基因工程的基本程序丁.ppt

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1、基因工程的概念基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达获得符合人们需要的新产品获得符合人们需要的新产品获得符合人们需要的新产品获得符合人们需要的新产品对基因进行操作的对基因进行操作的“手术刀手术刀”、“缝合缝合针针”、“运输工具运输工具”分别是什么物质分别是什么物质？有何作用？有何作用？基因工程的剪切、拼接、导基因工程的剪切、拼接、导入、表达的具体过程是怎么样入、表达的具体过程是怎么样的呢？的呢？基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目

2、的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定剪切：剪切：拼接：拼接：导入：导入：表达：表达：一、目的基因的获取一、目的基因的获取 目的基因：目的基因：主要指主要指编码蛋白质编码蛋白质的结构基因的结构基因.例如：例如：苏云金杆菌抗虫基因苏云金杆菌抗虫基因人胰岛素基因人胰岛素基因种子贮藏蛋白基因种子贮藏蛋白基因植物抗病基因植物抗病基因什么是目的基因？什么是目的基因？目的基因的来源？目的基因的来源？1 1、从自然界中已有的物种中分离、从自然界中已有的物种中分离2 2、人工方法合成、人

3、工方法合成 获取目的基因的常用方法：获取目的基因的常用方法：1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 获取目的基因的常用方法：获取目的基因的常用方法：1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是基因文库？将含有某种生物不同基因的将含有某种生物不同基因的许多许多DNA片段片段,导入受体菌的群体中导入受体菌的群体中储存储存,各个受体各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因菌分别含有这种生物的不同的基因为什么要构建基因文库？为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？直

4、接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提示：提示：提示：提示：如果如果如果如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只所需要的目的基因的序列完全不知，或只所需要的目的基因的序列完全不知，或只所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不

5、同，或者想知道一种生物在个体发育的不多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。基因文库种类基因文库种类基因组文库：基因组文库：含有某种生物的全部基因含有某种生物

6、的全部基因部分基因文库（如部分基因文库（如cDNAcDNA文库）文库）：含有某种生物的一部分基因含有某种生物的一部分基因如何构建基因组文库和部分基因文库呢？如何构建基因组文库和部分基因文库呢？限制酶限制酶限制酶限制酶基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA基因重组基因重组基因重组基因重组转化细菌转化细菌转化细菌转化细菌体外包装体外包装体外包装体外包装 1)1)1)1)基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库 基因文库基因文库基因文库基因文库提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA限制酶切割限制酶切割一定大小的一定大小的DNADNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌中导入受体

7、菌中储存储存基因组文库基因组文库2)2)2)2)部分基因文库（部分基因文库（部分基因文库（部分基因文库（cDNAcDNAcDNAcDNA文库）文库）文库）文库）基因重组基因重组基因重组基因重组反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA反转录酶反转录酶互补的单链互补的单链DNADNADNADNA聚合酶聚合酶双链双链CDNACDNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌种导入受体菌种储存储存CDNACDNA文库文库如何从基因文库中获取所需要的基因？如何从基因文库中获取所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。

8、如：根据如：根据基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质 等特性。等特性。2、利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因一段一段已知已知的目的基因序列的目的基因序列 通过通过2 2n n形式扩增获取大量的目的基因形式扩增获取大量的目的基因 DNA DNA复制（体外）复制（体外）碱基互补配对原则碱基互补配对原则 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸 PCR PCR仪仪 Taq Taq酶（耐热的酶（耐热的DNADNA聚合酶）、引物等聚合酶）、引物等目的：目的

9、：原理：原理：原则：原则：原料：原料：场所：场所：条件：条件：过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂断裂，形成，形成_b b、退火（、退火（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，）：系统温度降低，引引 物与物与DNADNA模板结合模板结合，形成局部，形成局部_。c c、延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，从的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链质粒质粒DNA

10、DNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口形成两个黏性末端形成两个黏性末端或平末端或平末端两个切口两个切口获得含有相同黏性末获得含有相同黏性末端的目的基因端的目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种二二.基因表达载体的构建基因表达载体的构建(一一)过程过程:科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没

11、有表达。棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子启动子(抗抗虫基因首端虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入因的质粒中插入终止子终止子(抗虫基因末端抗虫基因末端)，导入棉花，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资资 料料:作为基因表达载体，只需含有目的基因就可以作为基因表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？完成任务吗？为什么？基因表达载体的组基因表达载

12、体的组成：成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因复制原点复制原点阅读与思考：阅读与思考：启动子、终止子有何作用？启动子、终止子有何作用？标记基因有什么作用？标记基因有什么作用？启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了

13、它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来启动子与起始密码子？启动子与起始密码子？终止子与终止密码子？终止子与终止密码子？启动子和终止子：启动子和终止子：DNADNA上上启动子：驱动转录启动子：驱动转录终止子：终止转录终止子：终止转录起始密码子和终止密码子：起始密

14、码子和终止密码子：mRNAmRNA上上起始密码子：驱动翻译起始密码子：驱动翻译终止密码子：终止翻译终止密码子：终止翻译阅读与思考：阅读与思考：基因的运载体、目的基因、启动子、终止子基因的运载体、目的基因、启动子、终止子等都是等都是DNA片断，如何将它们连接起来？片断，如何将它们连接起来？三将目的基因导入三将目的基因导入受体受体细胞细胞常用的受体细胞：常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理？将目的基因导入受体

15、细胞的原理？借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到

16、受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。目的基因目的基因TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA重组重组构建表达载体构建表达载体转入转入农杆菌农杆菌导入导入植物细胞植物细胞a a、d d指的是什么过程？指的是什么过程？农杆菌转化法示意图农杆菌转化法示意图（2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。（3）花粉管通道法）花粉管通道法 植物花粉在

17、柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。因借助花粉管通道进入受体细胞。2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：(目的基因目的基因)表达载体表达载体 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 新性状动物新性状动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目

18、的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子思考与探究：思考与探究：利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链

19、，这些有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。生产这种糖蛋白是不可能的。深度思考：深度思考：如何筛选出被重组质粒侵入的受体细胞。如何筛选出被重组质粒侵入的受体细胞。青霉素培养基青霉素抗性基因思考：思考：1、受体细胞摄入、受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基分子后就说明目的基因完成了表达吗？因完成了表达吗？2、目的基因是否稳

20、定的存在于转基因生物、目的基因是否稳定的存在于转基因生物并按人们的预期进行表达，需要在那些水平上并按人们的预期进行表达，需要在那些水平上进行检测？进行检测？四：目的基因的检测与表达四：目的基因的检测与表达分子分子水平水平检测检测检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术抗原抗原-抗体杂交技术抗体杂交技术1、提取受体生物、提取受体生物DN

21、A，并解旋成单链；，并解旋成单链；2、用标记了放射性同位素的目的、用标记了放射性同位素的目的DNA片段单链作片段单链作为探针；为探针；3、检测两者是否进行杂交；、检测两者是否进行杂交；A-A-3232P PT-T-C-G-T-G3232P P-T-T-A-A-C-AX1C-C-A-G-T-T-A-X2-G-G-T-C-A-A-TY1A-A-T-T-C-G-T-Y1-T-T-A-A-G-C-A探针探针探针探针 待测待测待测待测DNAXDNAX 待测待测待测待测DNAYDNAY待测待测DNAY与探针与探针DNA相同相同分子分子水平水平检测检测个体个体水平水平鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因

22、生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交mRNA-DNA mRNA-DNA 分子杂交分子杂交抗原抗原-抗体杂交抗体杂交若不能表达，若不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行修饰。再进行修饰。例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的

23、基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计珠蛋白，想一想，应如何进行设计？尝试设计尝试设计 1）获取小鼠）获取小鼠-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。）。2）将）将cDNA、在大肠

24、杆菌中可以适用的启动子、在大肠杆菌中可以适用的启动子、终止子、抗四环素的基因、质粒等，构建成一个表终止子、抗四环素的基因、质粒等，构建成一个表达载体。达载体。3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。4）培养进入了）培养进

25、入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后检测体，破碎后检测-珠蛋白含量，若符合要求，则可珠蛋白含量，若符合要求，则可用于生产。用于生产。归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：