植物细胞工程课件第三章细胞克隆与种子细胞筛选.ppt

《植物细胞工程课件第三章细胞克隆与种子细胞筛选.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物细胞工程课件第三章细胞克隆与种子细胞筛选.ppt（81页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、细胞克隆与种子细胞筛选细胞克隆与种子细胞筛选第三章第三章细细 胞胞 工工 程程电电 子子 课课件件华华中中农农业业大大学学生生命命科科学学技技术术学学院院细胞克隆的概念与意义细胞克隆的概念与意义植物单细胞培养技术植物单细胞培养技术动物细胞克隆技术动物细胞克隆技术种子细胞筛选种子细胞筛选主要内容主要内容3.1细胞克隆的概念与意义细胞克隆的概念与意义细胞系细胞系细胞克隆细胞克隆细胞株细胞株 直直接接从从机机体体取取材材的的细细胞胞、组组织织或或器器官官所所做做的的原原代代培培养养，进进行行传传代代培培养养后后形形成成的的一一群群生生物物学学特特征征不不均均一一的的细细胞胞便便称称为为细细胞胞系系(

2、cell(cell line)line)。有限细胞系（有限细胞系（Finite Cell LineFinite Cell Line）无限细胞系（无限细胞系（Infinite Cell LineInfinite Cell Line）一一个个克克隆隆的的细细胞胞群群体体是是从从一一个个单单一一母母细细胞胞繁殖而来。繁殖而来。分分离离单单一一细细胞胞并并使使其其繁繁殖殖为为一一细细胞胞群群体体的的方法成为方法成为细胞的克隆化（细胞的克隆化（cloningcloning）。从从原原代代培培养养物物或或细细胞胞系系中中分分离离单单个个细细胞胞进进行行培培养养，形形成成均均一一的的细细胞胞群群，这这群群细

3、细胞胞具具有有一一定定的的生生物物学学特特性性和和遗遗传传标标记记，并并在在继继代代培培养养中中仍仍能能保保持持其其特特性性和和标标记记，这这群群细细胞胞就就称称为为细胞株细胞株(cell strain)(cell strain)。3.2植物单细胞培养技术植物单细胞培养技术愈伤组织诱导愈伤组织诱导平板培养平板培养看护培养看护培养微室培养微室培养其他改进培养技术其他改进培养技术3.2.1愈伤组织诱导愈伤组织诱导诱诱导导获获得得的的愈愈伤伤组组织织可可以以用用镊镊子子或或小小刀刀分分割割得得到到植植物物小小细细胞胞团团，也也可可以以将将愈愈伤伤组组织织转转移移到到培培养养基基中中，加加入入经经过过

4、杀杀菌菌处处理理的的玻玻璃璃珠珠，进进行行振振荡荡培培养养，使使愈愈伤伤组组织织分分散散成成为为小小细细胞胞团团或或单单细细胞胞，然然后后用用适适当当孔孔径径的的不不锈锈钢钢筛筛网网过过滤滤，除除去去大大细细胞胞团团和和残残渣渣，得得到到一一定定体体积积的的小小细细胞胞团团或或单单细细胞胞悬悬浮液。浮液。3.2.2平板培养平板培养 所所谓谓平平板板培培养养（plating plating cultureculture）是是指指将将一一定定密密度度的的悬悬浮浮细细胞胞接接种种到到一一薄薄层层固固体体体体培养基中进行培养的技术。培养基中进行培养的技术。1.1.单单细细胞胞的的分分离离：一一般般采采

5、用用酶酶分分离离法法，小小细细胞胞团团不不能能超超过过6 6个个细细胞胞，因因此此过过滤滤时时网网筛筛的的网网眼眼要要选选择择合适。合适。2.2.单单细细胞胞悬悬浮浮液液的的制制备备：分分离离的的单单细细胞胞经经培培养养基基洗洗涤涤2 2次以后，调整密度为次以后，调整密度为5105105 5/ml/ml。3.3.植植板板：将将1 1份份已已调调整整好好密密度度的的但但细细胞胞悬悬浮浮液液与与4 4份份3535的的固固体体培培养养基基充充分分混混合合均均匀匀，然然后后均均匀匀的的平平铺与培养皿中，其厚度为铺与培养皿中，其厚度为5mm5mm左右。左右。平板培养的效果一般用平板培养的效果一般用植板率

6、植板率来衡量。植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。例。3.2.3看护培养看护培养看看护护培培养养（nurse nurse cultureculture）技技术术首首先先是是有有MuirMuir等等（19541954）设设计计的的，其其操操作作方方法法是是在在固固体体培培养养基基上上置置入入一一块块活活跃跃生生长长的的愈愈伤伤组组织织，再再在在愈愈伤伤组组织织上上放放一一小小片片滤滤纸纸，待待滤滤纸纸湿湿润润后后将将细细胞胞接接种种于于滤滤纸纸上上。当当培培养养细细胞胞长长出出微微小小细细胞胞团团以以后后，将将其其直直接

7、接转转至至琼琼脂培养基上让其迅速生长。脂培养基上让其迅速生长。3.2.4微室培养微室培养微微室室培培养养（micro-chamber micro-chamber cultureculture）是是为为进进行行单单细细胞胞活活体体连连续续观观察察而而建建立立的的单单细细胞胞培培养养技技术术，运运用用这这种种技技术术可可对对单单细细胞胞的的生生长长与与分分化化、细细胞胞分分裂裂的的全全过过程程、胞胞质质环环流流的的规规律律等等进进行行活活体体连连续续观观察察。这这一一方方法法同同样样也也可可用用于于原原生生质质体体培培养养，用用于于观观察察细细胞胞壁壁的的再再生生与与细细胞胞分分裂裂过过程程。微微

8、室室培培养养是是细细胞胞学学研研究究的的优优良良实实验验体体系系。微微室室培培养养首首先先是是由由JonesJones等等在在19601960年设计的。年设计的。3.2.5其他改进培养技术其他改进培养技术HorschHorsch等等（19801980）将将平平板板培培养养与与饲饲养养层层培培养养技技术术相相结结合合，建建立立了了双双层层滤滤纸纸植植板板培培养养方方法法，该该方方法法是是在在培培养养皿皿中中倒倒入入琼琼脂脂培培养养基基凝凝固固后后，先先将将饲饲养养细细胞胞平平铺铺在在培培养养基基上上，然然后后在在饲饲养养细细胞胞层层上上平平展展一一张张滤滤纸纸形形成成看看护护层层，再再将将滤滤纸

9、纸制制成成的的圆圆碟碟置置于于看看护护层层上上，然然后后将将培养细胞植于其中。培养细胞植于其中。3.3动物细胞克隆技术动物细胞克隆技术原代培养原代培养继代培养继代培养单细胞克隆单细胞克隆3.3.1原代培养原代培养primaryculture取材取材培养培养q组织解离组织解离q机械分离机械分离取材取材解离一般是借助酶和鳌合剂处理组织，使解离一般是借助酶和鳌合剂处理组织，使其成为分散的细胞。常用的酶有胰蛋白酶其成为分散的细胞。常用的酶有胰蛋白酶和胶原酶，鳌合剂主要有和胶原酶，鳌合剂主要有EDTA-NaEDTA-Na和柠檬酸和柠檬酸钠。钠。一般直接用镊子、解剖刀解剖组织、器官，一般直接用镊子、解剖刀

10、解剖组织、器官，然后加以整理用于培养。然后加以整理用于培养。动物细胞原代培养过程动物细胞原代培养过程不同取材方法，原代细胞培养方式亦不不同取材方法，原代细胞培养方式亦不相同相同.一般来讲，分离获得的材料多采用一般来讲，分离获得的材料多采用组织组织块培养块培养，而通过解离获得的细胞材料多，而通过解离获得的细胞材料多采用采用单层细胞培养单层细胞培养和和悬浮培养悬浮培养。培养方法培养方法 组织块培养组织块培养 1.1.将组织剪切成碎块将组织剪切成碎块2.2.用平衡盐溶液漂洗用平衡盐溶液漂洗3.3.在解剖镜下切除脂肪、坏死组织等在解剖镜下切除脂肪、坏死组织等4.4.切成切成1mm1mm3 3大小大小5

11、.5.再漂洗再漂洗2-32-3次次6.6.转移到培养瓶内培养。转移到培养瓶内培养。特特点点 直直接接切切割割分分离离的的组组织织块块，在在一一定定程程度度上上保保持持了了原原有有的的组组织织结结构构，对对于于初初期期体体外外培培养养的的环环境境适适应应性性比比直直接接分分离离成成单单细细胞胞要要强强，因因此此，短短期期组组织织块块培培养养成成为为动动物物细细胞培养的材料来源之一。胞培养的材料来源之一。1.1.将解离获得的细胞沉淀将解离获得的细胞沉淀2.2.用培养液配制成需要的细胞悬液用培养液配制成需要的细胞悬液3.3.接种到培养瓶内接种到培养瓶内4.4.水平放置，水平放置，3737下静止培养下

12、静止培养5.5.每隔每隔1-21-2天换培养液一次天换培养液一次6.6.培培养养一一定定时时间间后后，细细胞胞在在培培养养瓶瓶底底即即形成一单细胞层。形成一单细胞层。单层细胞培养单层细胞培养 特点特点 更换培养基容易更换培养基容易便于观察不同条件对细胞生长的影响便于观察不同条件对细胞生长的影响培养后期容易使用灌注技术改善营养条件培养后期容易使用灌注技术改善营养条件细胞贴附于基底质上，更容易表达产物细胞贴附于基底质上，更容易表达产物单层细胞培养可适用于许多动物细胞的原单层细胞培养可适用于许多动物细胞的原代培养。代培养。适适用用细细胞胞 具具有有非非贴贴壁壁特特性性的的细细胞胞，如如血血细细胞胞、

13、腹腹水水细细胞胞等等，或或者者通通过过机机械械搅搅拌拌和和振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。悬浮细胞培养悬浮细胞培养 在在相相应应的的培培养养容容器器内内接接种种一一定定密密度度的的细细胞胞悬悬液液。接接种种密密度度与与细细胞胞倍倍增增时时间间有有关关，倍倍增增时时间间在在24-48h24-48h的的细细胞胞类类型型接接种种密密度度以以10105 5/ml/ml细细胞胞为为宜宜，倍倍 增增 时时 间间 在在 12-18h12-18h的的 细细 胞胞 类类 型型 接接 种种 密密 度度 以以2102104 4/ml/ml为为宜宜。单单个个培培养养瓶瓶的的接接种种

14、体体积积以以厚厚度度不超过不超过2cm2cm为好。为好。基本方法基本方法与植物细胞的悬浮培养相似与植物细胞的悬浮培养相似3.3.2继代培养继代培养subcultureq单层细胞培养单层细胞培养 贴壁细胞再培养贴壁细胞再培养q悬浮培养悬浮培养 非贴壁细胞培养非贴壁细胞培养 从原代培养物中解离细胞：从原代培养物中解离细胞：q震震荡荡法法 在在培培养养瓶瓶中中加加入入平平衡衡盐盐溶溶液液，轻轻轻轻震震动动培培养养瓶瓶，可可以以使使贴贴壁壁疏疏松松的的细细胞胞进进入到溶液内，然后收集洗涤用于培养。入到溶液内，然后收集洗涤用于培养。q蛋蛋白白酶酶消消化化 用用PBSPBS配配制制0.01-0.5%0.0

15、1-0.5%的的胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化液液，3737处处理理5-15min.5-15min.，然然后后洗洗涤用于培养。涤用于培养。qEDTAEDTA溶溶液液洗洗涤涤 用用PBSPBS配配制制1mmoll1mmoll-1-1d d EDTAEDTA，弃弃去去原原代代培培养养的的培培养养液液，转转入入EDTAEDTA洗洗涤涤细细胞胞，然然后后再再用用0.25%0.25%的的胰胰蛋蛋白白酶酶消消化，次法用于贴壁性极强的细胞获取。化，次法用于贴壁性极强的细胞获取。q机机械械剥剥离离 用用细细胞胞刮刮、细细胞胞铲铲或或其其它它工工具具直接剥离原代培养物。直接剥离原代培养物。切取拟培养的动物器官或大组织

16、块切取拟培养的动物器官或大组织块洗去血污洗去血污剔除多余成分剔除多余成分切成约切成约1mm3大小的组织块大小的组织块将所有组织剪碎将所有组织剪碎用于组织培养用于组织培养蛋白酶溶液消化蛋白酶溶液消化机械方法吹打组织块机械方法吹打组织块离心、培养液悬浮离心、培养液悬浮计数、调节细胞密度计数、调节细胞密度用于分离细胞培养用于分离细胞培养动物细胞的培养步骤动物细胞的培养步骤例例1 1乳鼠肾细胞原代培养乳鼠肾细胞原代培养 准备工作准备工作A A 培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。外线消毒，做好洗手等准备工作。B B 点燃酒精灯，用品

17、按布局放置，安装吸管等。点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等。乳鼠肾细胞原代培养乳鼠肾细胞原代培养 a.a.采采用用颈颈椎椎脱脱臼臼法法，将将一一只只新新生生乳乳鼠鼠处处死死b.b.将将 小小 鼠鼠 放放 入入 盛盛 有有 酒酒 精精 的的 烧烧 杯杯 中中 数数 秒秒c.c.置超净工作台内置超净工作台内 d.d.打打开开消消毒毒器器械械包包 用用镊镊子子掀掀起起乳乳鼠鼠腹腹部部皮皮肤肤,用用 解解 剖剖 剪剪 剪剪 开开 腹腹 腔腔,充充 分分 暴暴 露露 腹腹 腔腔e.e.用用另另一一镊镊子子轻轻轻轻夹夹起起肠肠管管,翻翻置置一一侧侧,充充分分暴暴露位于腹腔背壁脊柱露位于腹腔背壁脊柱 f

18、.f.取下双侧肾脏取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中放入消毒培养皿中 g.g.用吸管吸取用吸管吸取PBSPBS加入培养皿中加入培养皿中,清洗肾脏清洗肾脏3 3次次,尽量去掉血污尽量去掉血污.h.h.将肾组织用解剖剪剪成几块，再用将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBSPBS漂洗，漂洗，去净血液去净血液.1.1.将洗净的组织块移入消毒小瓶中将洗净的组织块移入消毒小瓶中,用眼科剪剪用眼科剪剪切至切至0.5mm0.5mm大小的组织块。大小的组织块。2.2.加入加入5-85-8倍体积的倍体积的0.25%0.25%胰蛋白酶，盖好放入胰蛋白酶，盖好放入3737水浴中消化水浴中消化20-3020-30分钟分钟,注意

19、应每隔注意应每隔5 5分钟振分钟振摇一次。摇一次。3.3.当组织块变得疏松当组织块变得疏松,颜色略白时，取出置于超颜色略白时，取出置于超净工作台内净工作台内.胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化4.4.用吸管反复吹打组织块用吸管反复吹打组织块,使大部分组织块分散使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态。成细胞团或单个细胞状态。5.5.加入加入1-2ml1-2ml培养液终止消化，净置片刻，让未培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉消化完的组织块自然下沉,将上部的组织悬液将上部的组织悬液移入无菌离心管中。移入无菌离心管中。1.800-1000rpm1.800-1000rpm离心离心8-10min

20、,8-10min,取上清加入适量取上清加入适量培养液培养液,细胞计数后分装；细胞计数后分装；2.2.在细胞瓶在细胞瓶(板板)上标明细胞名称，代数，日期；上标明细胞名称，代数，日期；3.3.倒置显微镜下观察细胞分散情况后置倒置显微镜下观察细胞分散情况后置3737孵孵箱中培养。箱中培养。离心及计数离心及计数 培养细胞每天观察，检查：培养细胞每天观察，检查：A.A.污染与否污染与否?B.?B.细胞生长状态。细胞生长状态。细胞观察细胞观察如如见见培培养养液液变变为为黄黄色色且且又又混混浊浊，为为污污染染;如如培培养养液液为为桔桔红红色色，表表明明细细胞胞状状况况良良好好。在在无无污污染染时时，24h2

21、4h内内有有细细胞胞贴贴壁壁，圆圆形形悬悬浮浮状状的的细细胞胞延延展展成成短短梭梭状状。培培养养3-43-4天天，细细胞胞生生长长繁繁殖殖，可可见见细细胞胞岛岛形形成成。细细胞胞透透明明，颗颗粒粒少少，界界线线清清。由由于于细细胞胞生生长长旺旺盛盛，代代谢谢产产物物堆堆积积，COCO2 2增增多多，培培养养液液逐逐渐渐变变酸酸呈呈黄黄色色，但但液液体体澄澄清清，此时应换液。此时应换液。例二例二鱼类细胞培养鱼类细胞培养 鱼类原代细胞的培养鱼类原代细胞的培养 A A 断尾（或剪腮）放血断尾（或剪腮）放血 B B 用用0.010.01高锰酸钾溶液或高锰酸钾溶液或7070的乙的乙醇浸泡消毒醇浸泡消毒3

22、030分钟。分钟。C 70 C 70酒精棉球擦洗解剖部位酒精棉球擦洗解剖部位 D D 剖开腹腔，取出组织，清除粘膜和剖开腹腔，取出组织，清除粘膜和血液，剪碎，维持液血液，剪碎，维持液(Hanks(Hanks液液)或缓冲液或缓冲液(PBS)(PBS)洗。洗。E E 用用0.250.25胰酶消化胰酶消化(20(20，3030或或44，过夜过夜)F F 离心离心(1000rpm,10),(1000rpm,10),弃去消化液弃去消化液G G 用培养基重悬，计数，分装培养用培养基重悬，计数，分装培养(应在应在2x102x104 4个细胞个细胞/ml/ml 以上以上)。A A 长成单层的细胞弃去培养基，加

23、胰酶长成单层的细胞弃去培养基，加胰酶EDTAEDTA，消化后弃去消化液，消化后弃去消化液B B 加培养基，吹打分散加培养基，吹打分散C C 分装培养分装培养 传代细胞的培养传代细胞的培养培养的鱼类传代细胞及显微观察培养的鱼类传代细胞及显微观察结晶紫染色结晶紫染色荧光染料染色荧光染料染色活体细胞活体细胞3.3.3单细胞克隆单细胞克隆细胞克隆化的技术大致可归纳为三类。细胞克隆化的技术大致可归纳为三类。q稀稀释释铺铺板板 用用足足够够体体积积的的培培养养液液稀稀释释细细胞胞悬悬液液，使使铺铺板板后呈单个细胞分布。后呈单个细胞分布。q基基质质附附着着 将将稀稀释释的的细细胞胞悬悬液液接接种种到到适适当

24、当的的基基质质上上，使使单单个个细细胞胞在在基基质质上上固固着着、繁繁殖殖生生长长，形形成成细细胞胞群群落落，然然后后再再取单个细胞群落进行再培养。取单个细胞群落进行再培养。q琼琼脂脂克克隆隆 有有些些细细胞胞如如病病毒毒转转化化细细胞胞，可可以以悬悬浮浮状状态态克克隆隆化化，因因此此可可以以采采用用植植物物细细胞胞克克隆隆的的方方式式，用用琼琼脂脂或或琼琼脂脂糖糖包埋。包埋。3.4种子细胞筛选种子细胞筛选种子细胞的概念及意义种子细胞的概念及意义选择压筛选选择压筛选细胞诱变细胞诱变3.4.1种子细胞的概念及意义种子细胞的概念及意义v适用于工业化生产的种子细胞，必须满适用于工业化生产的种子细胞，

25、必须满足以下几个基本条件：足以下几个基本条件：q分散性好；分散性好；q均一性好；均一性好；q生长迅速；生长迅速；q细胞中次生产物含量高；细胞中次生产物含量高；q细胞生长和次生产物合成能力稳定。细胞生长和次生产物合成能力稳定。v植物细胞经过多次培养以后，往往会发生变植物细胞经过多次培养以后，往往会发生变异，需要从中选育出优良的植物细胞，使其异，需要从中选育出优良的植物细胞，使其特性得以保持或改良。特性得以保持或改良。植物细胞选良和改良方法植物细胞选良和改良方法q筛选筛选q诱变诱变小细胞团筛选法小细胞团筛选法选择压力筛选法选择压力筛选法3.4.2选择压筛选选择压筛选选选择择压压力力筛筛选选法法是是

26、通通过过添添加加某某些些对对不不同同的的细细胞胞有有不不同同作作用用效效果果的的物物质质，淘淘汰汰部部分分敏敏感感细胞，而选择得到所需的细胞的选育方法。细胞，而选择得到所需的细胞的选育方法。一般可以分为正选择和负选择两种。一般可以分为正选择和负选择两种。v正正选择选择就是把受选择的细胞群体置于一定的就是把受选择的细胞群体置于一定的选择压力下，部分细胞在选择压力的作用下选择压力下，部分细胞在选择压力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗选择压力的细胞受到淘汰，而有一些耐受抗选择压力的细胞可以生长，从而选择得到所需的细胞。可以生长，从而选择得到所需的细胞。v正选择适用于对抗性突变体的选择。正选择适用于对

27、抗性突变体的选择。如以如以NaCl为选择剂选择耐盐突变体，以除为选择剂选择耐盐突变体，以除草剂为选择剂选择抗除草剂突变体等。草剂为选择剂选择抗除草剂突变体等。v正选择可一步完成，也可分多步完成。正选择可一步完成，也可分多步完成。一步选择法有利于筛选单基因突变的细胞，一步选择法有利于筛选单基因突变的细胞，而对于遗传背景不详且可能是多基因的突变而对于遗传背景不详且可能是多基因的突变或是细胞质基因突变，采用多步法为好。或是细胞质基因突变，采用多步法为好。v负负选择法选择法也叫富集选择法。在植物细胞筛选也叫富集选择法。在植物细胞筛选中，常用致死富集法。在负选择实验中，选中，常用致死富集法。在负选择实验

28、中，选择的对象是在一定选择压的作用下不能生长择的对象是在一定选择压的作用下不能生长的那些细胞，而能够生长的细胞受到淘汰。的那些细胞，而能够生长的细胞受到淘汰。v负选择适用于对营养缺陷型突变体的选择。负选择适用于对营养缺陷型突变体的选择。影响细胞筛选效果的因素影响细胞筛选效果的因素v亲本亲本材料对筛选效果的影响材料对筛选效果的影响v培养方式对细胞筛选效果的影响培养方式对细胞筛选效果的影响v细胞生长速度对细胞筛选效果的影响细胞生长速度对细胞筛选效果的影响v选选择择压压力力的的施施加加方方式式对对细细胞胞筛筛选选效效果果的的影响影响亲本材料对筛选效果的影响亲本材料对筛选效果的影响q亲本亲本材料的选用

29、是否得当，对于细胞筛选的成败材料的选用是否得当，对于细胞筛选的成败有重要影响，首先应该选用优良的、仅存在个别有重要影响，首先应该选用优良的、仅存在个别缺点需要改进的基因型。缺点需要改进的基因型。q还必须注意染色体的倍数性水平和培养细胞再生还必须注意染色体的倍数性水平和培养细胞再生植株的能力。植株的能力。培养方式对细胞筛选效果的影响培养方式对细胞筛选效果的影响q用用来来进进行行筛筛选选的的细细胞胞，基基培培养养方方式式主主要要可可分分为为四四种种：愈愈伤伤组组织织培培养养、细细胞胞悬悬浮浮培培养养、细细胞胞固固体体培培养养和和原原生质体培养。生质体培养。细胞生长速度对细胞筛选效果的影响细胞生长速

30、度对细胞筛选效果的影响q某某些些抗抗代代谢谢产产物物在在培培养养基基中中只只有有很很短短的的半半衰衰期期。如如果果有有关关的的细细胞胞系系生生长长很很慢慢，那那么么抗抗代代谢谢产产物物可可能能在在敏敏感感细细胞胞死死亡亡前前降降解解。因因此此，敏敏感感的的变变异异体体可可能能在在不允许其生长的条件下存活下来。不允许其生长的条件下存活下来。q生生长长缓缓慢慢的的细细胞胞也也容容易易发发生生染染色色体体数数目目和和结结构构的的变变化化，这这些些变变化化可可能能使使植植株株再再生生困困难难或或不不可可能能再再生生，尤其是当在培养体中累积了非整倍体时更是如此。尤其是当在培养体中累积了非整倍体时更是如此

31、。选择压力施加方式对细胞筛选效果的影响选择压力施加方式对细胞筛选效果的影响q选择压力可一次性施加，也可逐步施加。选择压力可一次性施加，也可逐步施加。q在在有有些些离离体体选选择择实实验验中中，选选择择压压力力的的施施加加方方式式对对最终的选择效果可能没有什么影响。最终的选择效果可能没有什么影响。q但但在在另另一一些些情情况况下下，选选择择压压力力的的施施加加方方式式直直接接影影响到选择的成败。响到选择的成败。3.4.3细胞诱变细胞诱变v诱诱变变是是指指通通过过各各种种诱诱变变剂剂的的作作用用，使使细细胞胞发发生生变变异异的的过过程程。是是获获得得优优良良植植物物细细胞胞的的有有效效方法之一。方

32、法之一。v常常用用的的诱诱变变剂剂有有物物理理诱诱变变剂剂和和化化学学诱诱变变剂剂两两种。种。q物物理理诱诱变变剂剂：包包括括X射射线线、射射线线、中中子子、粒粒子子、粒粒子子、紫紫外外线线等等。紫紫外外线线的的能能量量较较低低，不不能能引引起起被被照照射射物物质质离离子子化化，因因而而叫叫做做非非电电离离诱诱变变因因子子，其其余余物物理理诱诱变变剂剂均均称称为为电电离离诱诱变因子。变因子。q物理诱变剂处理方法：外照射；内照射。物理诱变剂处理方法：外照射；内照射。物理诱变剂物理诱变剂q外外照照射射，即即射射线线由由被被照照射射物物质质的的外外部部透透入入内内部部诱诱发发突变。又分为急照射和慢照

33、射。突变。又分为急照射和慢照射。q内内照照射射，即即放放射射源源引引入入到到植植物物组组织织或或细细胞胞内内使使其其放放出出射射线线诱诱发发突突变变。常常用用的的方方法法有有浸浸泡泡法法、注注射射法法和和饲入法。饲入法。q化化学学诱诱变变剂剂：根根据据对对DNA的的作作用用特特点点，主主要要分分三三类类，包包括括碱碱基基类类似似物物、烷烷化化剂剂、叠叠氮氮化化合合物物。此此外外一一些些抗抗菌菌素素也也可可作作为诱变剂。为诱变剂。q在在DNA复制时，诱发配对错误。复制时，诱发配对错误。如如5-溴尿嘧啶。溴尿嘧啶。q诱诱发发染染色色体体断断裂裂。如如马马来来酰酰阱阱、重重氮氮比比氨氨酸酸、丝丝裂裂

34、霉霉素素C、链霉素链霉素C等。等。q改改变变DNA的的化化学学结结构构：甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯、叠叠氮氮化化钠钠、亚亚硝硝基胍等。基胍等。化学诱变剂化学诱变剂诱变的基本过程诱变的基本过程单细胞制备单细胞制备预培养预培养诱发突变诱发突变筛选突变株筛选突变株材料的选择材料的选择预处理预处理细胞材料的制备细胞材料的制备制备细胞悬浮液制备细胞悬浮液（一）制备单细胞（一）制备单细胞q用用于于突突变变体体筛筛选选的的最最理理想想的的材材料料是是单单细细胞胞或或原原生生质质体体，也也可可用用茎茎尖尖、腋腋芽芽等等。目前用得最多的材料是愈伤组织。目前用得最多的材料是愈伤组织。材料的选择材料的选择q采用诱变剂

35、进行化学诱变处理。采用诱变剂进行化学诱变处理。根根据据植植物物种种类类需需对对诱诱变变剂剂的的含含量量、时时间间进进行行筛筛选选，选选用用最最适适含含量量、最最适适处处理理时时间才能收到良好的效果。间才能收到良好的效果。预处理预处理q分分离离植植物物器器官官、诱诱导导形形成成愈愈伤伤组组织织、液液体体培培养养基基中中继继代代培培养养，获获得得小小细细胞胞团团和和单单细胞的悬浮培养物。细胞的悬浮培养物。q或或从从器器官官或或细细胞胞培培养养物物游游离离出出单单个个原原生生质体。质体。细胞材料的制备细胞材料的制备q经经预预处处理理的的材材料料用用糖糖液液洗洗净净备备用用。经经过过过过滤滤、离离心心

36、沉沉降降，最最后后获获得得纯纯净净的的细细胞胞悬浮液。悬浮液。制备细胞悬浮液制备细胞悬浮液（二）预培养（二）预培养q单单细细胞胞或或愈愈伤伤组组织织经经诱诱变变剂剂和和酶酶处处理理后后活活力下降，必须进行预培养。力下降，必须进行预培养。q可采用平板培养法，也可采用悬浮培养法。可采用平板培养法，也可采用悬浮培养法。（三）诱发突变（三）诱发突变q诱诱发发突突变变一一般般采采用用平平板板培培养养法法，并并在在培培养养基基中中加加入入某某种种选选择择因因子子，长长时时间间饲饲喂喂培培养养植植物物细细胞胞，使使其其发发生生拟拟定定目目标标的的突突变变，反反复饲喂需数月时间。复饲喂需数月时间。q细细胞胞诱

37、诱变变处处理理指指用用各各种种物物理理或或化化学学的的诱诱变变因子处理细胞材料，使细胞发生突变。因子处理细胞材料，使细胞发生突变。（四）突变细胞的选择（四）突变细胞的选择q将将在在具具有有选选择择因因子子的的培培养养基基中中培培养养数数月月的的细细胞胞团团，转转入入不不加加选选择择因因子子的的培培养养基基中中培培养养，脱除选择因子。脱除选择因子。q数数周周后后，再再转转入入具具有有选选择择因因子子的的培培养养基基上上，培培养养数数周周后后选选择择能能旺旺盛盛分分裂裂的的细细胞胞团团（或或细细胞胞株株），说说明明该该细细胞胞团团具具有有抗抗某某种种选选择择因因子子的突变细胞株。的突变细胞株。q根

38、根据据期期望望筛筛选选的的突突变变体体特特性性，向向培培养养基基中中加加入入一一些些胁胁迫迫因因素素，如如病病菌菌毒毒素素、盐盐类类、除除莠莠剂剂、氨氨基基酸酸类类似似物物等等，把把细细胞胞接接种种到到这这些些培培养养基基上上培培养养，结结果果会会发发现现，多多数数正正常常细细胞胞不不能能生生长长而而死死亡亡，而而个个别别突突变变细细胞胞则则继继续续生生长长，形成细胞团。形成细胞团。（五）突变细胞的遗传分析和鉴定（五）突变细胞的遗传分析和鉴定q根根据据诱诱发发突突变变目目标标进进行行生生长长分分析析、细细胞胞学学观观察察、性状分析。性状分析。q突变后具备的特点：突变后具备的特点：1.离开选择压后变异表型保持稳定；离开选择压后变异表型保持稳定；2.自然变异表型发生频率低；自然变异表型发生频率低；3.突突变变体体中中具具有有相相应应变变化化了了的的基基因因产产物物或或生生理理生化代谢上的差异；生化代谢上的差异；4.变异表型能够通过有性繁殖遗传。变异表型能够通过有性繁殖遗传。突变细胞的主要类型突变细胞的主要类型q对对氨基酸和氨基酸类似物抗性氨基酸和氨基酸类似物抗性q抗病细胞突变体抗病细胞突变体q抗除草剂细胞突变体抗除草剂细胞突变体q植物抗盐细胞突变体植物抗盐细胞突变体q抗逆细胞突变体抗逆细胞突变体q高光效突变体高光效突变体q营养缺陷型细胞突变体营养缺陷型细胞突变体