基因诊断与基因治疗生物化学.ppt

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1、目目录录 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗Gene Diagnosis and Gene Therapy目目录录目目录录一、一、基因基因诊诊断的概念、特点及断的概念、特点及临临床意床意义义 定义：定义：利利用用分分子子生生物物学学技技术术，通通过过检检测测基基因因及及基基因因表表达达产产物物的的存存在在状状态态，对对人人体体疾疾病病作作出出诊诊断断的的方方法法。基基因因诊诊断断检检测测的的目目标标分分子子是是DNADNA、RNARNA，也可以是蛋白质或者多肽。，也可以是蛋白质或者多肽。目目录录目目录录诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变)lDNA、RNA或或蛋蛋白白质质水水平平变变化

2、化，如如病病毒毒基基因因及及其其转转录录产产物物在在体体内内从从无无到到有有、癌癌基基因因表表达达水水平平从低到高；从低到高；l基基因因结结构构变变化化，如如点点突突变变引引起起基基因因失失活活、染染色色体转位引起基因异常激活或灭活。体转位引起基因异常激活或灭活。目目录录目目录录基因诊断的特点基因诊断的特点高特异性高特异性高灵敏性高灵敏性早期诊断性早期诊断性应用广泛性应用广泛性目目录录目目录录二、基因诊断中常用的分子生物学技术二、基因诊断中常用的分子生物学技术n核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）n聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)n单链构象多态性

3、（单链构象多态性（SSCP）n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）nDNA序列测定（序列测定（DNAsequencing）n生物芯片（生物芯片（biochips）nWestern免疫印迹（免疫印迹（Westernblotting）n免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断目目录录目目录录单链构象多态性分析单链构象多态性分析（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）DNA的的突突变变造造成成DNA片片段段中中碱碱基基序序列列不不同同，变变性性为为单单链链后后在在中中性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中的的构构象象不不同同（单单链链构构象象多

4、多态态性性），利利用用迁迁移移率率的的差别可使各种序列不同的单链分离开来。差别可使各种序列不同的单链分离开来。目目录录目目录录PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意目目录录目目录录正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+PCR-SSCP分析分析 目目录录目目录录 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 （restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）由由于于DNA变变异异产产生生新新的的酶酶切切位位点点或或原原有有的的酶酶切切位位点点消消失失，在在用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化时时产产生生不不同同长度或不同数量的片段。长度

5、或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。进行检测。目目录录目目录录设设计计适适当当的的扩扩增增引引物物，使使扩扩增增片片段段包包括括某某一一个个或或数数个个限限制制性性内内切切酶酶识识别别序序列列，在在PCR扩扩增增后后用用该该限限制制酶酶切切割割PCR产产物物，根根据据电电泳泳后后酶酶切片段长度变化，即可作出诊断。切片段长度变化，即可作出诊断。PCR-RFLP目目录录目目录录ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C+DAEcoR限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化目目录录目目录录DNA序列测定序列测定(双脱氧末端终止法双脱氧末

6、端终止法)目目录录目目录录左侧：正常；右侧突变左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究序列分析用于基因诊断研究目目录录目目录录基因芯片杂交流程示意图基因芯片杂交流程示意图目目录录目目录录基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法方法优点与问题优点与问题解决方案解决方案核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限

7、制较多选择合适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不适宜广泛使用可自动化，但不适宜广泛使用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛效率高，成本高，不适宜广泛使用使用选择合适的芯片选择合适的芯片目目录录目目录录基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法 n直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常达是否异常n间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术

8、途径选择。定基因诊断的技术途径选择。目目录录目目录录（一）直接诊断途径（一）直接诊断途径 必要条件：必要条件：被检测基因变化与疾病发生有被检测基因变化与疾病发生有直接因果直接因果关系关系 被检被检基因正常分子结构已被确定基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的被检基因致病的分子机制分子机制（突变位点或表达变（突变位点或表达变化）已知化）已知目目录录目目录录5/5/3/3/RFLP1.1.点突变的检测点突变的检测（1 1）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变目目录录目目录录斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序产物

9、直接测序5/5/3/3/（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 目目录录目目录录在在DNA序序列列上上有有一一段段较较长长序序列列的的重重新新排排布布。包包括括数数十十个个碱碱基基到到数数千千个个碱碱基基的的丢丢失失、插插入入、替替换换、重重复复和和倒倒位位等等，以以及及染染色色体体突突变变或或畸畸变变，包包括括染染色色体体的的易易位位、缺缺失失或或染染色色三三体体（如如唐唐氏氏综综合合征）等。征）等。2.2.基因重排的检测基因重排的检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR目目录录目目录录BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋

10、白生成障碍性贫血的直接基因诊断的直接基因诊断a-珠蛋白珠蛋白基因不同程度的缺失可引起基因不同程度的缺失可引起不同类型的不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血目目录录目目录录 根据引物根据引物33端的互补与否，设计一对与正端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物常或突变模板配对的特异引物等位基因特异等位基因特异PCRAS-PCR（allelespecificPCR）目目录录目目录录3.基因表达异常的检测基因表达异常的检测mRNA的相对定量分析的相对定量分析mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析mRNA长度分析长度分析目目录录目目录录（二）间接诊断途径（二）间接诊断途径1.

11、1.采用原因采用原因致病致病基因未知基因未知或基因结构不确定或基因结构不确定致病突变致病突变机制不清机制不清致病致病位点不便检测位点不便检测目目录录目目录录DNA多多态态性性：指指群群体体中中的的DNA分分子子存存在在至至少少两两种种不不同同的的类类型型，即即个个体体间间同同一一染染色色体体的的相相同同位位置置上上核核苷苷酸酸序序列列存存在在一一定定的的差差异异或变异。或变异。多多在在进进化化中中形形成成，本本身身并并不不致致病病，只只是是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。2.2.遗传标记遗传标记目目录录目目录录间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记间接诊

12、断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：三代遗传标记：RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术）VNTR(variablenumberoftandemrepeats);STR(shorttandemrepeats)SNP(singlenucleotidepolymorphism)目目录录目目录录7.6kb13kb患患者者正正常常HBS的间接基因诊断的间接基因诊断RFLP标记的连锁分析标记的连锁分析Hap7.6kb13kbSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交N H PN N：正常；：正常；H H：杂合子；：杂合子；P P：患者（纯合子）；黄色区域为探针：患者（纯合

13、子）；黄色区域为探针目目录录目目录录 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases目目录录目目录录一、血红蛋白病（一、血红蛋白病（hemoglobinopathy）（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病（二）（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症二、血友病（二、血友病（Hemophilia）甲型血友病基因诊断甲型血友病基因诊断三、脆性三、脆性X综合征综合征目目录录目目录录（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法2.H

14、BS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析3.HBS的的PCR-RFLP分析分析目目录录目目录录n正常正常的（的（N）的）的ASO探针：探针：5-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3n突变突变的（的（M）的）的ASO探针：探针：5-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-31.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法目目录录目目录录斑点杂交结果斑点杂交结果 N N：正常；：正常；M M突变突变镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测杂交法检测N-ASOM-ASO正常正常 突变突变 突变突变纯合子纯合子 杂合子杂合子 纯合子纯合子53正常基

15、因正常基因1.15kb(CCT GAG G)53突变基因突变基因1.35kb(CCT GTG G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析Mst酶切位点酶切位点（CCTNAGG）2.HBS的的限制性内切酶谱分析限制性内切酶谱分析目目录录0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目目录录目目录录目目录录3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 正常人的扩增产物经正常人的扩增产物经 MstMst 消化可生成消化可生成54bp54bp和和56bp56bp两个片段，而镰状细

16、两个片段，而镰状细胞贫血症患者的胞贫血症患者的DNADNA片段不被酶切，仍为片段不被酶切，仍为110bp110bp，杂合子可见三条带，杂合子可见三条带正常人正常人杂合体杂合体患者患者Marker目目录录目目录录1.PCR-RFLP分析分析-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测突变的检测M：pBR322DNA/MspI;1:未酶解片段；未酶解片段；2：bA/bA；3：bA/bT；4：bT/bT注：由于注：由于54 bp、114bp、72bp片段及分子量标准中低于片段及分子量标准中低于200bp的片段太小，在的片段太小，在0.8的琼脂糖凝胶中不易被观察到的

17、琼脂糖凝胶中不易被观察到（二）（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症目目录录目目录录-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2.2.反向斑点杂交反向斑点杂交目目录录目目录录二、血友病（二、血友病（Hemophilia）n甲甲 型型 血血 友友 病病 是是 由由 于于 血血 浆浆 凝凝 血血 因因 子子VIII（FVIII）缺陷造成。）缺陷造成。n甲甲型型血血友友病病的的基基因因突突变变类类型型已已有有300余余种种，其其中中点点突突变变占占174种种；另另有有部部分分患患者者是是由由于于缺失或插入突变或内含子缺失或插入突变或内含子22的基

18、因倒位所致。的基因倒位所致。目目录录目目录录1.FVIII基因倒位的基因倒位的DNA印迹分析印迹分析将将基基因因组组DNA用用NcoI，DraI或或BclI等等内内切切酶酶（酶酶切切位位点点位位于于交交换换点点两两侧侧）消消化化，用用特特异异探探针针进进行行杂杂交交分分析析，正正常常人人表表现现为为21.5kb、14kb和和16kb三三种种类类型型。I型型倒倒位位患患者者表表现现为为20、17.5和和14kb三三种种类类型型；型型倒倒位位患患者者表表现现为为20、16和和15.5kb三三种种带带型型。在在一一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现

19、。目目录录目目录录2.FVIII基因突变的检测基因突变的检测（1）依赖于）依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析的连锁分析（2）RFLP连锁分析连锁分析（3）VNTR分析分析（4）短串联重复序列（）短串联重复序列（STR）的连锁分析）的连锁分析目目录录目目录录三、脆性三、脆性X综合征综合征n脆性脆性X智力低下基因智力低下基因1（FMR1）5非翻译区遗传不稳非翻译区遗传不稳定的定的(CGG)n三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻CpG岛的异常甲基化。岛的异常甲基化。n正常人中约为正常人中约为850拷贝。拷贝。n男性和女性携带者增

20、多到男性和女性携带者增多到52200拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG岛岛未被甲基化，称为前突变（未被甲基化，称为前突变（premutation）。）。n男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到2001000拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变（岛也被甲基化，称为全突变（fullmutation）。）。n全突变可关闭相邻全突变可关闭相邻FMR1基因的表达，基因的表达，FMR1mRNA在在几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。目目录录目目录录脆性脆性X综合征常用基因诊断方法综合征常用基

21、因诊断方法1PCR-ASO2DNA连锁分析连锁分析3Souhern印迹杂交法印迹杂交法4PCR扩增扩增感染病的基因诊断感染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases目目录录 一、病毒性疾病一、病毒性疾病n甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAV）HAV系系RNA病病毒毒，利利用用RT-PCR技技术术可可从从粪粪便便中检测出甲型肝炎病毒的基因组中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。n乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV）设设计计保保守守区区序序列列引引物物，扩扩增增各各型型HBVDNA片片段段；设设计计位位于于可可变变区区的的引引物物扩扩增增某某一一亚亚型型H

22、BVDNA，以便分型。，以便分型。n丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCV）HCV为为正正链链RNA病病毒毒，先先反反转转录录成成cDNA，再再进行巢式进行巢式PCR检测检测HCV。目目录录目目录录目目录录二、细菌引起的疾病二、细菌引起的疾病n结核分枝杆菌结核分枝杆菌先先设设计计一一对对特特异异性性引引物物，用用PCR技技术术扩扩增增出出一一383bp序序列列，再再用用探探针针杂交，灵敏度可达到杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。个细菌水平。n幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（HP）主主要要采采用用PCR技技术术：检检测测HP染染色色体体DNA特特异异片片段段；检检测测HP尿尿素素酶酶A基因；基因；用用PC

23、R-RFLP鉴别鉴别HP菌株。菌株。目目录录目目录录三、寄生虫及衣原体感染三、寄生虫及衣原体感染n疟原虫疟原虫n卡氏肺孢子虫卡氏肺孢子虫n衣原体感染衣原体感染诊断方法：核酸杂交和诊断方法：核酸杂交和PCR技术技术目目录录目目录录肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断Gene Diagnosis of Malignant Tumors目目录录目目录录一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌乳腺癌 结肠癌结肠癌 目目录录目目录录一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测1原癌基因的检测原癌基因的检测ras基基因因家家族族由由

24、H-ras、K-ras和和N-ras组组成成。最最常常见见的突变是第的突变是第12、13、59或第或第61位密码子的位密码子的点突变点突变。胰胰腺腺癌癌、结结肠肠癌癌、肺肺癌癌以以K-ras突突变变为为主主，如如第第12位位密密码码子子突突变变，由由编编码码甘甘氨氨酸酸的的GGT突突变变为为TGT、GTT或或GAT，少数突变为，少数突变为GCT。急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；突变为主；泌尿系统肿瘤泌尿系统肿瘤则以则以H-ras突变为主。突变为主。目目录录目目录录PCR及及PCR-SSCP分分析析：扩扩增增ras 基基因因

25、第第12位位密密码码子子点点突突变变部部位位，再再用用SSCP技技术术进进行行分分析析，或或者者直直接接测测序序确确定定患患者者ras原原癌癌基基因因的的点点突突变。变。核苷酸杂交技术（如核苷酸杂交技术（如ASO）：）：检测检测ras基因基因第第12位密码子点突变。位密码子点突变。2.ras原癌基因突变常用的检测方法原癌基因突变常用的检测方法目目录录目目录录3抑癌基因抑癌基因p53的检测的检测np53的基因诊断方法有的基因诊断方法有（1）PCR-SSCP分析技术分析技术（2）DNA序列分析序列分析（3）PCR-RFLP分析分析基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用Applicatio

26、n of Gene Diagnosis in Forensic Medicine目目录录目目录录目目录录n重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。群中存在变异，形成多态性。n串联重复序列散在分布于染色体上。串联重复序列散在分布于染色体上。n重复单位重复单位625bp长，称为小卫星长，称为小卫星DNA。重复单位重复单位26bp长，如（长，如（TA）n,(CGG)n等，等，称为微卫星称为微卫星DNA。一、一、DNADNA指纹与多态性遗传标记指纹与

27、多态性遗传标记目目录录目目录录人类人类DNADNA指纹图指纹图目目录录目目录录二、二、DNA指纹与法医学诊断指纹与法医学诊断n个个体体识识别别和和亲亲子子鉴鉴定定：DNA指指纹纹技技术术是是从从基基因因水水平平检检测测DNA的的高高度度多多态态性性，个个体体识识别别率高。率高。n以以往往在在刑刑事事案案件件的的法法医医学学鉴鉴定定中中应应用用的的是是血血型型、血血清清蛋蛋白白型型、红红细细胞胞酶酶型型和和HLA分分型型，个个体体分分辨辨能能力力不不够够，只只能能排排除除，不不能能做做到到统统一认证。一认证。基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 Concept and Strategy of

28、 Gene Therapy目目录录n基因治疗：基因治疗：指将目的基因通过基因转移指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。的基因表达产物对疾病起治疗作用。目目录录 狭义基因治疗：狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞后与宿指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。广义基因治疗：广义基因治疗：外源正常基因导

29、入病变细胞，产生正常基因的表达产物外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治疗疾病的目的。疗疾病的目的。目目录录目目录录基因治疗分类基因治疗分

30、类体细胞体细胞(somaticcell)基基因治疗因治疗生殖细胞生殖细胞(germline)基基因治疗因治疗v只限于某一体细胞的只限于某一体细胞的基因的改变基因的改变v只限于某个体的当代只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进对缺陷的生殖细胞进行矫正行矫正v当代及子代当代及子代目目录录目目录录 一、基因治疗的基本方法一、基因治疗的基本方法目目录录 （一）基因置换（一）基因置换（genereplacement）定定义义：将将特特定定目目的的基基因因导导入入特特定定细细胞胞，通通过过定定位位重重组组，导导入入的的正正常常基基因因，以以置置换换基基因因组组内内原原有有的的缺陷基因缺陷基因。目的：目的：

31、将缺陷基因的异常序列进行桥正。将缺陷基因的异常序列进行桥正。对对缺缺陷陷基基因因的的缺缺陷陷部部位位进进行行精精确确的的原原位位修修复复，不不涉及基因组的任何改变。涉及基因组的任何改变。目目录录n定定向向整整合合的的条条件件:转转导导基基因因的的载载体体与与基基因因组组DNA具具有有相相同同的的序序列列。带带有有目目的的基基因因的的载载体体就就能能找找到到同同源源重重组组的的位位点点，进进行行部部分分基基因因序序列的交换。列的交换。n基基因因同同源源重重组组技技术术又又称称为为基基因因打打靶靶(genetargeting）n细胞内基因同源重组的发生率很低。细胞内基因同源重组的发生率很低。基因同

32、源重组技术基因同源重组技术目目录录（二）（二）基因增补基因增补（geneaugmentation）定定义义:通通过过导导入入外外源源基基因因使使靶靶细细胞胞表表达达其其本本身身 不表达的基因。不表达的基因。类型类型:n有有缺缺陷陷基基因因细细胞胞中中导导入入正正常常基基因因，而而细细胞胞内内的的缺缺陷陷基基因因并并未未除除去去，通通过过导导入入正正常常基基因因的的表达产物，补偿缺陷基因的功能；表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞本本来来不不表表达达的的基基因因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。利用其表达产物达到治疗疾病的目的。目目录录（三）基因干预（三）基

33、因干预（geneinterference）定义：定义：采采用用特特定定的的方方式式抑抑制制某某个个基基因因的的表表达达，或或者者通通过过破破坏坏某某个个基基因因的的结结构构而而使使之之不不能能表表达达，以达到治疗疾病的目的。以达到治疗疾病的目的。目目录录n定定义义：将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效应，效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。从而达到清除肿瘤细胞的目的。n应用：应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法。是恶性肿瘤基因

34、治疗的主要方法。（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(SuicideGeneTherapy)目目录录 （五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗通过将抗癌免疫增强的细胞因子或通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。抗癌免疫反应。目目录录基因转移基因转移(genetransfer)技术技术1.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移2.非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移目目录录 1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病病毒毒载载体体介介导导的的基基因因转转移移效效率率较较高高，因因此此它它也也是是使

35、使用用最最多多的的基基因因治治疗疗载载体体。据据统统计计，有有72%72%的的临临床床实实验验计计划划和和71%71%的的病病例例使使用用了了病病毒毒载载体体，其其中中用用得得最最多多的的是是反反转转录录病病毒毒载载体体。目目录录反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期（1 1）反转录病毒）反转录病毒 目目录录（2）腺病毒）腺病毒(adenovirus)载体载体腺腺病病毒毒是是一一种种大大分分子子(36kb)双双链链无无包包膜膜DNA病病毒毒。它它通通过过受受体体介介导导的的内内吞吞作作用用进进入入细细胞胞内内，然然后后腺腺病病毒毒基基因因组组转转移移至至细细胞胞核核内内，保保持持

36、在在染染色色体体外外，不整合进入宿主细胞基因组中。不整合进入宿主细胞基因组中。腺腺病病毒毒是是人人类类呼呼吸吸道道感感染染的的病病原原体体，但但目目前前尚尚未未发发现现与与肿肿瘤瘤发发生生有有关关联联。宿宿主主细细胞胞范范围围广广，可可感感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。目目录录目目录录腺病毒的优点腺病毒的优点l基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；l宿主范围广；宿主范围广；l基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；l重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；或气管

37、内滴注；l腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外源基因。外源基因。目目录录目目录录腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点l宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。l有两个环节可能产生复制型腺病毒。有两个环节可能产生复制型腺病毒。l靶向性差。靶向性差。l不不能能整整合合到到靶靶细细胞胞的的基基因因组组DNA中中。分分裂裂增增殖殖快快的的细细胞胞，导导入入的的重重组组病病毒毒载载体体，随随分分裂裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。而丢失的机会增多，表达时间相对较短。目目录录目目录录常用基因治疗载体常用基因治疗载体整合整合致病性致病性感染细胞感染

38、细胞克隆容量克隆容量反反 转转 录录 病病 毒毒 载体载体随随机机整整合合，效效率高率高可能致病可能致病分裂细胞分裂细胞7kb7kb腺病毒载体腺病毒载体不不整整合合，可可能能丢失丢失不致病不致病分分裂裂细细胞胞、非非分裂细胞分裂细胞腺腺相相关关病病毒毒载载体体定定点点整整合合(1919号号染色体特定区域染色体特定区域)不致病不致病分分裂裂细细胞胞、非非分裂细胞分裂细胞5kb5kb7.5kb7.5kb目目录录2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统（1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术脂脂质质体体介介导导的的基基因因转转移移技技术术使使用用方方便便、成成本本

39、低廉。低廉。基基本本原原理理:利利用用阳阳离离子子脂脂质质体体单单体体与与DNA混混合合后后，可可以以自自动动形形成成包包埋埋外外源源DNA的的脂脂质质体体，然然后后与与细细胞胞一一起起孵孵育育，即即可可通通过过细细胞胞内内吞吞作作用用将将外外源源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导的基因转移示意图目目录录目目录录（2）受体介导转移技术）受体介导转移技术将将DNA与与细细胞胞或或组组织织亲亲和和性性的的配配体体偶偶联联，可可使使DNA具具有有靶靶向向性性。这这种种偶偶联联通通常常通通过过多多聚聚阳阳离离子子（如

40、如多多聚聚赖赖氨氨酸酸）来来实实现现。多多聚聚阳阳离离子子与与配配体体共共价价连连接接后后，又又通通过过电电荷荷相相互互作作用用与与带带负负电电荷荷的的DNA结结合合，将将DNA包包围围，只只留留下下配配体体暴暴露露于于表表面面。这这样样形形成成的的复复合合物物可可被被带带有有特特异异性性受受体体的的靶靶细细胞胞吞吞饮饮，从从而而将将外外源源DNA导入靶细胞。导入靶细胞。受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图目目录录目目录录（3）基因直接注射技术）基因直接注射技术不不需需要要进进行行基基因因工工程程的的繁繁琐琐操操作作，直直接接将将裸裸露露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉

41、或某些器官组织内。动动物物实实验验表表明明：接接受受注注射射外外源源DNA的的小小鼠鼠能能够够按按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。n将将促促进进心心脏脏血血管管生生长长的的基基因因直直接接注注入入实实验验鼠鼠的的心心脏脏，可可使使其其心脏壁内毛细血管增加心脏壁内毛细血管增加30%40%；n将将胰胰岛岛素素基基因因直直接接注注入入鼠鼠骨骨骼骼肌肌细细胞胞，能能分分泌泌糖糖尿尿病病所所缺缺少少的胰岛素；的胰岛素；n肌肌内内注注射射凝凝血血因因子子基基因因，可可产产生生血血友友病病所所需需的的凝凝血血因因子子。目目录录 基因直接注射法的优点

42、基因直接注射法的优点p制制备备具具有有调调控控部部件件的的质质粒粒DNA重重组组体体的的技技术术较较容容易；易；p排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；p导导入入的的基基因因不不需需整整合合即即可可表表达达，避避免免了了反反转转录录病病毒毒载载体体导导入入整整合合后后，一一旦旦发发生生副副作作用用不不易易中中止止或或逆转的缺点；逆转的缺点；p基基因因直直接接注注射射法法可可反反复复使使用用，而而病病毒毒载载体体则则可可能能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。目目录录三、基因干预三、基因干预 （gene i

43、nterference）目目录录（一）反义（一）反义RNA（antisenseRNA）1.反义反义RNA与基因表达调控与基因表达调控利用反义利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：表达调控，通常采用的方法有两种：（1）体外合成反义）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞吸收RNA后，发挥作用。后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。而发挥作用。目目录录2.受体介导反义受体介导反义

44、RNA技转移术技转移术受体介导的受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高；被被转转移移的的RNA是是被被保保护护的的，与与周周围围环环境境之之间间存存在在多多聚聚赖赖氨氨酸酸的的保保护护层层,可可以以抵抵抗抗环环境境中中的的核酸酶的降解作用。核酸酶的降解作用。借助前述的受体介导基因转移方法借助前述的受体介导基因转移方法，可可以实现受体介导的反义以实现受体介导的反义RNA转移。转移。目目录录3.反义反义RNA的优点的优点受受体体介介导导的的反反义义RNA基基因因治治疗疗有有其其自自身身的的优优点点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。而在一定程度上补充了转基因治疗的不

45、足。（l）安全性高）安全性高（2）反义）反义RNA设计和制备方便设计和制备方便（3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应（4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNA病毒病毒目目录录（二）核酶（二）核酶 (ribozyme)天然核酶多为单一的天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个剪切作用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。分子组成。在在基基因因治治疗疗时时，利利用用核核酶酶分分子子结结合合到到靶靶RNA分分子子中中适适当当的的部部位位，形形成成锤锤头头状状核核酶酶结结构构，将将靶靶RNA分分子子切切断断，通通过过破破坏坏靶靶RNA分分子子而而达达到治疗疾

46、病的目的。到治疗疾病的目的。核酶锤头状的二级、三级结构核酶锤头状的二级、三级结构只只要要两两个个RNA分分子子通通过过互互补补序序列列相相结结合合，形形成成锤锤头头状状的的二二级级结结构构（3个个螺螺旋旋区区），并并能能组组成成核核酶酶的的核核心心序序列列（13个个或或11个个保保守守核核苷苷酸酸序序列列），就就可可在在锤锤头头右右上方产生剪切反应。上方产生剪切反应。目目录录目目录录1.核酶的设计核酶的设计核核酶酶是是通通过过靶靶RNA分分子子与与核核酶酶分分子子共共同同组组成成酶酶活活性性结结构构域域，要要从从靶靶分分子子和和核核酶酶分分子子两两个个方方面面来来设设计计核核酶。酶。（1 1）

47、选选择择合合适适的的靶靶部部位位，该该部部位位具具有有核核酶酶切切割割位位点点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2）核核酶酶的的基基本本组组成成：用用于于基基因因治治疗疗的的核核酶酶分分子子由由三三个个部部分分组组成成，中中间间是是保保守守序序列列（能能够够组组成成酶酶活活性性结结构域），两端是引导序列构域），两端是引导序列。目目录录目目录录核酶的作用机制核酶的作用机制 目目录录2.核酶的应用核酶的应用与与一一般般的的反反义义RNA相相比比，核核酶酶具具有有较较稳稳定定的的空空间间结结构构，不不易易受受到到RNA酶酶的的攻攻击击。更更重重要要的的是是，

48、核核酶酶在在切切断断mRNA后后，又又可可从从杂杂交交链链上上解解脱脱下下来来，重重新结合和切割其它的新结合和切割其它的mRNA分子。分子。目目录录（三）干扰（三）干扰RNA 1.RNA干扰现象干扰现象RNA干干扰扰（RNAinterference，RNAi）是是一一种种由由双双链链RNA诱诱发发的的基基因因沉沉默默现现象象。在在此此过过程程中中，与与双双链链RNA有有同同源源序序列列的的信信使使RNA（mRNA）被被降降解解，从从而而抑抑制制该该基基因因的的表表达达。有有义义RNA（senseRNA）或或反反义义RNA（antisenseRNA）均均能能抑抑制制线线虫虫基基因因的的表表达达，

49、双双链链RNA比比单单链链RNA更更为为有有效效。这这与与传传统统上上对对反反义义RNA技技术术的的解解释释正正好好相相反反。而而且且其其抑抑制制基基因因表表达达的的效率比反义效率比反义RNA至少高至少高2个数量级。个数量级。目目录录2.RNA干扰的机制干扰的机制RNA干扰过程主要有干扰过程主要有2个步骤：个步骤：（1）小干扰性）小干扰性RNA（siRNA）（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为称为RNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。该复合体可识别与该复合体可识别与s

50、iRNA有同源序列的有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该并在特异的位点将该mRNA切断切断长双链长双链RNA被细胞内的双链被细胞内的双链RNA特异性核酸特异性核酸酶酶Dicer切成切成2123个碱基对的短双链个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性称为小干扰性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）目目录录目目录录RNA干扰机制示意图干扰机制示意图目目录录研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具由于由于RNA干扰技术具有高度的序列专一性干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组