基因工程的基本概念和原理.ppt

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1、基因工程基因工程基因工程基因工程原理方法及应用原理方法及应用原理方法及应用原理方法及应用蒋爱芹蒋爱芹 本课程讨论本课程讨论4 4个问题：个问题：1 1 什么是基因工程什么是基因工程基因工程的概念基因工程的概念2 2 为什么能进行基因工程为什么能进行基因工程基因工程的原理和技术基因工程的原理和技术3 3 怎样进行基因工程怎样进行基因工程DNADNA体外重组，重组体外重组，重组DNADNA导导入宿主细胞后扩增和表达入宿主细胞后扩增和表达4 4 基因工程的应用和前景基因工程的应用和前景对于医学来说即生产基对于医学来说即生产基因工程药物和疫苗、开展基因治疗等因工程药物和疫苗、开展基因治疗等第一章第一章

2、第一章第一章 基因工程的基本概念基因工程的基本概念基因工程的基本概念基因工程的基本概念D D D D 基因工程的基本用途基因工程的基本用途基因工程的基本用途基因工程的基本用途C C C C 基因工程的影响与意义基因工程的影响与意义基因工程的影响与意义基因工程的影响与意义A A A A 基因的概念基因的概念基因的概念基因的概念B B B B 基因工程的诞生和发展基因工程的诞生和发展基因工程的诞生和发展基因工程的诞生和发展E E E E 基因工程的支撑技术基因工程的支撑技术基因工程的支撑技术基因工程的支撑技术1 1、基因定义的发展、基因定义的发展一基因（一基因（gene)gene)nn191919

3、19世纪中世纪中世纪中世纪中 孟德尔孟德尔孟德尔孟德尔 豌豆杂交试验豌豆杂交试验豌豆杂交试验豌豆杂交试验 遗传因子遗传因子遗传因子遗传因子 经典遗传学经典遗传学经典遗传学经典遗传学nn20202020世纪初世纪初世纪初世纪初 摩尔根摩尔根摩尔根摩尔根 果蝇杂交实验果蝇杂交实验果蝇杂交实验果蝇杂交实验 基因连锁互换基因连锁互换基因连锁互换基因连锁互换 基因学基因学基因学基因学nn1944194419441944年年年年 艾弗瑞艾弗瑞艾弗瑞艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验 遗传物质遗传物质遗传物质遗传物质DNADNADNADNA分子遗传学分子遗传学分

4、子遗传学分子遗传学nn1953195319531953年年年年 沃森沃森沃森沃森-克瑞克克瑞克克瑞克克瑞克 DNADNADNADNA双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构 分子生物学分子生物学分子生物学分子生物学18651865年年 的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1822-1884 分离定律分离定律自由组合定律自由组合定律摩尔根（摩尔根（18661945）基因连锁互换规律基因连锁互换规律1953年，年，DNA双螺旋模型的诞生双螺旋模型的诞生2 2、基因的现代定义、基因的现代定义基因从化学上来说，指的是一段基因从化学上来说，指的是一段DNADNA或或RNARNA顺序，顺序，该顺序可以产生或影响某

5、种表型（该顺序可以产生或影响某种表型（genotypegenotype，phenotypephenotype），），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。一个功能单位，一个突变单位。二、基因工程二、基因工程二、基因工程二、基因工程（genetic engineeringgenetic engineeringgenetic engineeringgenetic engineering）1 1 1

6、1、定义、定义、定义、定义 将一种生物体（将一种生物体（将一种生物体（将一种生物体（供体供体供体供体）的基因与）的基因与）的基因与）的基因与载体载体载体载体在体外进行拼在体外进行拼在体外进行拼在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（接重组，然后转入另一种生物体（接重组，然后转入另一种生物体（接重组，然后转入另一种生物体（受体受体受体受体）内，使之按照）内，使之按照）内，使之按照）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNADNADNADNA体体体体外操

7、作程序，也称为外操作程序，也称为外操作程序，也称为外操作程序，也称为分子克隆技术分子克隆技术分子克隆技术分子克隆技术。因此，因此，因此，因此，供体、受体、载体供体、受体、载体供体、受体、载体供体、受体、载体是重组是重组是重组是重组DNADNADNADNA技术的三大基技术的三大基技术的三大基技术的三大基本元件。本元件。本元件。本元件。基因工程的基本特点是，基因工程的基本特点是，基因工程的基本特点是，基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞分子水平操作，细胞分子水平操作，细胞分子水平操作，细胞水平表达。水平表达。水平表达。水平表达。1）第一个实现DNADNA重组的人BergBerg19721972

8、年，BergBerg用E.coRE.coR切割SV40DNASV40DNA和phageDNAphageDNA，经过连接组成重组的DNADNA分子。BergBerg是第一个实现DNADNA重组的人2）第一个取得基因工程成功的人CohenCohen19731973年，Cohen GroupCohen Group将E.coliE.coli的tettetr r质粒psclolpsclol和nener rs sr rR6-3R6-3质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coliE.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terterr rNeNer r,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工

9、程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年2 2、基因工程发展史、基因工程发展史1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为“Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:290

10、4-2909,1972”，标志着基因工程技术的诞生。第一个重组体构建SV40SV40病毒是猿猴病毒，病毒是猿猴病毒，是一种直径为是一种直径为450450的的球形病毒，分子量为球形病毒，分子量为2810628106道尔顿。道尔顿。SV40SV40的的DNADNA是环状双是环状双链结构，全长链结构，全长52435243个个碱基对。碱基对。SV40DNASV40DNA上上有一个限制性内切酶有一个限制性内切酶EcoREcoR的切点。的切点。当当获获得得二二聚聚体体SV40DNASV40DNA后后，BergBerg等等就就证证明明了了环环状状DNADNA被被内内切切酶酶切切成成线线性性DNADNA后后能

11、能够够重重新新环环化化，并并且且能够同另外的分子重组。能够同另外的分子重组。于于是是他他们们进进行行第第二二步步的的实实验验就就是是从从dvgaldvgal DNADNA中中制制备备含含有有E.coliE.coli的的半半乳乳糖糖操操纵纵子子DNADNA，用用上上述述同同样样的方法进行重组连接，并获得成功。的方法进行重组连接，并获得成功。第一个有功能重组体的构建第一个有功能重组体的构建 虽然虽然BergBerg的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的明体外重组的DNADNA分子具有生物学功能。分子具有生物学功能。1973 1973年，等在美国

12、年，等在美国PNASPNAS上发表了题为上发表了题为“Construction Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid of Biologically Functional Bacterial Plasmid In VitroIn Vitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,and R.B.S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,and R.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70:3240-3244,Helling,Proc.Na

13、tl.Acad.Sci.USA 70:3240-3244,19731973）的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达进行表达,从而完善了从而完善了BergBerg开创的基因重组技术。开创的基因重组技术。Boyer and Cohen3 3）19761976年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司遗传工程公司BoyerSwanson4 4）19801980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNADNA技术技术生产胰岛素的工厂生产胰岛素的工厂insulinFrom Ge

14、netech 5 5）19971997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉英国罗林研究所成功的克隆了多莉（一）理论上的（一）理论上的3 3大发现：大发现：1 1）2020世纪世纪4040年代，年代，AveryAvery发现了生物遗传物质的化学本质是发现了生物遗传物质的化学本质是DNADNA。2 2）2020世纪世纪5050年代，年代，Watson-crickWatson-crick提出了提出了DNADNA结构的双螺旋结结构的双螺旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。3 3）2020世纪世纪6060年代，确定了遗传信息的传递方式：年代，确定了遗传信息

15、的传递方式：DNARNAPr,DNARNAPr,破译了全部遗传密码，破译了全部遗传密码，4 43 3。3 3、基因工程、基因工程3 3大理论大理论,3,3大技术准备：大技术准备：（二）（二）技术上的技术上的3 3大发明：大发明：1 1）“基因剪刀基因剪刀”限制性内切酶的发明限制性内切酶的发明（1 1）2020世纪世纪40406060年代，科学家们就为基因工程设计了美好年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，的蓝图，但是面对庞大的但是面对庞大的dsDNAdsDNA束手无策，无从下手把它切束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。成单个基因片断。（2 2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一

16、个已发现）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。的酶能完成这样的使命。（3 3）19701970年，年，SmithSmith和和WilcoxWilcox在流感嗜血杆菌在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzaeHaemophilus inffuenzae）分离纯化了）分离纯化了HindHind，取得了突破，取得了突破，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。为基因工程奠定了最为重要的技术基础。19701970年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶 Hamilton O.Smith美国美国霍普金斯大霍普金斯大学医学

17、医学院学院1931年年-Daniel Nathans美美国国霍普金斯大霍普金斯大学医学医学院学院1928年年-1999年年Werner Arber 瑞士瑞士Biozentrum大大學學1929年年-1978年诺贝尔奖Smith HO,Wilcox KW.A restriction enzyme from Hemophilus influenzae.I.Purification and general properties.J Mol Biol.1970;51(2):379-912 2）载体）载体(“(“交通工具车子交通工具车子”)基因工程技术诞生的第二个技基因工程技术诞生的第二个技术准备术准备

18、（1 1）有了切割与缝合（有了切割与缝合（ligaseligase）基因）基因DNADNA的工具，还得有一的工具，还得有一个车子将重组个车子将重组DNADNA送到宿主细胞中去。送到宿主细胞中去。（2 2）19461946年起，年起，LederbergLederberg就研究细菌性因子（就研究细菌性因子（F F因子），因子），50-6050-60年代相继发现了年代相继发现了R R因子（抗药因子），因子（抗药因子），CoE(CoE(大肠杆菌因大肠杆菌因子子)等质粒。等质粒。（3 3）然而，直到）然而，直到19731973年年CohenCohen才能将质粒作为基因工程载体才能将质粒作为基因工程载体使

19、用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。是基因工程的第二个技术准备。3 3）逆转录酶）逆转录酶19701970年年BaltimoveBaltimove和和TeminTemin等同时各自发现了等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（原因如下）的制备成为可能。（原因如下）（1 1）真核基因组庞大而复杂，）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。不易制得基因图谱。（2 2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不

20、能在）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出原核表达系统剪接出mRNAmRNA，没有成熟的，没有成熟的mRNAmRNA就不能得到就不能得到相应的产物。相应的产物。（3 3）经过逆转）经过逆转mRNAcDNA(complementory DNA)mRNAcDNA(complementory DNA)文库文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。4 4、基因工程相关的概念：、基因工程相关的概念：（一）克隆（一）克隆（clone,cloningclone,cloning）（1 1）作为名词作为名词基因型（基因型（

21、genetypegenetype）相同的细胞或生物体的一个群体，通过无性繁）相同的细胞或生物体的一个群体，通过无性繁殖获得。殖获得。带有相同插入顺序的重组带有相同插入顺序的重组DNADNA分子的分子的1 1个群体，如描述一个微生物个群体，如描述一个微生物菌落，这些微生物带有共同的插入了特定菌落，这些微生物带有共同的插入了特定DNADNA片断的载体分子。片断的载体分子。（2 2）作为动词作为动词，即利用体外，即利用体外DNADNA重组技术将一个特定的基因或重组技术将一个特定的基因或DNADNA顺序插入一个载体分子。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为顺序插入一个载体分子。由于整个操作在分子水平

22、上进行，所以称为分子克隆（分子克隆（molecular cloningmolecular cloning）。）。（二）重组（二）重组DNADNA技术技术(DNA recombination technique)(DNA recombination technique)是用酶学的方法将不同来源的是用酶学的方法将不同来源的DNADNA在体外切割，连接组成一在体外切割，连接组成一个杂合的个杂合的DNADNA分子的技术。分子的技术。DNADNA重组技术是基因工程的核心重组技术是基因工程的核心内容。内容。（三）生物工程（三）生物工程（Biologic engineeringBiologic engine

23、ering）：是更大范围内生产）：是更大范围内生产产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，包产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，包括：基因工程、酶工程、细胞工程、微生物工程、发酵工程括：基因工程、酶工程、细胞工程、微生物工程、发酵工程等。等。三基因工程的意义三基因工程的意义人类对自然的干预人类对自然的干预（一）遗传和变异是生物学的一对重要概念。（一）遗传和变异是生物学的一对重要概念。1.1.遗传赋予生物种的稳定，保证生物种的延绵不断。遗传赋予生物种的稳定，保证生物种的延绵不断。2.2.变异赋予生物种的进化，保证生物种对环境的适应。变异赋予生物种的进化，保证生物种对环境的

24、适应。3.3.遗传和变异这一对矛盾在一个生物体内统一起来。遗传和变异这一对矛盾在一个生物体内统一起来。4.4.在生物演变的历史长河中，自然发生的变异是相当相当缓慢的。在生物演变的历史长河中，自然发生的变异是相当相当缓慢的。5.5.随着生物科学的发展，尤其是基因工程技术的诞生，人类开始干预生随着生物科学的发展，尤其是基因工程技术的诞生，人类开始干预生物的变异（福耶祸耶？无法定论）物的变异（福耶祸耶？无法定论）6.6.经典的遗传学千百万年才能积累出现的有利的变异，通过基因工程手经典的遗传学千百万年才能积累出现的有利的变异，通过基因工程手段几十年乃至几年就可以实现。段几十年乃至几年就可以实现。Dol

25、ly The SheepHello DollyHello DollyDolly was the first mammal cloned from an adult cell.She was born in 1997 and died in 2003.She was 6 when she died,about half the usual age for a sheep是是2010年年5月月20日美国科学家日美国科学家向世界宣布的、首例人造生命向世界宣布的、首例人造生命完全由人造基因控制的单完全由人造基因控制的单细胞细菌诞生，并将它命名为细胞细菌诞生，并将它命名为“人造儿人造儿”。意义：新的生命

26、体可以在实验意义：新的生命体可以在实验室里室里“被创造被创造”，而不是一定，而不是一定要通过要通过“进化进化”来完成来完成人造活细菌的细胞核人造活细菌的细胞核(二二)多利多利199719972 22323，NatureNature杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯林研杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯林研究所和究所和PPLPPL生物技术公司已经成功克隆了一只名叫多利的绵生物技术公司已经成功克隆了一只名叫多利的绵羊（羊（199719972003/7/122003/7/12）。）。为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢?它推翻了遗传学上一条上百年的定律：体细胞功能

27、高度分化，它推翻了遗传学上一条上百年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个体。不可能重新发育成个体。（三）多利诞生的过程（三）多利诞生的过程1.1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。2.2.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出细胞核换上第一只羊取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出细胞核换上第一只羊乳腺细胞核（乳腺细胞核（“掉包掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。3.3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫

28、中发育，妊娠（同正常将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样），最后产下多利。一样），最后产下多利。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。（四）此克隆非彼克隆（四）此克隆非彼克隆（五）克隆是一把双刃剑（五）克隆是一把双刃剑克隆对人类社会伦理道德提出了一场非同寻常的挑战克隆对人类社会伦理道德提出了一场非同寻常的挑战四四四四 基因工程的基本用途基因工程的基本用途基因工程的基本用途基因工程的基本用途基因工程药物基因工程药物转基因植物转基因植物转基因动物转基因动物基因治疗基因治疗基因芯片技术基因芯片技术Bacteria ca

29、n be engineered to“eat”oil spills.转基因植物转基因植物转基因动物转基因动物Human DNA in a Goat CellThis goat contains a human gene that codes for a blood clotting agent.The blood clotting agent can be harvested in the goats milk.Transgenic Goat五五五五 基因工程的基本形式基因工程的基本形式基因工程的基本形式基因工程的基本形式第一代基因工程第一代基因工程第一代基因工程第一代基因工程 蛋白多肽基因的

30、高效表达蛋白多肽基因的高效表达蛋白多肽基因的高效表达蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程经典基因工程经典基因工程经典基因工程第二代基因工程第二代基因工程第二代基因工程第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变蛋白编码基因的定向诱变蛋白编码基因的定向诱变蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程蛋白质工程蛋白质工程蛋白质工程第三代基因工程第三代基因工程第三代基因工程第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构代谢信息途径的修饰重构代谢信息途径的修饰重构代谢信息途径的修饰重构 途径工程途径工程途径工程途径工程 第四代基因工程第四代基因工程第四代基因工程第四代基因工程 基因组或染色体的转移基因组或染色体的转移基因组或

31、染色体的转移基因组或染色体的转移 基因组工程基因组工程基因组工程基因组工程第二代基因工程（蛋白质工程）第二代基因工程（蛋白质工程）以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为人类合乎需要的新的突变蛋子设计，把蛋白质改造为人类合乎需要的新的突变蛋白质。白质。第三代基因工程（途径工程）第三代基因工程（途径工程）借助借助DNA重组技术优化细胞的酶活性、运转及调重组技术优化细胞的酶活性、运转及调控功能，从而改变细胞的特性。控功能，从而改变细胞的特性。第四代基因工程（第四代基因工程（人类基因组计划）人类基因组计划）于于2020世纪世纪

32、8080年代提出的，由国际合作组织包括有美、英、日、中、年代提出的，由国际合作组织包括有美、英、日、中、德、法等国参加进行了人体基因作图，测定人体德、法等国参加进行了人体基因作图，测定人体2323对染色体由对染色体由3103109 9核苷酸组成的全部核苷酸组成的全部DNADNA序列，于序列，于20002000年完成了人类基因组年完成了人类基因组“工作框工作框架图架图”。20012001年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。其研究内容年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。其研究内容还包括创建计算机分析管理系统，检验相关的伦理、法律及社会问题，还包括创建计算机分析管理系统，检验相关的伦理、法律及社

33、会问题，进而通过转录物组学和蛋白质组学等相关技术对基因表达谱、基因突进而通过转录物组学和蛋白质组学等相关技术对基因表达谱、基因突变进行分析，可获得与疾病相关基因的信息。变进行分析，可获得与疾病相关基因的信息。六六六六 基因工程的支撑技术基因工程的支撑技术基因工程的支撑技术基因工程的支撑技术凝胶电泳技术凝胶电泳技术凝胶电泳技术凝胶电泳技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术细菌转化转染技术细菌转化转染技术细菌转化转染技术细菌转化转染技术DNADNADNADNA序列分析技术序列分析技术序列分析技术序列分析技术聚合酶链反应（聚合酶链反应（聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCRPCRPCR）技术技术技术技术