化）。n破坏蛋白质与其它大分子之间的相互作用，形成线性、破坏蛋白质与其它大分子之间的相互作用，形成线性、独立的肽链独立的肽链n样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80C，不要反复，不要反复冻融样品。冻融样品。n完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。通过超速离心完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。通过超速离心清除所有的杂质。清除所有的杂质。n主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、

6、主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等脂类、酚类等n尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。研究蛋白的可检测性。蛋白质制备流程蛋白质制备流程n分离、提取、纯化分离、提取、纯化n分离：组织或细胞破碎分离：组织或细胞破碎n最大程度的细胞破碎最大程度的细胞破碎n最小程度的蛋白水解或降解最小程度的蛋白水解或降解n提取：分离或沉淀蛋白质（可选择）提取：分离或沉淀蛋白质（可选择）n去除杂质（去除杂质（除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、

7、多糖、脂类、酚类等类等）n冷冻干燥、沉淀（冷冻干燥、沉淀（TCA、丙酮）等、丙酮）等n纯化：去除无关杂质（可选择）纯化：去除无关杂质（可选择）n反复提取反复提取n分级提取分级提取样品类型样品类型n整体样品整体样品：单细胞微生物、微生物混合菌等n组织样品组织样品：器官（肝脏）、植物组织（根、叶）等n细胞（细胞器）样品细胞（细胞器）样品：培养细胞、分离细胞、细胞核、线粒体等n可溶性样品可溶性样品：血清、尿液等细胞裂解的方法细胞裂解的方法n1、温和裂解的方法、温和裂解的方法:裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组织培养细胞、血细胞和微生物等。同时温和裂解方法可用

8、于一些织培养细胞、血细胞和微生物等。同时温和裂解方法可用于一些亚细胞分级产物，如线粒体、高尔基体和膜等。亚细胞分级产物，如线粒体、高尔基体和膜等。细胞破碎方法细胞破碎方法 应用对象应用对象 操作步骤操作步骤 渗透溶胞法渗透溶胞法非非常常温温和和的的裂裂解解方方法法，可可用用于于进进一一步步进行亚细胞分级。进行亚细胞分级。血血细细胞胞、组组织织培培养养细细胞胞 将将细细胞胞悬悬浮浮于于渗渗透透溶溶胞胞溶溶液液中中，细细胞胞溶溶胀胀而而释释放放出出细胞内容物细胞内容物冻融裂解冻融裂解许许多多类类型型的的细细胞胞可可以以通通过过快快速速反反复复冻冻融得到裂解。融得到裂解。细细菌菌细细胞胞、组组织织培

9、培养养细胞细胞 使使用用液液氮氮，快快速速反反复复冻冻融融至符合实验要求为止。至符合实验要求为止。裂解液裂解裂解液裂解含含去去污污剂剂的的裂裂解解液液处处理理组组织织、细细胞胞以以裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。组织培养细胞组织培养细胞将将细细胞胞直直接接置置裂裂解解液液或或样样品液中，进行悬浮处理。品液中，进行悬浮处理。酶裂解酶裂解有有细细胞胞壁壁的的细细胞胞可可以以通通过过酶酶解解去去除除细细胞壁得以温和裂解胞壁得以温和裂解植植物物细细胞胞、细细菌菌细细胞胞、真菌细胞真菌细胞 将将细细胞胞悬悬浮浮于于专专一一性性酶酶的的等渗溶液中。等渗溶液中。n2、剧烈

10、的细胞裂解方法、剧烈的细胞裂解方法:破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的细胞或有坚韧细胞壁的细胞细胞或有坚韧细胞壁的细胞细胞破碎方法细胞破碎方法 应用对象应用对象 操作步骤操作步骤 超声波处理超声波处理超超声声波波产产生生剪剪切切力力使使细细胞胞破碎破碎 悬浮细胞悬浮细胞要要进进行行间间歇歇处处理理，减减轻轻产产生生热热和和泡泡沫沫，样样品品处处理理应应在在冰冰浴浴中中进行进行 压力杯法（压力杯法（French Press）用用高高压压使使细细胞胞穿穿过过小小孔孔，产生剪切力从而撕破细胞产生剪切力从而撕破细胞 微微生生物物细细胞胞，如如细细菌菌、霉霉菌菌、酵酵母

11、母细细胞胞及及含含有有细细胞胞壁壁的的细胞细胞 将将细细胞胞悬悬浮浮液液置置于于预预冷冷的的压压力力杯杯中中，施施加加压压力力，然然后后收收集集挤挤出液出液 研磨法研磨法 固固体体组组织织细细胞胞、微微生物细胞生物细胞 组组织织或或细细胞胞预预先先用用液液氮氮冷冷冻冻，然后置瓷研钵中研磨成粉末。然后置瓷研钵中研磨成粉末。加氧化铝或砂有助于研磨加氧化铝或砂有助于研磨 机械匀浆法机械匀浆法（防防止止细细胞胞破破碎碎释释放放出出蛋蛋白酶，引起蛋白质修饰）白酶，引起蛋白质修饰）固固体体组组织织，如如心心脏脏、肝肝脏脏、肾肾脏脏组组织织和和细菌悬液细菌悬液 先先尽尽量量将将组组织织剪剪成成小小块块，然然

12、后后加加有有蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂的的冷冷匀匀浆浆液液进行匀浆，过滤或离心收集。进行匀浆，过滤或离心收集。蛋白质的分离与提取方法蛋白质的分离与提取方法n硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀n高盐溶液中，蛋白倾向聚集沉淀；但很多蛋白即使在高盐中也可溶高盐溶液中，蛋白倾向聚集沉淀；但很多蛋白即使在高盐中也可溶n搅拌情况下，缓慢滴加搅拌情况下，缓慢滴加(NH4)2SO4到饱和，离心分离蛋白到饱和，离心分离蛋白n三氯乙酸沉淀三氯乙酸沉淀n10-20即可沉淀蛋白；再溶解困难即可沉淀蛋白；再溶解困难n丙酮沉淀丙酮沉淀n常用方法常用方法n加入加入3倍以上体积丙酮，倍以上体积丙酮，-20 C沉淀沉淀2h以上，以上，离心分离

13、蛋白离心分离蛋白n三氯乙酸丙酮沉淀三氯乙酸丙酮沉淀n同时加入三氯乙酸和丙酮，同时加入三氯乙酸和丙酮，-20 C沉淀，沉淀，离心分离蛋白；再溶解困离心分离蛋白；再溶解困难难n苯酚提取甲醇中乙酸铵沉淀苯酚提取甲醇中乙酸铵沉淀n饱和酚提取蛋白，甲醇中用饱和酚提取蛋白，甲醇中用NH4Ac沉淀蛋白，依次用沉淀蛋白，依次用NH4Ac和丙酮和丙酮洗涤沉淀洗涤沉淀裂解液的组成裂解液的组成n目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样品的完全目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样品的完全溶解和变性溶解和变性n组成：组成：nIPG缓冲液（缓冲液（IPG buffer）：）：Tris等n离液剂（离液剂（Cha

14、otropic Agents）：硫脲和尿素 n去污剂（去污剂（Detergents）：）：SDS、TritonX-100、NP-40、CHAPS等n还原剂（还原剂（Reducing Agents）：）：-巯基乙醇、DTT或TDF（二硫赤藓糖）和三丁基膦(TBP)等n两性电解质（两性电解质（Carrier ampholytes）n蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂（protease inhibitors）：）：PMSF等离液剂（离液剂（Chaotropic Agents）n尿尿素素是是最最常常用用的的离离液液剂剂，2mol/L硫硫脲脲和和5-8mol/L尿尿素素联联合合使使用用（硫脲在水中的溶解性很差）

15、（硫脲在水中的溶解性很差）n原理：原理：nNH2-CO-NH2,NH2-CS-NH2 n改改变变或或破破坏坏氢氢键键等等次次级级键键的的结结构构，使使得得蛋蛋白白质质变变性性并并使使蛋蛋白白酶失活酶失活n破破坏坏了了疏疏水水键键（防防止止了了聚聚集集作作用用和和二二级级结结构构的的形形成成，聚聚集集作作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性）用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性）n硫硫脲脲和和尿尿素素联联合合使使用用，可可以以大大大大增增加加蛋蛋白白质质的的溶溶解解性性，特特别别是是膜蛋白的溶解性膜蛋白的溶解性 n使用注意点：使用注意点：样品离心前在室温下至少保持样品离心前在室温下至少保持1

16、小时，使完全变性和溶解；样小时，使完全变性和溶解；样品含尿素不可加热，防蛋白修饰；样品类型不同，选择裂解液品含尿素不可加热，防蛋白修饰；样品类型不同，选择裂解液的组成也不同的组成也不同去污剂（去污剂（Detergents）n破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。电聚焦时析出。n类型：类型：n离子型：离子型：SDS等等n非离子型：非离子型：TritonX-100、NP-40等等n兼性离子型：兼性离子型：CHAPS(3-(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio-1-pr

17、opane sulfonate)、ASB-14(Amidosulfobetaine 14)等等n使用注意：使用注意：n原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂如蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等不利于等电聚焦。电聚焦。nSDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处理的质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处

18、理的初级阶段。初级阶段。nCHAPS比其他去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更好，然而在高比其他去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更好，然而在高浓度脲中的溶解度比较低浓度脲中的溶解度比较低还原剂（还原剂（Reducing Agents）n断裂蛋白质分子中断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。性。n常用的还原剂有常用的还原剂有-巯基乙醇、巯基乙醇、DTT或或TDF（二硫赤藓糖）和三丁（二硫赤藓糖）和三丁基膦基膦(TBP)等。等。nDTT是使用比较广泛的还原剂。是使用比较广泛的还原剂。50mmol/L时能有效地还原大时能有效地还原大部分的

19、二硫键部分的二硫键 n使用注意点：使用注意点：nDTT的的pKa在在8左右，如果过分提高左右，如果过分提高DTT的浓度会影响到的浓度会影响到pH梯梯度。度。nDTT在碱性在碱性pH值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发生迁移，使得阴极的发生迁移，使得阴极的DTT损耗而不足。导致二硫键复原，蛋损耗而不足。导致二硫键复原，蛋白质沉淀。白质沉淀。n非离子型还原剂非离子型还原剂TBP则比则比DTT更加有效，能大大增加蛋白质的更加有效，能大大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。两性电解质（两性电解

20、质（Carrier ampholytes）n防止蛋白质过早沉淀在它们的等电点附近，促进防止蛋白质过早沉淀在它们的等电点附近，促进蛋白质的溶解。在第一向等电聚焦时，提高极性蛋白质的溶解。在第一向等电聚焦时，提高极性端蛋白质的聚焦效果。端蛋白质的聚焦效果。n吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子。吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子。n离心时还有助于核酸的沉淀。离心时还有助于核酸的沉淀。n阻止样品蛋白质和阻止样品蛋白质和IPG 胶条中固相化的两性电解胶条中固相化的两性电解质相互作用。质相互作用。两性电解质对蛋白溶解性和两性电解质对蛋白溶解性和2-DE分辨率的影响分辨率的影响 pI 3.5 pI

21、9.5 pI 3.5 pI 9.5A：0.5两性电解质 B：2.0两性电解质 蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温、防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温、pH9的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加酶抑制剂（以下一种或数种的混合物）酶抑制剂（以下一种或数种的混合物）（1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度：苯甲磺酰氟，工作浓度1M，能不可逆灭活，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。（2）AEBSF：可在

22、水溶液中使用，工作浓度：可在水溶液中使用，工作浓度4M，能不可，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的等电点。等电点。（3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作浓度为浓度为1M，作用对象为金属蛋白酶。，作用对象为金属蛋白酶。（4）肽蛋白酶抑制剂：价格贵，本身会出现二维电泳图）肽蛋白酶抑制剂：价格贵，本身会出现二维电泳图中。中。亮抑酶肽：在亮抑酶肽：在DDT中可逆抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。中可逆抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂A：

23、作用对象为天冬氨酸蛋白酶。：作用对象为天冬氨酸蛋白酶。抑蛋白酶抑蛋白酶A肽：作用对象为丝氨酸蛋白酶。肽：作用对象为丝氨酸蛋白酶。苯丁抑制素：作用对象为氨基蛋白酶。苯丁抑制素：作用对象为氨基蛋白酶。（5）TLCK、TPCK：甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、甲苯磺：甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、甲苯磺酰苯氨酰氯甲酮的工作浓度为酰苯氨酰氯甲酮的工作浓度为0.1-0.15mM，能不可逆灭活丝，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。清除影响二维电泳图谱的杂质清除影响二维电泳图谱的杂质（1）盐、残留的缓冲液和电性小分子）盐、残留的缓冲液和电性小分子盐盐等等带带电电物物质质会会干干扰扰电电泳泳

24、过过程程、增增大大溶溶液液电电导导率率，通通常常用用透透析析、凝凝胶过滤、沉淀胶过滤、沉淀/重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。（2）内源性小分子）内源性小分子这这些些物物质质通通常常带带负负电电，使使阳阳极极侧侧的的聚聚焦焦不不全全，可可采采用用丙丙酮酮/TCA沉沉淀淀去除。去除。（3）离子去污剂）离子去污剂SDS等等离离子子去去污污剂剂，易易和和多多肽肽形形成成复复合合物物而而干干扰扰IEF，-200C的的丙丙酮酮溶液可除去。溶液可除去。（4）核酸）核酸核核酸酸增增加加样样品品黏黏度度，导导致致二二维维电电泳泳背背景景发发散散；能能与与蛋蛋白白质质结结合合，阻阻

25、碍碍聚聚焦焦；银银 染染 时时 出出 现现 高高 背背 景景。加加 0.1V的的 核核 酸酸 酶酶 溶溶 液液(1mg/ml DNAase+0.25 mg/ml RNAase+50mM MgCl2)冰上孵育，但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。冰上孵育，但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。（5）多糖）多糖多多糖糖能能阻阻碍碍凝凝胶胶孔孔径径、与与蛋蛋白白质质形形成成复复合合物物、延延长长聚聚焦焦时时间间、可可能能出出现现水水平条纹，可用平条纹，可用(NH4)2SO4或苯酚或苯酚-NH4Ac沉淀后离心，或用超速离心去多糖。沉淀后离心，或用超速离心去多糖。（6）脂类）脂类脂脂类类易易和和膜膜蛋蛋白白结

26、结合合成成复复合合物物，改改变变蛋蛋白白溶溶解解性性、等等电电点点和和分分子子量量，采采用用大量去污剂可除去。大量去污剂可除去。（7）酚类）酚类通通常常出出现现在在植植物物组组织织中中，通通过过氧氧化化反反应应修修饰饰蛋蛋白白质质，可可加加还还原原剂剂抑抑制制氧氧化化，也可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。也可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。蛋白质的分级提取蛋白质的分级提取n在在2-DE胶中所能显示出的蛋白质的数量，依赖于细胞中蛋白胶中所能显示出的蛋白质的数量，依赖于细胞中蛋白质的拷贝数、蛋白质的溶解性、蛋白质的上样量及电泳后染质的拷贝数、蛋白质的溶解性、蛋白质的上样量及电泳后染

27、色方法的灵敏度。色方法的灵敏度。n为了能够富集低拷贝蛋白质，采用了样品预分级的方法，如为了能够富集低拷贝蛋白质，采用了样品预分级的方法，如亚细胞分级、亲和分级、蛋白质复合物分级和根据蛋白质溶亚细胞分级、亲和分级、蛋白质复合物分级和根据蛋白质溶解性的顺序提取法等。解性的顺序提取法等。n应用双向凝胶电泳分离手段，一步提取法一般只能获得应用双向凝胶电泳分离手段，一步提取法一般只能获得1000-2000个不同的蛋白质点；而使用分级顺序提取方法，个不同的蛋白质点；而使用分级顺序提取方法，对不同组分进行分离，据报道能够获得上万个不同的蛋白质对不同组分进行分离，据报道能够获得上万个不同的蛋白质点。点。n主要

28、分步提取策略：主要分步提取策略：n蛋白质溶解度蛋白质溶解度n蛋白质细胞定位蛋白质细胞定位n蛋白质亲和力蛋白质亲和力 分步提取法（溶解性差异）分步提取法（溶解性差异）1998年年 Molley提出结合高效裂解液分步溶解的技术路线提出结合高效裂解液分步溶解的技术路线:1、水溶液提取，溶解亲水性蛋白质、水溶液提取，溶解亲水性蛋白质 5-15mg细胞细胞+2ml裂解液裂解液I（40mM Tris）反复冻融反复冻融3-4循环循环加适量加适量DNase I和和 RNase A震荡混均、离心收震荡混均、离心收集上清（沉淀留下一步）集上清（沉淀留下一步）、冷冻干燥，得提取物、冷冻干燥，得提取物I。2、含、含U

29、rea/CHAPS/DTT溶液的提取，溶解亲水性、中性和疏溶液的提取，溶解亲水性、中性和疏水性蛋白水性蛋白 第一步沉淀物第一步沉淀物+50l 裂解液裂解液II剧烈震荡混均，离心收集剧烈震荡混均，离心收集上清（沉淀留下一步），得提取物上清（沉淀留下一步），得提取物II。裂解液裂解液II：8 M Urea(解聚剂)、4%CHAPS(表面活性剂)、100mM DTT(还原剂)、40mM Tris、0.5%Pharmalyte3-10、20 g/ml DNase I、5 g/ml RNase A3、含硫脲、含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取，溶解疏水性蛋白溶液的提取，溶解疏水性蛋白 第二步沉淀物第

30、二步沉淀物40mM Tris清洗清洗200l 裂解液裂解液III 溶解溶解剧烈震荡混均，离心收集上清，保存于剧烈震荡混均，离心收集上清，保存于-70。裂解液裂解液III：5 M Urea、2 M Thiourea(解聚剂)、2%CHAPS、2%SB3-10(表面活性剂)、2mM TBP(还原剂)、40mM Tris、0.5%Pharmalyte3-10、20 g/ml DNase I、5 g/ml RNase A。对大部分细胞提取，第一步与第二步往往出现相同的图对大部分细胞提取，第一步与第二步往往出现相同的图谱，最后一步因膜蛋白提取出来而完全不同。若先将细胞器谱，最后一步因膜蛋白提取出来而完全

31、不同。若先将细胞器分级提取，再联合上述方法，效果将更好。分级提取，再联合上述方法，效果将更好。ReadyPrep Sequential Extraction Kit（BioRad公司）SAMPLEResidue 1Solution 1，50mlTris,pH 9.5SupernatantResidue 2Solution 2，10mlUrea/CHAPS/TrisBio-Lyte/TBPResidue 3Solution 3，10mlUrea/thiourea/CHAPS/SB3-10 Tris/Bio-Lyte/TBP4080%1249%58%1%6%SupernatantSupernata

32、nt亚细胞器蛋白质的提取亚细胞器蛋白质的提取1 1、细胞中亚细胞器的分离、细胞中亚细胞器的分离 据据亚细胞器亚细胞器的大小、形状、密度的差异，利用差速离的大小、形状、密度的差异，利用差速离心和密度梯度离心进行分离。细胞破碎后，先低速离心心和密度梯度离心进行分离。细胞破碎后，先低速离心从胞质溶液中分离出细胞核和未破碎的细胞，得到上清从胞质溶液中分离出细胞核和未破碎的细胞，得到上清溶液；随后对上清溶液进行密度梯度分离，得到线粒体、溶液；随后对上清溶液进行密度梯度分离，得到线粒体、溶酶体等亚细胞器；然后对亚细胞内的蛋白质进行分离溶酶体等亚细胞器；然后对亚细胞内的蛋白质进行分离提取。提取。差速离心差速

33、离心n在密度均一的介质中不同颗粒大小的物质在不在密度均一的介质中不同颗粒大小的物质在不同的离心力作用下沉降而分离同的离心力作用下沉降而分离n不同细胞器有不同的大小和沉降特性不同细胞器有不同的大小和沉降特性不同细胞器的大小和沉降特性不同细胞器的大小和沉降特性差速离心差速离心n差速离心形成的沉淀（肝脏）差速离心形成的沉淀（肝脏）密度梯度离心密度梯度离心n用一定的介质在离心管中形成连续或不连续的用一定的介质在离心管中形成连续或不连续的梯度，通过一定的离心力的作用使得细胞器进梯度，通过一定的离心力的作用使得细胞器进行分层分离。行分层分离。1.速度沉降：密度相近但大小不等速度沉降：密度相近但大小不等2.

34、等密度沉降平衡：密度不等的物质等密度沉降平衡：密度不等的物质1、速度沉降、速度沉降n生物颗粒在一定的密度梯度介质中按照生物颗粒在一定的密度梯度介质中按照各自的沉降系数（各自的沉降系数（S）以不同的速度沉降。）以不同的速度沉降。n必须在沉降最快的生物颗粒到达管底前停止必须在沉降最快的生物颗粒到达管底前停止沉降，并将各部分收集沉降，并将各部分收集n通常在密度较低的介质中进行，一般不需要通常在密度较低的介质中进行，一般不需要高速离心高速离心n牛血清、牛血清、Ficoll（聚蔗糖）、白蛋白等（聚蔗糖）、白蛋白等2、等密度沉降平衡、等密度沉降平衡n生物颗粒的在连续或不连续梯度的介质中经足生物颗粒的在连续

35、或不连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间沉降到与其自身密度够大离心力和足够长时间沉降到与其自身密度相等的介质处，并停留在该处达到平衡，从而相等的介质处，并停留在该处达到平衡，从而将不同密度的生物颗粒分离。将不同密度的生物颗粒分离。n介质密度较高，介质的最高密度大于分离组介质密度较高，介质的最高密度大于分离组分的最大密度，密度具有一定的陡度分的最大密度，密度具有一定的陡度n离心力比较大，离心时间长离心力比较大，离心时间长nFicoll、Percoll（细胞分离液（细胞分离液）、）、Metrizamide（甲泛葡胺（甲泛葡胺）等）等纯纯化化不不同同细细胞胞器器所所推推荐的梯度和离心条件荐的梯

36、度和离心条件 缩写：缩写：(NUC)细胞核；细胞核；(PMS)大片细胞膜；大片细胞膜；(MTT)线粒体；线粒体；(LYS)溶酶体；溶酶体；(PER)过氧化物酶体；过氧化物酶体；(PMV)细胞细胞膜小泡；膜小泡；(SER)滑面内质网；滑面内质网；(RER)粗面内质网；粗面内质网；(END)核内体；核内体；(SARCRT)肌质网；肌质网；(NUCMB)核膜；核膜；(OUTER MITMB)线粒体外膜；线粒体外膜；(INNER MITMB)线粒体内膜；线粒体内膜；(HOM)匀浆物；匀浆物；(dc)非连续；非连续；(c)连续。连续。特殊细胞器的提取特殊细胞器的提取1、膜蛋白的提取、膜蛋白的提取（1）膜

37、蛋白的定义：与膜相关的蛋白，如脂）膜蛋白的定义：与膜相关的蛋白，如脂双分子层嵌入蛋白，也叫跨膜蛋白。膜蛋白占双分子层嵌入蛋白，也叫跨膜蛋白。膜蛋白占细胞总蛋白约细胞总蛋白约30%，在细胞生命活动中起重要，在细胞生命活动中起重要作用（如信号蛋白、黏附蛋白、载体蛋白），作用（如信号蛋白、黏附蛋白、载体蛋白），许多膜蛋白是药物作用靶标。许多膜蛋白是药物作用靶标。（2）膜蛋白提取注意点）膜蛋白提取注意点A、膜蛋白的纯度、膜蛋白的纯度与膜粘连的细胞器可能部分分离出来造成假性，故用与膜粘连的细胞器可能部分分离出来造成假性，故用KBr溶液或用溶液或用更多的离液剂进行清洗，可去掉与膜作用不强的非膜蛋白，从而富

38、集膜更多的离液剂进行清洗，可去掉与膜作用不强的非膜蛋白，从而富集膜蛋白。另外膜蛋白通常位于两相去污系统中相对较丰富的一相。蛋白。另外膜蛋白通常位于两相去污系统中相对较丰富的一相。B、膜蛋白的特性、膜蛋白的特性低丰度、大多偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中。低丰度、大多偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中。C、为了从二维电泳凝胶图谱中分离出膜蛋白，首先必须服从三个条件、为了从二维电泳凝胶图谱中分离出膜蛋白，首先必须服从三个条件a、必须保证膜的脂类环境，同时要避免过多的脂对、必须保证膜的脂类环境，同时要避免过多的脂对IEF的干扰。的干扰。b、必须以一种可溶的形式（通常是去污剂、必须以一种可溶的形式（

39、通常是去污剂-蛋白复合物）从膜中分蛋白复合物）从膜中分离出来。离出来。c、所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中（特别在等电点附近）、所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中（特别在等电点附近）保持可溶状态。保持可溶状态。新的去污剂、对疏水蛋白强溶解的裂解液使膜蛋白提取进一步完善，新的去污剂、对疏水蛋白强溶解的裂解液使膜蛋白提取进一步完善，毫克级上样量的二维电泳设备提高了分离的可靠性。毫克级上样量的二维电泳设备提高了分离的可靠性。2、核蛋白的提取、核蛋白的提取（1）核基质的提取）核基质的提取 A、核基质定义：非染色体结构蛋白及细胞核径向高盐离子、核基质定义：非染色体结构蛋白及细胞核径向高盐离子、核酸酶、

40、去污剂抽提所剩的核蛋白网上结构，包括核纤维蛋核酸酶、去污剂抽提所剩的核蛋白网上结构，包括核纤维蛋白、低丰度核蛋白、核内核糖核蛋白及白、低丰度核蛋白、核内核糖核蛋白及DNA结合区。结合区。B、提取步骤：、提取步骤：细胞核在含细胞核在含0.5%Triton100和和1.2mM蛋白抑制剂的缓蛋白抑制剂的缓冲溶液中匀浆数分钟冲溶液中匀浆数分钟 离心去脂类和可溶性蛋白离心去脂类和可溶性蛋白 取取沉淀沉淀,与提取液与提取液4反应反应15min 离心除可溶性骨架蛋白离心除可溶性骨架蛋白取沉淀在消化液内室温消化取沉淀在消化液内室温消化30min 离心得核基质蛋白离心得核基质蛋白和中间丝和中间丝 再溶于含再溶于

41、含8M尿素的裂解液中尿素的裂解液中 透析除尿素透析除尿素 离心得上清夜即为细胞核基质蛋白。离心得上清夜即为细胞核基质蛋白。提取液：100mM KCl+3mM MgCl2+0.5%TritonX-100+12mM PMSF 消化液：50mM NaCl+3mM MgCl2+100g/ml DNase I+100g/ml RNase A。（2）核膜蛋白的提取）核膜蛋白的提取A、提取方法：核膜蛋白包括膜整合蛋白和多蛋白复合物，、提取方法：核膜蛋白包括膜整合蛋白和多蛋白复合物，不能用去污剂提取，通常用分级制备法得到：细胞核用冰TP缓冲溶液匀浆4下搅拌90min、离心（1000g）30min 取沉淀用ST

42、M0.25 缓冲溶液重悬即得核膜蛋白提取液。B、进一步分级提取：、进一步分级提取：核膜蛋白提取液+TritonX-100（终浓度0.5%）或 NaCl（终浓度1M）或 Urea（终浓度4M）4震荡15min 13000rpm离心可得TX抗性蛋白及NaCl洗脱蛋白 50000rpm离心可得离液剂抗性物质 C、常用溶液、常用溶液 TP缓冲溶液：10mM Tris-HCl pH7.4+10mM NaH2PO4+1mM PMSF+10 g/ml aprotinin+10g/ml leupeptin+250 g/ml heparin+1mM Na3VO4+10mM NaF+400U Benzon ucl

43、ease STM0.25 缓冲溶液:20mM Tris-HCl pH7.4+0.25M Sucrose+5mM MgSO4+1mM Na3VO4+1mM PMSF+g/ml aprotinin+10g/ml leupeptin第二章 二维电泳与蛋白质分离n一、蛋白质的提取与样品制备一、蛋白质的提取与样品制备n二、二维等电聚焦二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳维等电聚焦电泳维等电聚焦电泳n三、胶上蛋白质检测技术三、胶上蛋白质检测技术电泳的概念电泳的概念n带电颗粒在一定的介质中，在电场的作用下，向着带电颗粒在一定的介质中，在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象

44、。与其电性相反的电极移动的现象。n影响电泳速度的主要因素：影响电泳速度的主要因素：n电场强度（电场强度（E）：）：E越高，电泳速度越快越高，电泳速度越快n溶液的溶液的pH值：值：pI和和pH相差越多，带电越多，电泳速度越相差越多，带电越多，电泳速度越快快n溶液的离子强度（溶液的离子强度（I）：）：I越高，样品电流越小，电泳速度越高，样品电流越小，电泳速度越慢；越慢；I过低，可导致过低，可导致pH局部变化影响电泳速度局部变化影响电泳速度n电渗：电渗：介质局部电离导致的样品电泳速度改变介质局部电离导致的样品电泳速度改变n焦耳热（焦耳热（Q）：）：热量高，促使溶液挥发；同时使得电流降热量高，促使溶液

45、挥发；同时使得电流降低导致电泳速度减慢低导致电泳速度减慢生物实验室常用电泳生物实验室常用电泳n支持物分类支持物分类n滤纸及纤维膜等：玻璃纤维、醋酸纤维等滤纸及纤维膜等：玻璃纤维、醋酸纤维等n凝胶：凝胶：琼脂（琼脂（agarose）、聚丙烯酰胺凝胶（）、聚丙烯酰胺凝胶（PAG）等等n装置分类装置分类n平板式平板式n垂直板式垂直板式n圆盘式圆盘式npH连续性分类连续性分类n连续连续pHn非连续非连续pH：如等电聚焦电泳：如等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）n聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶（polyacry

46、lamide gel,PAG）由由单单体体丙丙烯烯酰酰胺胺（acrylamide，Acr）和和交交联联剂剂N，N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺（N，N-methylenebisacrylamide,Bis）聚合而成。）聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对对pH和温度变化较稳定；和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要几乎无吸附和电渗作用，只要

47、Acr纯度高，操作条件一致，则纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨

48、率。的分辨率。二维电泳的基本原理二维电泳的基本原理n据蛋白质的两个一级属性等电点和相对分子据蛋白质的两个一级属性等电点和相对分子量的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按量的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按等电点高低进行等电聚焦分离（等电点高低进行等电聚焦分离（IEF），在第），在第二方向按照分子量大小进行二方向按照分子量大小进行SDS-PAGE分离分离（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）n1st dimension:Isoelectric focusing(charge)n2nd dimension:SDS-PAGE(size)二维电泳结果二维电泳结果n二

49、维电泳分离后的蛋白质经染色（考马氏亮蓝染、二维电泳分离后的蛋白质经染色（考马氏亮蓝染、银染、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图银染、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图象标志扫描存档，最后显现的是二维排列的象标志扫描存档，最后显现的是二维排列的“满天满天星星”，每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质，每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质相对分子量、等电点和相对丰度三方面的数据。相对分子量、等电点和相对丰度三方面的数据。n传统的二维电泳最好条件下传统的二维电泳最好条件下20cm 20cm的胶理论的胶理论上可分辨上可分辨10,000个蛋白点（各个方向个蛋白点（各个方向100点），实际点），

50、实际上只能上只能3000个点个点.n二维电泳得到的实验结果并非功能蛋白，事实上由二维电泳得到的实验结果并非功能蛋白，事实上由于样品处理过程中涉及亚基间的二硫键还原和烷基于样品处理过程中涉及亚基间的二硫键还原和烷基化处理，即蛋白质的高级结构已被消除，最终得到化处理，即蛋白质的高级结构已被消除，最终得到的是蛋白质的亚基。的是蛋白质的亚基。一维等电聚焦（一维等电聚焦（IEF）n蛋白质等电点蛋白质等电点pI是由其内氨基酸组成决定的特是由其内氨基酸组成决定的特性物化常数。当介质性物化常数。当介质pH高于其等电位置时，蛋高于其等电位置时，蛋白质带负电，反之带正电；此时外加一个电场，白质带负电，反之带正电；