色谱分析法概论 (2).ppt

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1、第十七章第十七章 色谱分析法概论色谱分析法概论 chromatography分析化学教研室分析化学教研室 李发美教授李发美教授1 色谱法的分类和发展色谱过程和基本原理基本类型色谱方法及其分离机制色谱法基本理论23高分离效能、高灵敏度、高选择性、分析速度快、应用范围广色谱法的特点:4色谱学的重要作用诺贝尔化学奖：1948年，瑞典Tiselins，电泳 和 吸 附 分 析；1952年，英 国 马 丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。应用的科学领域：生命科学、材料科学、环境科学等。（科学的科学）药学（药物分析）：各国药典收载了许多色谱分析方法。中国药典二部，700多，纯度检查、定性鉴别

2、或含量测定，一部，600多鉴别或含量测定。5第一节 色谱法的分类和发展一、色谱法的分类按流动相的分子聚集状态分类:GC、LC、SFC等按固定相的分子聚集状态分类:GSC、GLC、LSC、LLC等按操作形式分类:柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等按色谱过程的分离机制分类:分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法、毛细管电泳法等6毛细管电色谱法毛细管电色谱法（CEC）色色谱谱法法GSC液相色谱液相色谱法法 （LC）柱色柱色谱法谱法平面色平面色谱法谱法毛细管电泳法毛细管电泳法（CE）LLCLSCSECIECBPC纸色纸色谱法谱法薄层色薄层色谱谱法法（TLC）LLCLLCLSC气相气相

3、色谱色谱法法（GC）柱色柱色谱法谱法GLC超临界流体色超临界流体色谱谱法法 （SFC）7二、色谱法的发展（一）色谱法的历史（二）色谱法的现状和发展趋势1新型固定相和检测器的研制2色谱新方法的研究 3色谱联用技术 4色谱专家系统8第二节 色谱过程和基本原理一、色谱过程实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationary phase)和流动相(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。910色谱过程组分的结构和性质微小差异与固定相作用差异随流动相移动的速度不等差速迁移色谱分离。1112二、色谱流出曲线和有关概念色谱流出曲线是由检测

4、器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。基线是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器(主要是检测器)的噪音随时间的变化。色谱峰是流出曲线上的突起部分。正常色谱峰、拖尾峰和前延峰13对称因子对称因子f fs s(symmetry factor)：衡量色谱峰的对称性 14到20页到19页15保留时间(retentiontime;tR)：从进样到某组分 在柱后出现浓度极大时的时间间隔。死时间(t0)：分配系数为零的组分，即不被固 定相吸附或溶解的组分的保留时间。调整保留时间()：某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的组分在柱中多停留的时间。定性参数

5、116定性参数2 保留体积(VR)：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。死体积(V0)：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。固定相颗粒间间隙、导管的容积、检测器内腔容积的总和。17定性参数3调整保留体积(adjusted retention volume;)：由保留体积扣除死体积后的体积 相对保留值(r)：两组分的调整保留值之比注意：VR是定值，tR与FC成反比18定量参数峰高(peakheight；h)：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。峰面积(peakarea；A)：色谱曲线与基线间包围的面积。返回19柱效参数标准差(s

6、tandarddeviation；)：正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即0.607倍峰高处的峰宽之半。的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。越大，组分越分散；反之越集中。半峰宽(W1/2)：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.355峰宽(peakwidth；W)：色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。W=4或W=1.699W1/2返回20总分离效能指标分离度分离度(resolution；R)：又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。21分离度分离度设正常峰，W1W2=4，则R=1.5时，99.7%面积(tR3)被分开，tR=6，称6分离。22三、分配系数与色谱分离(一

7、)分配系数和容量因子分配系数(distributioncoefficient；K)是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(C)之比。分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。是组分的特征常数。23容量因子(capacityfactor；k)：在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。（摩尔数？）又称为质量分配系数或分配比。分配系数与色谱分离还与固定相和流动相的体积有关。容量因子与分配系数的关系24tR=t0(1+k)tR=t0(1+K )分配系数与色谱分离（二）分配系数和容量因子与保留时间的关系v=L/

8、tRu=L/t025（三）色谱分离的前提KAKB 或kAkB是色谱分离的前提。=t0(1+KA)=t0(1+KB)tR=t0(KAKB)tR0KAKBkAkB分配系数与色谱分离推导过程：26第三节基本类型色谱方法及其分离机制分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法27一、分配色谱法28分配色谱法分离原理 利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质(种类与极性)有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。29分配色谱法固定相又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体；化学键合相（通

9、过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。流动相气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。30分配色谱法洗脱顺序由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。31二、吸附色谱法分离原理利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。吸附过程是试样中组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程。3233吸附系数与吸

10、附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。34吸附色谱法固定相多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。硅胶表面硅醇基为吸附中心。经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅胶和堆积硅珠。气相色谱：高分子多孔微球等35吸附色谱法流动相有机溶剂（硅胶为吸附剂）洗脱能力：主要由其极性决定。强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。36表17-1一些溶剂在硅胶上的o值溶剂溶剂强度（o）溶剂溶剂强度（o）正戊烷0.00甲基特丁基醚0.48正己烷0.00醋酸乙酯0.

11、48氯仿0.26乙腈0.52二氯甲烷0.40异丙醇0.60乙醚0.43甲醇0.7037吸附色谱法洗脱顺序ka=KaSa/Vm在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。38以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。基本母核相同，引入的取代基极性越强，则分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强(但要考虑其他因素的影响)。不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸附力越强。分子中取代基的空间排列 39三、离子交换色谱法分离原理利用被分离组分

12、离子交换能力的 差别而实现分离。分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。阳离子交换：阴离子交换：离子交换通式：交换再生+3RNR+OH-ClRNR+3ClOH交换再生+RSO H+Na+Na+33HRSO40四、空间排阻色谱法分离原理根据被分离组分分子的线团尺寸 进行分离。也称为分子排阻色谱法。4142空间排阻色谱法根据空间排阻（stericexclusion）理论，孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：渗透系数：Kp=Xs/Xm（0Kp1）由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。43空间排阻色谱法固定相多孔凝胶：软

13、质、半软质和硬质 主要性能参数平均孔径排斥极限（Kp=0）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量 分子量范围：排斥极限（Kp=0）与全渗透点（Kp=1）之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。44空间排阻色谱法流动相 要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱gelfiltrationchromatography；GFC)；非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相(凝胶渗透色谱gelpermeationchromatography；GPC)。45空间排阻色谱法保留体积与渗透系数的关系VmV0分子线团尺寸（分子

14、量）大的组分，其渗透系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱。46小结色谱过程方程式：分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp，Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。47第四节第四节 色谱法基本理论色谱法基本理论 48要使要使R R大，必须：大，必须：1 1、t tR R大大-k k大大-热力学热力学2 2、W W小小-峰展宽小峰展宽小-动力学动力学49色谱理论包括两方面色谱理论包括两方面:热力学理论热力学理

15、论：研究分配：研究分配(分离分离)过过程，塔板理论（程，塔板理论（plate theory）。）。动力学理论动力学理论：研究各种动力学因：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论素对峰展宽的影响，速率理论（rate theory）。）。50一、塔板理论一、塔板理论 始于马丁（始于马丁（Martin）和辛格（和辛格（Synge）提提出的塔板模型。出的塔板模型。分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。点不同而分离。色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。按分配系数不同而分离。51塔板理论假定：塔板理论

16、假定：在色谱柱内每一在色谱柱内每一“塔板塔板”H内，组分内，组分在两相间瞬间达到分配平衡。在两相间瞬间达到分配平衡。流动相间歇式进入色谱柱，每次进流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。入一个塔板体积。分配系数在各塔板内是常数。分配系数在各塔板内是常数。纵向扩散可以忽略。纵向扩散可以忽略。52（一）质量分配和转移（一）质量分配和转移 1、单一组分、单一组分B（kB=0.5）的分配和转移的分配和转移 设色谱柱的塔板数设色谱柱的塔板数n=5，即，即r=0、1、2、3、4（或（或n-1）号。号。将单位质量的将单位质量的B加到第加到第0号塔板上。号塔板上。分配平衡后，分配平衡后，0号塔板内号塔板

17、内ms/mm 0.333/0.667。进入一个塔板体积的流动相（一次转进入一个塔板体积的流动相（一次转移）移），5354经过经过N次转移后，质量分布符合二项式次转移后，质量分布符合二项式(ms+mm)N的展开式。的展开式。如如N=3，展开式为：展开式为：(0.333+0.667)3=0.037+0.222+0.444+0.296 0 1 2 3号号在在固定相和流动相中的质量分布由固定相和流动相中的质量分布由k(K)决定决定55转移转移N次后，第次后，第r号塔板中的质量号塔板中的质量Nmr：56例例：转转移移3次次后后，在在第第2号号塔塔板板内内的的溶溶 质分数质分数57 组组分分B(B(k k

18、B B=0.5)=0.5)在在n n=5=5的色谱柱内及出口的分布的色谱柱内及出口的分布 N r 0 1 2 3 4 N r 0 1 2 3 4 柱出口柱出口 0 1 0 0 0 0 00 1 0 0 0 0 0 1 0.333 0.667 0 0 0 0 1 0.333 0.667 0 0 0 0 2 0.111 0.444 0.445 0 0 0 2 0.111 0.444 0.445 0 0 0 3 0.037 0.222 0.444 0.296 0 0 3 0.037 0.222 0.444 0.296 0 0 4 0.012 0.099 0.269 0.395 4 0.012 0.0

19、99 0.269 0.395 0.1980.198 0 0 5 5 0.004 0.041 0.164 0.329 0.329 0.004 0.041 0.164 0.329 0.329 0.1320.132 6 6 0.001 0.016 0.082 0.219 0.329 0.001 0.016 0.082 0.219 0.329 0.2190.219 7 7 0 0.006 0.038 0.128 0.256 0 0.006 0.038 0.128 0.256 0.2190.219 8 0 0.002 0.017 0.068 0.170 0.170 8 0 0.002 0.017 0.0

20、68 0.170 0.170 9 0 0 0.007 0.033 0.102 0.114 9 0 0 0.007 0.033 0.102 0.114 10 0 0 0.002 0.016 0.056 0.068 10 0 0 0.002 0.016 0.056 0.06858注意：注意：1、柱出口处的质量分数的计算。、柱出口处的质量分数的计算。2、质量（浓度）最大点的、质量（浓度）最大点的N，即保留体即保留体积。积。592、两组分的分离、两组分的分离A(kA=1)和和B(kB=0.5)两组分两组分60 组分组分A(A(k kA A=1)=1)在在n n=5=5的色谱柱内和出口的分布的色谱柱内和

21、出口的分布 N r 0 1 2 3 4 N r 0 1 2 3 4 柱出口柱出口 0 1 0 0 0 0 00 1 0 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 2 0.25 0.5 0.25 0 0 0 2 0.25 0.5 0.25 0 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.125 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.125 0 0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 5 5 0.032 0.157 0.313 0.

22、313 0.157 0.032 0.157 0.313 0.313 0.157 0.0320.032 6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 8 8 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0.1370.137 9 9 0.002 0.018 0.072

23、0.166 0.247 0.002 0.018 0.072 0.166 0.247 0.1370.137 10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124 10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124 61结果：结果：组组分分B:k=0.5,当当N=6和和7时时，柱柱出出口口产产生生B的浓度最大点。的浓度最大点。组分组分A：k=1，N=8和和9时，柱出口处达到时，柱出口处达到浓度最大点。浓度最大点。两组分开始分离，两组分开始分离，k小的组分小的组分B在柱后在柱后先出现浓度极大值先出现浓度极大值,即先即先出柱。出柱。62一根色谱柱一根色

24、谱柱n=103以上，以上，组分有微小的分配组分有微小的分配系数系数(容量因子容量因子)差别即可实现完全分离差别即可实现完全分离。分配系数分配系数(容量因子容量因子)不等是分离的前提不等是分离的前提。63(二二)流出曲线方程流出曲线方程1 1、二项式分布曲线、二项式分布曲线以组分以组分A A在柱出口处的质量分数对在柱出口处的质量分数对N N作图。作图。64N N 柱出口柱出口 0 00 0 1 0 1 0 2 0 2 0 3 0 3 0 4 0 4 0 5 5 0.0320.032 6 0.079 6 0.079 7 0.118 7 0.118 8 0.1378 0.137 9 0.137 9

25、0.137 10 0.124 10 0.124 k k=1=1的组分从的组分从n n=5=5色谱柱中的流出曲线图色谱柱中的流出曲线图652、色谱流出曲线、色谱流出曲线当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布曲线。曲线。66673、色谱流出曲线方程（正态分布方程）、色谱流出曲线方程（正态分布方程）描述组分流出色谱柱的浓度变化：描述组分流出色谱柱的浓度变化：为标准差，为标准差，t tR R为保留时间，为保留时间，C C为任意时间为任意时间t t时的浓度，时的浓度，C C0 0为峰面积为峰面积A A，即相当于某组分即相当于某组分的总量。的总量。68t t=t tR R

26、时，时，C有极大值：有极大值：Cmax即流出曲线的峰高即流出曲线的峰高h。一定时，一定时，峰高峰高h取决于取决于C0。C0一定时，一定时，峰高峰高h取决于取决于。69 流出曲线方程的常用形式：流出曲线方程的常用形式：不论不论ttR或或ttR时，浓度时，浓度C恒小于恒小于Cmax。C随时间随时间t向峰两侧对称下降。向峰两侧对称下降。越小，峰越锐。越小，峰越锐。是柱效的标志。是柱效的标志。70色谱峰面积色谱峰面积以以A代替代替C0，h代替代替Cmax，且，且W1/2=2.355，峰面积峰面积:A=h(2)1/2A=1.065W1/2h 色谱定量的参数色谱定量的参数71(三三)理论塔板高度和理论塔板

27、数理论塔板高度和理论塔板数(heightequivalenttoatheoreticalplate或plateheight,H)(platenumber,n)是色谱柱效参数。是色谱柱效参数。72理理论论塔塔板板数数与与标标准准差差（峰峰宽宽或或半半峰峰宽宽）和和保留时间的关系：保留时间的关系：73理论塔板高度理论塔板高度H=L/n 注意：注意：1、计算、计算n时使标准差（峰宽或半峰宽）时使标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间和保留时间单位一致单位一致 2、n的单位的单位74有效理论塔板数和有效理论塔板高度有效理论塔板数和有效理论塔板高度Hef=L/nef75小结小结塔板理论解释了流出曲线的形状塔板

28、理论解释了流出曲线的形状说明了组分的分配和分离过程说明了组分的分配和分离过程提出了评价柱效的指标提出了评价柱效的指标但某些假设与实际色谱过程不符但某些假设与实际色谱过程不符 76二、速率理论二、速率理论塔板塔板理论的不足：理论的不足：组分在两相中不可能真正达到分配平衡；组分在两相中不可能真正达到分配平衡；组分在色谱柱中的纵向扩散不能忽略组分在色谱柱中的纵向扩散不能忽略;没有考虑各种动力学因素对传质过程的没有考虑各种动力学因素对传质过程的影响；影响；无法解释柱效与流动相流速的关系；无法解释柱效与流动相流速的关系；不能说明影响柱效有哪些主要因素。不能说明影响柱效有哪些主要因素。77速率理论速率理论

29、19561956年，荷兰学者范第姆特年，荷兰学者范第姆特(Van(Van DeemterDeemter)提提出了色谱过程动力学理论出了色谱过程动力学理论速率理论。速率理论。塔板高度涡流扩散项纵向扩散项传质阻抗项H =A +B/u +Cu78涡流扩散涡流扩散(eddy diffusion)(eddy diffusion)也称为多径扩散也称为多径扩散速率理论速率理论(一一)影响影响H H的动力学因数的动力学因数7980涡流扩散涡流扩散 原因：柱填充不均匀原因：柱填充不均匀A A=2=2 d dp p速率理论速率理论(一一)影响影响H H 的动力学因数的动力学因数A A：涡流扩散系数，其单位为涡流扩

30、散系数，其单位为cmcm。：填充不规则因子，填充不规则因子，填充技术和填料颗粒形填充技术和填料颗粒形状决定。状决定。d dp p：填料填料 (固定相固定相)颗粒的平均直径，颗粒的平均直径，d dp p小，小，A A小；但小；但d dp p 太小，太小，和柱阻和柱阻大。大。81纵向扩散纵向扩散(longitudinal diffusion)(longitudinal diffusion)速率理论速率理论(一一)影响影响H H 的动力学因数的动力学因数组分向组分向“塞子塞子”前后扩散，使前后扩散，使区带展宽。区带展宽。原因：原因：浓度差浓度差82纵向扩散项纵向扩散项 B B/u u影响因素：影响因

31、素：u u，B B=2=2 D Dm mB B：纵向扩散系数，其单位为纵向扩散系数，其单位为cmcm2 2/s/s，：弯曲因子，反映固定相颗粒对分子扩散弯曲因子，反映固定相颗粒对分子扩散的阻碍。的阻碍。D Dm m：组分在组分在流动相流动相中的扩散系数。中的扩散系数。速率理论速率理论(一一)影响影响H H 的动力学因数的动力学因数83传质阻抗传质阻抗(mass transfer(mass transfer resistance)resistance)速率理论速率理论(一一)影响影响H H 的动力学因数的动力学因数传质：溶解、扩散、转移的过程。传质：溶解、扩散、转移的过程。传质阻抗：影响传质过程

32、的阻力。传质阻抗：影响传质过程的阻力。结果结果：（：（非平衡状态非平衡状态），使有些分子较快），使有些分子较快向前移动，而另一些滞后，引起峰展宽。向前移动，而另一些滞后，引起峰展宽。传质阻抗系数传质阻抗系数C C，其单位其单位s s，包括包括 C Cm m、C Cs s84速率理论85速率理论速率理论（二）（二）流动相线速度对塔板高度的影响流动相线速度对塔板高度的影响 A A：不受不受u u影响影响B/uB/u：u u,H HCuCu：（C Cm m、C Cs s ）u u,H H86速率理论速率理论（二）（二）流动相线速度对塔板高度的影响流动相线速度对塔板高度的影响 总结果：总结果：u u 较低时：较低时：B/uB/u主导，主导，u u,H H,u u 较高时：较高时：CuCu主主导，导，u u,H H,u u 最佳最佳87主要内容：主要内容：色谱过程和分离原理色谱过程和分离原理基本概念和计算公式：保留值、分配系基本概念和计算公式：保留值、分配系数、容量因子、数、容量因子、n n、H H、R R色谱基本理论：塔板理论、速率理论色谱基本理论：塔板理论、速率理论基本类型色谱机制基本类型色谱机制88