基因工程的主要技术原理.ppt

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1、一、质粒一、质粒DNA的提取的提取闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会，在变性后不会分离，复性快；分离，复性快；（1 1）原理原理1.碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强碱中性中性染色体染色体线性线性DNA和或和或有缺口有缺口的质粒的质粒DNA变性后双变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起复合物结合在一起;当当K+取代取代Na+时时,生成不生成不溶的溶的PDS,这些复合物从溶液中这些复合物从溶液中沉淀沉淀下来下来。变性变性 利用宿主菌线状染色体利用宿主菌线

2、状染色体DNADNA与闭环双链质粒与闭环双链质粒DNADNA的结构状态的差异来提取质粒的结构状态的差异来提取质粒DNADNA。当同时当同时碱变性碱变性时，时，线状基因组线状基因组DNADNA变性充分而质变性充分而质粒粒DNADNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时（当条件恢复时（酸中和酸中和），质粒），质粒DNADNA迅速准确配迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNADNA则与则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被被SDSSDS包盖。包盖

3、。当当K+K+取代取代Na+Na+时时,这些复合物会从溶液中沉淀下这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。来，附在细胞碎片上一起被离心除去。碱裂解法碱裂解法（2）所用的试剂作用所用的试剂作用 葡萄糖葡萄糖增加溶液的增加溶液的粘度粘度，维持，维持渗透压渗透压，防止，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。受机械力（震荡）的作用而降解。EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制的螯合剂，可抑制DNA酶酶的的活性，防止活性，防止DNA被酶降解。被酶降解。NaOH-SDSNaOH：强碱，提供：强碱，提供pH12的碱性条件，的碱性条件，使使DNA双链双链变性变性。SDS:溶解细胞膜

4、蛋白和细胞内蛋白，并溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成结合成“蛋白蛋白SDS”复合物复合物，使蛋白质，使蛋白质（包括（包括DNA酶）变性沉淀。酶）变性沉淀。冰醋酸把醋酸钾溶液的冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到调到4.8。用来用来中和中和NaOH变性液，使变性液，使DNA复性。复性。高浓度的高浓度的K+置换置换Na+,生成生成不溶的不溶的PDS用于用于沉淀沉淀DNA。乙醇乙醇DNA分子以分子以水合状态水合状态“溶于溶于”水里，乙水里，乙醇能夺去醇能夺去DNA分子的水环境。分子的水环境。KAc-HAc缓冲液缓冲液 RNase A降解降解RNA渣滓。渣滓。以免提取后的以免提取后的DNA中含有小分子的中

5、含有小分子的RNA。TE缓冲液缓冲液DNA保存保存液。液。由由Tris-HCl和和EDTA配制。配制。Tris-HCl维持溶液中维持溶液中pH值相对稳定；值相对稳定；EDTA抑制抑制DNA酶，防止酶，防止DNA被酶降解。被酶降解。蛋白变性剂蛋白变性剂，进一步抽提，进一步抽提DNA溶液中的蛋溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。白质，使蛋白质沉淀。但但苯酚苯酚会残留在会残留在DNA溶液中。溶液中。（现多用各种商品化的（现多用各种商品化的层析柱层析柱纯化纯化DNA)。酚酚-氯仿氯仿选用选用以上试剂有商业试剂盒；以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。也可以自己配制。（3）碱抽提法提取质粒）碱抽提法提取质粒D

6、NA的步骤的步骤 Solution I 的配制：的配制：使用使用“溶液溶液”悬浮菌体。悬浮菌体。第一步：悬浮菌体第一步：悬浮菌体25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，溶液溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。变性。第二步：破膜，蛋白质和第二步：破膜，蛋白质和DNA变性变性Solution II 的配制：的配制：第三步：中和第三步：中和溶液溶液III使使DNA复性、并促使蛋白质复性、并促使蛋白质-SDS复复合物和染色体合物和染色体DNA沉淀。沉淀。Solution III的配制：的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS5M 乙酸钾（用冰醋酸调乙酸

7、钾（用冰醋酸调pH至至4.8）上清液中含有闭合质粒上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇倍体积的异丙醇或或2倍体积的倍体积的乙醇乙醇。第五步：纯化第五步：纯化DNA上清液上清液过柱过柱或酚或酚-氯仿抽提。氯仿抽提。第六步：沉淀第六步：沉淀DNA与待扩增的模板与待扩增的模板DNA区段的两区段的两3端序列端序列互补互补（5端相同端相同）的短）的短DNA。位置位置33引物设计现在多用引物设计现在多用专业软件专业软件如如Primer5.0等等二、二、引物（引物（primer)设计设计引物的长度引物的长度一般引物设计为长一般引物设计为长1830bp。引物

8、引物的特异性的特异性 引物应与核苷酸序列数据库的其引物应与核苷酸序列数据库的其他序列无明显同源性。他序列无明显同源性。引物的碱基序列引物的碱基序列5端根据需要可设计成某个端根据需要可设计成某个内切酶的切内切酶的切点点顺序、顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。点或生物素标记等，方便与以后操作。5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT33GCTAGCTACTTAAG53端（特别是最末及倒数三个碱基）必须与端（特别是最末及倒数三个碱基）必须与模板严格配对，模板严格配对，5端可以不配对。端可以不配对。templateprimer尽可能

9、提高尽可能提高G+C含量含量，以提高引物与模，以提高引物与模板的结合力板的结合力,G+C含量以含量以 45%-65%为宜。为宜。引物的碱基组成引物的碱基组成避免避免连续连续4个以上相同碱基个以上相同碱基排列或内部排列或内部回文回文序列序列.5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3CTGCCAGTCTAC3GACGG5T发卡结构发卡结构1）2）3）避免）避免形成引物二聚体（形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。碱基序列互补。5GGTCTGCCAGTCTAC33CAGGACTTAGTCACT5primer1primer2引物的引物

10、的Tm值值Tm=（G+C)4+(A+T)2适当提高复性温度可以提高引物与模板结适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择实际复性温度选择低于低于Tm值值5-10 oC。经验公式计算：经验公式计算：Tm值是指溶液中有半数的值是指溶液中有半数的DNA分子解链为分子解链为单链时的温度。两条引物的单链时的温度。两条引物的Tm值尽可能相值尽可能相等或相近，最好相差不超过等或相近，最好相差不超过2 oC。三、三、增加增加PCR特异性的措施特异性的措施（1）引物设计）引物设计（2）引物的退火温度）引物的退火温度（3）循环次数）循环

11、次数（4）Taq DNA聚合酶，利用聚合酶，利用高保真高保真DNA聚合酶聚合酶（5）降落）降落PCR（6）热启动）热启动PCR（7）巢式）巢式PCR四四.PCR技术的扩展技术的扩展（1）巢式）巢式PCR(nest PCR)此时进行二步此时进行二步此时进行二步此时进行二步PCRPCRPCRPCR，第二级，第二级，第二级，第二级PCRPCRPCRPCR需另行设置反需另行设置反需另行设置反需另行设置反应体系，并应用另外的应体系，并应用另外的应体系，并应用另外的应体系，并应用另外的PCRPCRPCRPCR引物，此时引物的引物，此时引物的引物，此时引物的引物，此时引物的位置位于初级位置位于初级位置位于初

12、级位置位于初级PCRPCRPCRPCR引物的内侧，用初级引物的内侧，用初级引物的内侧，用初级引物的内侧，用初级PCRPCRPCRPCR产物产物产物产物做模板，进行第二步不饱和做模板，进行第二步不饱和做模板，进行第二步不饱和做模板，进行第二步不饱和PCRPCRPCRPCR扩增，这样只扩增，这样只扩增，这样只扩增，这样只有初级有初级有初级有初级PCRPCRPCRPCR中特异的扩增片段才能被二级引物中特异的扩增片段才能被二级引物中特异的扩增片段才能被二级引物中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。扩增。扩增。扩增。除了提高除了提高除了提高除了提高PCRPCRPCRPCR的产量外，还提高了最终产的产量外，

13、还提高了最终产的产量外，还提高了最终产的产量外，还提高了最终产物的特异性。物的特异性。物的特异性。物的特异性。为了增加产物的特异性，设计为了增加产物的特异性，设计2组引物（组引物（套嵌引套嵌引物物），结合位点依次位于前一组引物之间，进行，结合位点依次位于前一组引物之间，进行2轮扩增。第一轮的轮扩增。第一轮的PCR产物稀释产物稀释100-200倍作为下倍作为下一轮的扩增模板，进行不饱和扩增（一轮的扩增模板，进行不饱和扩增（10-15 cycles）。）。1324（2）热启动）热启动PCR(hot start PCR)94 4 min(预变性预变性)94 30 sec,60 30 sec,72 2

14、 min 72 7 min 35个循环个循环ddHddH2 2OO10 x Buffer 10 x Buffer 25 mmol/L MgCl25 mmol/L MgCl2 210 mmol/L dNTP10 mmol/L dNTP10 M10 M上游引物上游引物上游引物上游引物10 M10 M下游引物下游引物下游引物下游引物DNADNA模板模板模板模板DNA TaqDNA Taq聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶（3）降落）降落PCR配制的体系不变配制的体系不变,PCR扩增的程序设置扩增的程序设置上变化上变化:94 4 min,94 30 sec,66 30 sec,每每2个循环降个循环降1-2,20

15、 cycles,72 2 min,94 30 sec,56 30 sec,15 cycles,72 2 min72 7 min无带无带,先降先降,再稳定扩增再稳定扩增有带有带,先高温稳定扩增先高温稳定扩增,再降再降退火温度退火温度60（4）长片段）长片段PCR(long-range PCR)引物设计引物设计l 25-30bp25-30bpl Tm Tm相差不超过相差不超过1 扩增参数扩增参数l 缩短热变性时间，缩短热变性时间，94 2 minl 尽可能使升温、降温过程缩短尽可能使升温、降温过程缩短l 适当增加延伸时间，可到适当增加延伸时间，可到20min l 二步法扩增二步法扩增94 2 mi

16、n(预变性预变性)94 30 sec,65 17 min 72 7 min 35个循环个循环（4）长片段）长片段PCR(long-range PCR)反应体系反应体系l 选用扩增长片段的选用扩增长片段的TaqTaq酶酶l 选用扩增高选用扩增高GCGC含量的含量的 PCR bufferPCR buffer 结合热启动和降落结合热启动和降落PCRPCR进行进行低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后。最后产物中产物中99%是单链是单链DNA。（5）不对称）不对称PCR 3553引物少引物

17、少用于扩增用于扩增单链单链DNA，单链，单链DNA更适于测序。更适于测序。引物浓度引物浓度：两个引物的浓度相差两个引物的浓度相差100倍。倍。（5）不对称）不对称PCR 退火温度不对称退火温度不对称一条引物长，另一条引物短一条引物长，另一条引物短PCR时，先是低温退火，一定循环后，时，先是低温退火，一定循环后，提高退火温度，使短的引物不能结合模提高退火温度，使短的引物不能结合模板，达到产生单链。板，达到产生单链。（6）反向）反向PCR 扩增两个扩增两个引物外侧引物外侧的未知序列的未知序列把线性把线性DNA模板转变成环形分子。模板转变成环形分子。templatetemplate3553（传统（传

18、统PCRPCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。只扩增两个引物质之间的已知序列）。技术关键：技术关键：使引物的外侧序列使引物的外侧序列“转变转变”成内侧序列。成内侧序列。（7 7）TAIL-PCRTAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR)templatetemplate5335P1P2P3ADP1,P2,P3为特异性引物，为特异性引物，25bp,Tm 65 左右左右AD为简并引物，为简并引物，15-16bp,Tm 44-45已知序列已知序列Liu,YG and Whittier R

19、F(1995).Genomics 25:674-681.1、Southern blot双链双链DNA限制性内切酶限制性内切酶 消化消化电泳分离电泳分离检测检测放射自显影放射自显影转膜转膜NaOH变性变性洗膜洗膜杂交杂交标记的探针标记的探针NaOH或高温变性或高温变性u原理和方法原理和方法:五五.分子杂交分子杂交 技术技术u应用应用:基因拷贝数检测基因拷贝数检测;基因文库筛选基因文库筛选,获取目的基因获取目的基因;遗传疾病诊断遗传疾病诊断;转基因样品检测转基因样品检测,等等2、Northern blot是相对于是相对于Southern blot而命名的。而命名的。利用利用DNA-RNA链或链或R

20、NA-RNA链杂交的原理，链杂交的原理，通过通过DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测RNA样品样品。u原理和方法原理和方法:单链单链RNA变性胶电泳分离变性胶电泳分离检测检测放射自显影放射自显影转膜转膜洗膜洗膜杂交杂交标记的探针标记的探针NaOH或高温变性或高温变性u应用应用:主要用于基因在转录水平上的表达研究。主要用于基因在转录水平上的表达研究。基因时空特异性表达，及表达模式分析；基因时空特异性表达，及表达模式分析；候选基因表达分析，有利于排除候选候选基因表达分析，有利于排除候选 基因，等基因，等Pi36-1Pi36-2RiceGAAS预测预测CRG2(2)CRG3(0)CRG4(0)5

21、.8 kb4.8 kb6.4 kbabc物理图谱物理图谱NBS-LRRNBS-LRRRM5647(5)Northern blot的原理与的原理与Southern blot相比相比 有三点不同有三点不同:(1)检测的对象不同检测的对象不同.(2)变性方法是不同的变性方法是不同的,它不能用碱变性它不能用碱变性,因为因为 碱变性会导致碱变性会导致RNA的降解的降解.(3)探针不同探针不同.3、Western blot通过抗体与靶蛋白的抗原特异性反应检通过抗体与靶蛋白的抗原特异性反应检测测蛋白质样品蛋白质样品。主要用于基因在蛋白质水平上的表达研主要用于基因在蛋白质水平上的表达研究。究。Western blot的原理与的原理与Southern blot相比相比 有两点不同有两点不同:(1)检测的对象不同检测的对象不同.(2)探针的性质不同探针的性质不同,在在Western blot中使中使 用的探针是抗体用的探针是抗体(蛋白质蛋白质)