植物细胞工程中国药科大学生物工程所有.ppt

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1、 第四章 植物细胞工程 Plant Cell Engineering 第一节 概述掌握植物细胞工程基本概念 及其主要内容 应用了解植物细胞工程的研究简史、现状 及发展前景 热点植物细胞工程的发展历史德国植物学家Haberlandt植物细胞培养创始人1902年根据细胞学说（celltheory）提出植物体细胞有再生完整植株的潜在全能性-细胞全能性（totipotency）植物细胞全能性是植物细胞工程的理论基础1904年，德国植物胚胎学家Hanning用萝卜和辣根的胚进行离体培养，提早长成了小植株，首次获得胚培养成功。成熟发芽常规：幼胚种子植物培养组织培养：幼胚植株1922年，Knudson对兰花

2、幼胚进行培养获得幼苗，克服了兰花种子发芽难的困难。1925年，Laibach进行亚麻种间杂种幼胚培养，成功地得到了杂种植物。1934年，White等用番茄根尖的组织培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。1934年，Gautheret培养山毛柳、黑杨的形成层组织，获得愈伤组织形成。1937年，White和Went等分别发现B族维生素和吲哚乙酸（IAA）对培养的离体根生长具有重要作用。1937-1938年，Gautheret在1934年培养山毛柳、黑杨成功获得愈伤组织的基础上，在培养柳树的培养基中，加入IAA和B族维生素等，使形成层的生长大为增加。1937-1938年，Nobecourt培养胡萝

3、卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织。将愈伤组织置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖，形成愈伤组织。首次从液泡化的薄壁细胞建立愈伤组织培养物。White、Gautheret、Nobecourt等科学家被誉为植物组织培养的奠基人。在此基础上建立了植物组织培养的综合培养基，包括无机盐成分、有机成分和生长刺激因素。这是随后创立的各种培养基的基础，同时也建立了植物组织培养的基本方法，成为当今各种植物组织培养的技术基础。一一.植物细胞工程植物细胞工程基本概念基本概念：原理和方法：细胞学、生理学、分子生物学及工程学原理对象：植物细胞设计改造：植物细胞遗传性目标：创造新物种，提供名贵药品及服务二

4、二.植物细胞工程植物细胞工程研究主要内容研究主要内容：植物细胞和组织培养技术原生质体培养和融合技术植物的快速繁殖和人工种子植物染色体工程转基因技术 植物细胞工程植物细胞工程 热点热点1.在无菌和人工控制的条件下，采用植物细胞和组织培养技术培养植物的细胞，组织，器官以获得有药用价值的次生代谢产物。2.采用植物的遗传操作技术改变植物或植物细胞的原有性状和功能，获得具有优良性状的植株或植物细胞，生产有药用价值的次生代谢产物。第二节植物细胞培养特性及主要培养技术细胞的全能性:一个细胞具有产生完整生物个体的固有能力。一、重要概念一、重要概念植物干细胞：植物胚性细胞（embryogeniccells）即合

5、子。分化的根茎叶中仍保留少数未分化或分化程度不高的细胞（遗留的胚性细胞）一、重要概念一、重要概念细胞的脱分化（dedifferentiation):特定条件下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化，改变原有的发育途径，失去原有的分化状态，转变为具分生能力的胚性细胞。已分化细胞要表现全能性，先要脱分化成分生细胞，后再分化形成胚胎发育成植株脱分化条件：创伤和外源激素。一、重要概念一、重要概念外植体(explant)：植物体上取出的用于培养和分离细胞的组织或器官愈伤组织：植物的伤口或外植体的伤口长出的细胞团，既是组织，又是脱分化细胞次生代谢产物：保持植物的抗逆性，抗病性和抗虫性，及担当信号分子。一、

6、重要概念一、重要概念一、重要概念一、重要概念植物组织培养植物组织培养在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)，培养在人工培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织，或潜伏芽等，或长成完整的植株，又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体培养等。延迟期：细胞数恒定，高RNA含量，高蛋白质合成能力；加速期：细胞快速生长期。细胞数、DNA和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力减少；对数期

7、：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间。增加细胞鲜重、干重及RNA酶活性，蛋白质合成能力完全减退；稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高度分化及高浓度有机化合物。二、培养植物细胞二、培养植物细胞 四个生长时期四个生长时期（1）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在对数期，次生代谢产物积累在稳定期（2）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生长。（3）植物细胞好气，培养过程需供气及搅拌，（4）植物细胞较微生物细胞大得多，纤维素细胞壁，细胞壁脆弱，抗剪切能力小，传统的搅拌式反应器极易损伤细胞壁三、植物细胞的培养特点三、植物细胞的培养特点

8、（5）具有群体效应、无锚定依赖性及接触抑制性；（6）培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低；（7）培养过程具有结构与功能全能性。经过增殖与分化，能发育成为植株三、植物细胞的培养特点三、植物细胞的培养特点（1）必需元素大量元素：氮、磷、钾、钙、镁、硫等微量元素：硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等（2）无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。（3）碳源，蔗糖（4）需多种维生素烟酸，B1，B6和植物生长激素生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯。（5）需有机物：甘氨酸或水解络酪蛋白，酵母提取液等。四、植物细胞四、植物细胞营养要求营养要求A BA：BA(0mg/L)，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B：BA(0

9、.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）A A：NAA 0mg/LNAA 0mg/L，芽（少），根（无），芽（少），根（无）B B：NAA 0.1mg/LNAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量），芽（少），根（无），愈伤组织（少量）C C：NAA 5.0mg/LNAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量A B C常用培养基MS、N6、B6、RM-1964、KM-8p等。MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物营养。五、五、植物细胞植物细胞培养基培养基贮备液（

10、母液）的配制贮备液（母液）的配制 为什么要配制母液？为什么要配制母液？1 1）、方便）、方便 2 2）、准确（有些成分量太小）、准确（有些成分量太小）以以MS培养基配制培养基配制为为例：例：1 1、大量元素母液的配制、大量元素母液的配制各成分按照表各成分按照表1培养基培养基浓浓度含量度含量扩扩大大10倍，按倍，按顺顺序逐步序逐步混合。后用蒸混合。后用蒸馏馏水定容到水定容到1000ml的容量瓶中，即的容量瓶中，即为为10倍的大量元素母液。倒入倍的大量元素母液。倒入细细口瓶，口瓶，贴贴好好标签标签保存于冰箱保存于冰箱中。配制培养基中。配制培养基时时，每配，每配1L培养基取此液培养基取此液100ml

11、。注意：注意：(1)(1)某些无机成分如某些无机成分如CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等在一起可能等在一起可能发发生化学反生化学反应应，产产生沉淀物。生沉淀物。为为避免此避免此现现象象发发生，母液配制生，母液配制时时要用要用纯纯度高的重蒸度高的重蒸馏馏水溶解，水溶解，药药品品采用等采用等级较级较高的分析高的分析纯纯，各种化学，各种化学药药品必品必须须先以少量重先以少量重蒸蒸馏馏水使其充分溶解后才能混合，混合水使其充分溶解后才能混合，混合时应时应注意先后注意先后顺顺序。特序。特别应别应将将CaCa2+2+、SOSO4 42 2一

12、一、Mg Mg 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等离子等离子错错开混开混合，速度宜慢，合，速度宜慢，边搅边搅拌拌边边混合。混合。(2)CaCl(2)CaCl2 22H2H2 2O O要在最后要在最后单单独加入，在溶解独加入，在溶解CaClCaCl2 22H2H2 2O O时时，蒸蒸馏馏水需加水需加热热沸沸腾腾，除去水中的，除去水中的COCO2 2，以防沉淀。另外，以防沉淀。另外，CaClCaCl2 22H2H2 2O O放入沸水中易沸放入沸水中易沸腾腾，操作，操作时时要防止其溢出。要防止其溢出。、微量元素母液的配制、微量元素母液的配制MSMS培养基的微量元素无机培养基的微量元素无机

13、盐盐由由7 7种化合物（除种化合物（除FeFe）组组成。成。微量元素用量微量元素用量较较少，特少，特别别是是CuSOCuSO4 45H5H2 2O O、CoClCoCl2 26H6H2 2OO，因此在配制中分微量，因此在配制中分微量、配制。配制。按照表按照表2 2，表，表3 3配方，用感量配方，用感量为为0.0001g0.0001g的分析天平称量，的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基其它同大量元素。配制培养基时时，每配制，每配制1L1L培养基，培养基，取微量取微量10ml10ml，微量，微量mlml3 3、铁盐铁盐母液的配制母液的配制铁盐铁盐不是都需要不是都需要单单独配成母液，如独配成母

14、液，如柠柠檬酸檬酸铁铁，只需和，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐铁盐是硫酸是硫酸亚铁亚铁和乙二胺四乙酸二和乙二胺四乙酸二钠钠的螯合物，必的螯合物，必须单须单独配成母独配成母液。液。这这种螯合物使用起来方便，又比种螯合物使用起来方便，又比较稳较稳定，不易定，不易发发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏馏水加水加热搅热搅拌溶解。拌溶解。配制培养基配制培养基时时，配制，配制1L1L取此液取此液10ml10ml。在在配配制制铁铁盐盐时时，如如果果加加热热搅搅拌拌时时间间过过短短，会会造造成成Fe S 04和和Na2EDTA鳌鳌

15、合合不不彻彻底底，此此时时若若将将其其冷冷藏藏，Fe S 04会会结结晶晶析析出出。为为避避免免此此现现象象发发生生，配配制制铁铁盐盐母母液液时时，Fe S 04和和Na2EDTA应应分分别别加加热热溶溶解解后后混混合合，并并置置于于加加热热搅搅拌拌器器上上不不断断搅搅拌拌至至溶溶液液呈呈金金黄黄色色(约约加加热热20-30 min)，调调pH值值至至5.5，室室温温放放置置冷冷却却后后，再冷藏。再冷藏。4 4、有机母液的配制、有机母液的配制MSMS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐盐酸硫胺素和酸硫胺素和盐盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原酸吡哆素。培

16、养基中的有机成分原则则上上应应分分别单别单独配制。配制直接用蒸独配制。配制直接用蒸馏馏水溶解，水溶解，注意称量注意称量时时用用电电子分析天平。并子分析天平。并贮贮存在棕色无菌存在棕色无菌瓶中瓶中 。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。5 5、植物生、植物生长调节剂长调节剂母液配制母液配制一般植物生一般植物生长调节剂长调节剂母液的配制的母液的配制的终浓终浓度以度以0.5mg/ml0.5mg/ml为为好，需要注意的是：好，需要注意的是：（）配制生（）配制生长长素素类类，例如，例如IAAIAA、NAANAA、2.4-D2.4-D、IBAIBA，应应先用

17、少量先用少量95%95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L1mol/L的的NaOHNaOH溶解，然后用蒸溶解，然后用蒸馏馏水定容到一定的水定容到一定的浓浓度。度。以后者效果好。以后者效果好。（）（）细细胞分裂素，例如胞分裂素，例如KTKT，应应先用少量先用少量95%95%乙醇或乙醇或无水乙醇加无水乙醇加3434滴滴1mol/L1mol/L的的盐盐酸溶解，或直接用酸溶解，或直接用1mol/L HCl1mol/L HCl溶解，再用蒸溶解，再用蒸馏馏水定容。水定容。（）（）GA3GA3以以95%95%酒精溶解（不耐高温，酒精溶解（不耐高温，过滤灭过滤灭菌）菌）保

18、存在棕色保存在棕色试剂试剂瓶中。瓶中。注意：注意：所有母液都要所有母液都要贴贴上上标签标签，注明名称、配制倍数、，注明名称、配制倍数、日期，所有的母液都日期，所有的母液都应应保存在保存在0404冰箱中，若母冰箱中，若母液出液出现现沉淀或霉沉淀或霉团则团则不能不能继续继续使用。使用。White的无机盐含量较低，适于生根培养。KM-8p主要用于原生质体培养，含几乎所有单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。凡花药培养中常用培养基，成分较简单，且KN03和(NH)2N04含高。五、五、植物细胞植物细胞培养基培养基培养基的配制培养基的配制 1 1、计计量量 根据配制培养基的量和母液的根据配制培养基的量和

19、母液的浓浓度度计计算需要吸取母液算需要吸取母液的量，的量，计计算公式：吸取量算公式：吸取量 ml=ml=培养基中物培养基中物质质的含量的含量（mg/Lmg/L）1000ml/1000ml/母液母液浓浓度（度（mg/Lmg/L）。）。2 2、移液、移液取取烧烧杯一只，加入少量的蒸杯一只，加入少量的蒸馏馏水，按照水，按照计计算吸取母液算吸取母液的量依次吸取各母液置于的量依次吸取各母液置于烧烧杯中杯中备备用。用。3 3、称取、称取琼琼脂蔗糖脂蔗糖备备用用4 4、融化、融化用量杯量取用量杯量取600600700ml700ml的蒸的蒸馏馏水放在水放在电电炉上，加入炉上，加入琼琼脂，脂，边边加加热边热边用

20、玻璃棒用玻璃棒搅搅拌，直到液体呈半透明状将拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。其取下，加入蔗糖。大大烧烧杯底的外表面不能沾水，否杯底的外表面不能沾水，否则则加加热时烧热时烧杯容易炸杯容易炸裂，使溶液外溢，造成裂，使溶液外溢，造成烫伤烫伤。5 5、混合、混合将融化的将融化的琼琼脂和母液充分混合，用蒸脂和母液充分混合，用蒸馏馏水定容到水定容到1000ml1000ml，来回混合几次。，来回混合几次。6 6、调调pHpH用滴管吸取物用滴管吸取物质质的量的量浓浓度度为为1 mol/L1 mol/L的的NaOHNaOH或或HClHCl溶液，溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，逐滴滴入溶化的培养基中，边边滴

21、滴边搅边搅拌，并随拌，并随时时用精用精密的密的pHpH试纸试纸(5.4(5.47.0)7.0)测测培养基的培养基的pHpH，一直到培养基的，一直到培养基的pHpH达到要求达到要求为为止止(在在调调制制时时要比目要比目标标pHpH值值偏高偏高0.20.20.50.5个个单单位，因位，因为为培养基在培养基在灭灭菌菌过过程中由于糖等物程中由于糖等物质质的降的降解，解，pHpH值值会下降会下降0.20.20.50.5个个单单位左右位左右)。7 7、分装、分装溶化的培养基溶化的培养基应该应该趁趁热热分装。注意不要分装。注意不要让让培养基沾到培养基沾到瓶口和瓶壁上。瓶口和瓶壁上。锥锥形瓶中培养基的量形瓶中

22、培养基的量约为锥约为锥形瓶容量形瓶容量的的1/51/51/41/4。每。每1L1L培养基，可分装培养基，可分装20203030瓶。瓶。8 8、包扎、包扎用封口膜封口，外用封口膜封口，外边边可加一可加一层层牛皮牛皮纸纸，扎好，扎好绳绳子，用子，用铅铅笔或碳素墨水笔在牛皮笔或碳素墨水笔在牛皮纸纸上写上培养基的代号。上写上培养基的代号。9 9、培养基的、培养基的灭灭菌菌（一）植物细胞的获得1.外植体直接分离法:机械切割、组织破碎2.愈伤组织分离法：制备小细胞团或单细胞悬液3.原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生。六、六、植物细胞的

23、植物细胞的培养技术培养技术1.单细胞的培养（1）看护培养法（nurseculture）：在单细胞的生长环境里加入愈伤组织同时培养。愈伤组织提供促细胞分裂的物质等，传递生物信息，使细胞分裂增殖。即愈伤组织看护单细胞适用于难于培养的植物种类（二）植物细胞的培养方法（二）植物细胞的培养方法（2）微室培养法：单细胞悬液接种到人工制造一个小室（如凹玻片与盖玻片组成的微室），内含少量培养基，密封培养，使其分裂增殖形成细胞团的方法连续观察，通气性差1.单细胞单细胞的培养的培养（3）平板培养法：将制备好的单细胞悬液，按一定的细胞密度，接种于固体培养基上，或与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的

24、培养方法每个平板上形成的细胞团数植板率（%）=-100%该平板上接种的细胞数1.单细胞单细胞的培养的培养（4）条件培养法：接种于条件培养基上形成的细胞系条件培养基：培养过细胞的培养基上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固体培养基。1.单细胞单细胞的培养的培养指将植物单倍体细胞花药培养成单倍体植株或经过染色体加倍成纯二倍体植株。花药培养的基本程序是：外植体(花蕾)选择预处理花蕾消毒取花药接种诱导培养分化培养2.单倍体细胞单倍体细胞的培养的培养（花药花药培养）培养）3.愈伤组织培养愈伤组织培养愈伤组织，为脱分化细胞，具再分化的能力，可培养用于次生代谢物的生产，或再生为植株。(cellsuspen

25、sionculture)游离植物细胞悬浮于液体培养基中振荡培养，细胞总数不断增加，产量达最高点后生长趋于停止，然后进行移植继代培养方法（4）细胞悬浮培养法细胞悬浮培养法单细胞悬浮0.251050.5105细胞/ml,干燥保存法、液体石蜡覆盖法、低温保存法低压低氧保存法超低温深冻保存法七、七、种质保存种质保存 超低温深冻保存法材料：愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、花粉、花粉胚、体细胞胚状体、茎尖分生组织、小植株及茎芽-196液氮冰冻保护剂二甲亚砜（DMSO）、甘油、山梨糖及蔗糖等，复合成分较单一成分效果佳，5%DMSO+1mol/L山梨醇存活率提高10倍左右。七、七、种质保存种质保存 第三节原

26、生质体培养 和融合技术 指除去细胞壁的细胞或一个被质膜所包围的且具有生活力的裸露细胞。一、一、原生质体的概念原生质体的概念二、二、原生质体培养技术原生质体培养技术用酶除去植物体细胞的细胞壁，获得原生质体。原生质体在良好的培养基上生长分裂，细胞壁再生，形成愈伤组织，诱导愈伤组织分化，长出茎、叶，根而形成植株。（一）（一）材料准备材料准备无菌试管苗叶片上胚轴和子叶培养细胞（二）（二）原生质体的制备原生质体的制备1，酶处理纤维素酶类半纤维素酶果胶酶类酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。2，原生质体的收集和纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖沉淀法：常用甘露醇作为渗透压

27、调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。Percoll一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。（二）（二）原生质体的制备原生质体的制备目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），荧光素不能自由通过质膜。伊凡蓝法：质膜受到严重损坏使细胞被染色（三）（三）原生质体活力检测原生质体活力检测1.液体浅层培养2.固体培养3.液固双层培养4.琼脂糖珠培养（四）（四）原生质体培养方法原生质体培养方法等渗培养基或体细胞种子概念任何一种离体繁殖体包埋在含有营养成分和保护

28、功能的物质中,在适宜条件下发芽出苗，发育成完整的植株，均可称之为人工种子。第一类是裸露的或休眠的繁殖体，适当干燥的体细胞胚、休眠的微鳞茎和微块茎等第二类为人工种皮包被的繁殖体，一些体细胞胚、原球茎等海藻酸钠作包埋第三类是水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体，大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等人工种子人工种子细胞分裂与细胞壁再生愈伤组织形成愈伤组织分化植株再生（五）、（五）、愈伤组织形成和植株再生愈伤组织形成和植株再生1.提高变异频率，2.细胞工程技术进行遗传重组的材料，细胞融合和基因转移必需在原生质体上进行。（五）、原生质体培养（五）、原生质体培养 意义意义1、直接筛选法有新表型或感观上出现可测定的差

29、异进行选择的方法2、间接筛选法用与突变表现型具有某种相关的特性为指标筛选硝酸还原酶缺陷型细胞突变体，培养基加入氯酸盐，酶作用下产生次氯酸，3、绿岛法在植株上使叶面细胞产生突变并创造选择压力，令抗性突变细胞正常生长形成绿色斑点，谓之“绿岛”，切下绿岛即是突变细胞，经分散和培养后即可分化为完整突变植株，三、细胞突变体筛选技术三、细胞突变体筛选技术体细胞杂交一）类型两大类：对称融合（asymmetricfusion）两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（symmetricfusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。核失活X射线，碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸质失活罗丹明（R6

30、G，抑制线粒体氧化磷酸化。四、原生质体融合技术四、原生质体融合技术 1材料准备2原生质体的制备3融合方法PEG，电融合4杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定二）二）.融合过程融合过程 3融合方法PEG，电融合二）二）.融合过程融合过程按比例混合双亲原生质体滴加PEG摇匀静置滴加高钙高pH液，摇匀静置滴加原生质体培养液洗涤数次离心得原生质体细胞团筛选再生杂合细胞。1）杂种细胞的选择系统外观选择互补选择荧光标记选择4.杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定2）体细胞杂种的鉴定形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。生化鉴定：同功酶鉴定。分子鉴

31、定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。4杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定RFLP基因型之间限制性片段长度的差异RAPD建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术4 杂种细胞选择系统与杂种植杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定株的鉴定原生质体培养13天，细胞壁再生再生细胞一旦分裂，继续生长1形成细胞团，发育成愈伤组织，诱导分化出芽及根再生为完整植株；2形成胚状体，再产生植株；5、细胞壁再生愈伤组织形成和细胞壁再生愈伤组织形成和植株再生植株再生1、植物育种中的核质替换2、细胞质杂种的获得3、远缘杂交创造新物种4、细胞器的互作研究三）、融合技

32、术应用三）、融合技术应用第四节 植物转基因技术 将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染将目的基因稳定的整合到植物的基因组中，并在子代中得到有效的表达，然后通过细胞和组织培养技术再生出转基因植株.转基因植物（Transgeneplant）利用植物遗传工程进行DNA重组，将优良的目的基因稳定的整合到植物的基因组中，并在子代中得到有效的表达，获得具有新的遗传性状的植物体。一植物转基因技术植物转基因技术1生产抗体、重组疫苗和多肽类药物药用业价值的物质，多数正确折叠，2作为生物反应器系统大规模地生产各种蛋白质和多肽等药物，促红细胞生成素、表皮生长因子、生长激素、单克隆抗体、干扰素和疫苗

33、用抗原蛋白。转基因植物应用转基因植物应用基因的获得、载体系统、基因转化、基因的表达与分析、细胞和组织培养再生出植株。二植物转基因技术过程：植物转基因技术过程：农杆菌转化法基因转化-将外源基因导入细胞方法第一类：农杆菌转化技术，间接转化利用农杆菌的Ti质粒将外源基因转入植物细胞。转基因植物中约80%是此转化而来第二类：直接转化技术。基因枪法、电激法、原生质体转化法、碳化硅纤维介导法和花粉管通道法等。三三 基因导入技术基因导入技术农杆菌在VirD2蛋白帮助下，选择性将T-DNA（转移DNA）（插入Ti质粒上两个25bp重复序列之间）转移到植物染色体上。四四 农杆菌转化系统农杆菌转化系统三个功能区。

34、三个功能区。转转移移DNA区区（T-DNA区）。区）。毒性区（毒性区（Vir区）区）冠冠瘿瘿碱碱代代谢谢基基因因的编码区。的编码区。天然的野生型天然的野生型Ti质粒质粒（Vir区），区），25bp的重复序列的重复序列构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒筛选标记基因启动子信号序列；人工多克隆位点；缩短载体长度。对野生型对野生型Ti质粒的改造：质粒的改造：1原生质体受体系统改变膜的通透性，烟草、番茄、水稻、小麦和玉米等250多种成功，2愈伤组织受体系统外植体，愈伤组织，易接受外源DNA，遗传稳定性较差。3种质系统生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞，是单倍体细胞，成功率高 五受体系统五受体系统4胚状

35、体再生系统最理想体细胞胚是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，接受外源DNA的能力强，繁殖效率高，可通过生物反应器进行大规模生产。5直接分化芽受体系统由未分化的细胞直接分化形成，稳定遗传。操作简单、周期短。转化频率最低受体系统受体系统1基因水平的检测，限制性内切酶分析、DNA序列分析、聚合酶链式反应(PCR)、Southernblot分析、Northernblot分析、原位杂交六转入基因表达转入基因表达 分析分析酶联免疫吸附法(ELISA)Western杂交-D-葡糖醛酸糖苷酶的组织化学定位分析、-D-葡糖醛酸糖苷酶的荧光分析、-D-葡糖醛酸糖苷酶的化学发光分析荧光素酶分析。定量实时PCR(quantitativereal-timePCR)术通过荧光报告物对PCR反应对基因组中的某个单拷贝基因进行实时检测转基因的拷贝数。PCR产物量与起始模板量成正比。2 表达分析的方法表达分析的方法