植物学RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展.ppt

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1、LOGORNAi技术在植物功能技术在植物功能基因组学中的研究进展基因组学中的研究进展LOGOInterdactionvRNA干涉干涉(RNA interference,简称简称RNAi)是是指指一一些些小小的的双双链链RNA(double strand RNA,dsRNA)可可以以高高效效、特特异异的的阻阻断断体体内内特特定定基基因因表表达达,促促使使mRNA降降解解,诱诱使使细细胞胞表表现现出出特特定定基基因缺失的表型。因缺失的表型。vRNAi是是一一种种高高效效的的特特异异性性强强的的基基因因阻阻断断技技术术。可可以以快快速速分分析析靶靶基基因因的的功功能能，近近年年来来发发展展迅迅速速,

2、已已成成为为功功能能基基因因组组研研究究和和反反向向遗遗传传学学研研究究的的有有力力工工具具。RNAi技技术术被被Science杂杂志志评为评为2002年度的十大科技突破。年度的十大科技突破。LOGORNAi技术概述技术概述RNAi引起基因沉默的途径引起基因沉默的途径植物植物RNAi表达载体的构建表达载体的构建 RNAi技术在植物上的应用技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望存在问题与展望ContentsLOGORNAi技术概述技术概述1.1 RNAi的发现的发现1.2 RNAi的分子机制的分子机制1.3 RNAi作用的特点作用的特点LOGO1.1 RNAi的发现的发现v1995年,康乃尔

3、大学的Guo和Kempheus利用反义RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断线虫(C.elegans)中的par-1基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA(sense RNA)相反的结果，但结果却令他们费解：二者同样阻断了par-1基因的表达途径。v1998年,Fire和Mello等首次将正义链和反义链的混合物注入秀丽新小杆线虫,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默(gene silencing)。他们将这种现象称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)。LOGO1.2 RNAi的分子机制的分子机制v外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,产

4、生一些dsRNA。胞质中的核酸内切酶核酸内切酶Dicer将这些dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的短双链短双链RNA(大约大约2125 bp),即即siRNA。vsiRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,然后反义siRNA再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物诱导的沉默复合物(RISC)。vRISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,被切割后的断裂mRNA随即降解。LOGORNAi信号的放大信号的放大vsiRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在依赖依赖RNA的的RNA聚

5、合酶聚合酶(RNdependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。这是一种类似于RNA聚合酶的链式反应，该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RdRP作用下扩增靶mRNA，产生新的二级siRNAs(单链的具有明显极性的反义RNA)。在Dicer酶的作用下，这些二级siRNAs又能反作用于靶mRNA，使其降解，产生更多的siRNAs。LOGO1.3 RNAi作用的特点作用的特点v 高效性高效性 研究发现RNAi过程中不

6、同浓度的dsRNA产生的效果一样。Miki等研究水稻OsRac基因家族的功能时,通过构建单一基因片段的植物表达载体,成功地抑制了OsRac基因家族的多个基因。说明RNAi可实现在一个个体或一个细胞内同时沉默多个基因。v高度特异性高度特异性 由dsRNA诱导的RNAi只引起与dsRNA同源的mRNA降解,不影响其它基因的表达,具有很高的特异性。siRNA具有特征性的结构:5末端为磷酸基,3末端为羟基,并且有2个突出的单链核苷酸。这种结构对RNAi是十分必要的。vATP依赖性依赖性 研究发现,如果除去或降低内源性ATP含量,dsRNA对靶基因的抑制作用明显降低或消失,加入外源性ATP后,抑制作用仍

7、未加强。说明RNAi是一个对ATP依赖的过程,且外源性ATP对此无促进作用。v可传播性可传播性 在植物中,RNAi信号可以通过胞间连丝或维管组织在细胞间传递;而在动物中,RNAi信号的扩散需要特殊蛋白参与,在膜上形成跨膜通道而传播到整个机体。v可遗传性可遗传性 RNAi效应可以稳定的遗传给子代,在子代的表现型呈孟德尔遗传方式。LOGORNAi技术概述技术概述RNAi引起基因沉默的途径引起基因沉默的途径植物植物RNAi表达载体的构建表达载体的构建 RNAi技术在植物上的应用技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望存在问题与展望ContentsLOGO 转录后基因沉默（转录后基因沉默（PTGS）

8、转录水平基因沉默（转录水平基因沉默（TGS）翻译水平上基因沉默翻译水平上基因沉默（miRNA）RNAi引起引起基因沉默基因沉默的途径的途径LOGOv转录后基因沉默（转录后基因沉默（PTGS）转录后基因沉默是最普遍的一种沉默机制。PTGS通过降解mRNA来抑制基因的表达。包括几种现象:一种现象是植物中的共抑制(co-suppress)现象,即引起外源基因和靶基因或内源基因同时发生沉默,首次在矮牵牛中发现此现象。此外病毒侵染植物引起基因沉默也属于共抑制现象。另一种是真菌发生静息现象(quelling)。v转录水平基因沉默（转录水平基因沉默（TGS）它是由siRNA指导染色体发生变化(包括DNA和组

9、蛋白甲基化)是指启动子序列发生甲基化或局部染色体发生变化,影响转录因子的结合,使基因不能正常转录,下调基因表达。LOGOv翻译水平上基因沉默翻译水平上基因沉默 这个过程主要是由内源性miRNA介导的一种基因沉默。miRNA的前体(pre-miRNA)是70 nt的茎环RNA或双链RNA,它们在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作用下分裂成2125 bp的成熟miRNA。成熟的miRNA是具有约22 nt的5为单磷酸基、3为羟基的单链RNA。miRNA与相关蛋白质结合成另一种RISC复合体,RISC复合体通过和靶mRNA结合,从而导致mRNA的降解或抑制基因的转录。植物miRNAs明显特征是剪切

10、靶mRNA,如miR172,主要功能是作为翻译抑制子。LOGORNAi技术概述技术概述RNAi引起基因沉默的途径引起基因沉默的途径植物植物RNAi表达载体的构建表达载体的构建 RNAi技术在植物上的应用技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望存在问题与展望ContentsLOGO3 植物植物RNAi表达载体的构建表达载体的构建v3.1转基因转基因RNAi载体构建的关键因素载体构建的关键因素 在强组成型启动子下游插入反向重复片段的重组双在强组成型启动子下游插入反向重复片段的重组双元载体是导致元载体是导致RNA沉默的基本结构。在该载体中沉默的基本结构。在该载体中,目标目标基因的基因的cDNA片段

11、被克隆在间隔序列片段被克隆在间隔序列(spacer)的两端的两端,这这些片段通过头头相连或尾尾相连导致该转基因产生自我些片段通过头头相连或尾尾相连导致该转基因产生自我互补的互补的hpRNA(分子内分子内dsRNA)结构。结构。LOGO内含子有无内含子有无 在转录时通过拼接产生功能性间隔在转录时通过拼接产生功能性间隔(spacer)内含子在介导基因内含子在介导基因沉默比无功能性的内含子更有效。沉默比无功能性的内含子更有效。形成带有内含子的形成带有内含子的ihpRNA载体，载体，其沉默效率比其沉默效率比hpRNA高达高达90%以上。以上。启动子强弱启动子强弱 启动子强弱对于外源基因的表达水平有重要

12、的影响。启动子强弱对于外源基因的表达水平有重要的影响。CaMV 35S启动子已广泛应用于双子叶植物中启动子已广泛应用于双子叶植物中,但在水稻、小麦等禾本科植物但在水稻、小麦等禾本科植物中可用泛素中可用泛素Ubiquitin启动子等启动子等,以提高载体的干扰程度以提高载体的干扰程度。目的片段大小目的片段大小 目的片段大小的选择也十分重要。目的片段大小的选择也十分重要。Helliwell和和Waterhouse在构在构建载体时选择建载体时选择50 bp1 kb的目的片段都成功地导致了目的基因沉的目的片段都成功地导致了目的基因沉默。但是发现较短的片段效率较低默。但是发现较短的片段效率较低,较长的发夹

13、结构在寄主细菌中较长的发夹结构在寄主细菌中容易重组。容易重组。Helliwell建议采用建议采用300 bp600 bp大小的片段更容易大小的片段更容易获得比较有效的基因沉默。获得比较有效的基因沉默。LOGO3.2 RNAi载体构建的过程载体构建的过程v目的片段的克隆目的片段的克隆 以植株的DNA为模板,用带特定酶切位点的引物进行PCR扩增,然后将PCR产物克隆到T载体上v3.2.2 表达载体的构建表达载体的构建 正义基因片段和纯化的正义基因片段和纯化的质粒片段连接质粒片段连接 带有正义基因片段的质带有正义基因片段的质粒载体与反义片段连接粒载体与反义片段连接 双元表达载体双元表达载体 LOGO

14、RNAi技术概述技术概述RNAi引起基因沉默的途径引起基因沉默的途径植物植物RNAi表达载体的构建表达载体的构建 RNAi技术在植物上的应用技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望存在问题与展望ContentsLOGO4 RNAi技术在植物上的应用技术在植物上的应用4.4 植物品种植物品种改良中的应用改良中的应用4.3 植物雄性植物雄性不育的研究不育的研究4.2 植物抗病植物抗病性的研究性的研究4.1 植物基因植物基因功能的研究功能的研究LOGO4.1 植物基因功能的研究植物基因功能的研究vChuang等在花发育研究中采用等在花发育研究中采用RNAi技术进一步验证了技术进一步验证了AG,CL

15、V3,AP1,PAN等已知功能基因等已知功能基因,并开创了并开创了RNAi技术在技术在植物功能基因组学中的应用。植物功能基因组学中的应用。Fig.1.Gene constructs used to analyze dsRNA effects.LOGOFig.2.Flowers of wild-type,ag-1 and AG(RNAi)plants.Fig.4.Effects of AG dsRNA on levels of AG mRNA and AG proteinFig.3.Phenotypes of wild-type,CLV3(RNAi),and clv32 plants.Fig.5

16、.Effects of PANdsRNA on crc-1 transgenic plants.(AandD)crc-1.3452LOGORNAi在基因家族方面的研究在基因家族方面的研究vMiki等(2005)等将水稻OsRac基因家族的7个成员通过RNAi技术分别被特异抑制,把基因家族成员的3-非转译区(3-UTR)作为反向重复序列构建RNAi载体,其中3个成员被高效抑制。v同时将OsRac基因家族中高保守性强的序列构建RNAi载体,结果不同效率地抑制了所有成员基因的表达。这个结果显示RNAi技术在研究基因家族的有效性。LOGORNAi技术研究多倍体植物功能缺失技术研究多倍体植物功能缺失v研

17、究表明研究表明,在真菌、动物和植物中的在真菌、动物和植物中的RNAi是生物抵御病是生物抵御病毒侵染的一种古老的生理机制。毒侵染的一种古老的生理机制。vRichard等在四倍体植株中成功地运用了RNAi技术。用拟南芥着丝点甲基化相关的dsRNA对拟南芥的四倍体进行RNA干扰,发现拟南芥的四倍体中对应的着丝点脱甲基化,拟南芥四倍体中对应的与甲基化有关的mRNA含量水平剧减。v最近,Travella等在构建的PDS-RNAi和EIN1-RNAi的六倍体小麦转基因作物中,成功的抑制了目的基因。研究证明,RNAi技术是研究多倍体植物功能缺失突变很好的工具。LOGO4.2植物抗病性的研究植物抗病性的研究v

18、1998年年,首次报道首次报道RNAi技术在防治马铃薯技术在防治马铃薯Y病毒抗病的病毒抗病的应用应用,利用马铃薯利用马铃薯Y病毒病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建蛋白酶基因片段构建IRS载载体进行烟草转化体进行烟草转化,使植株完全免疫。使植株完全免疫。v根癌土壤杆菌根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的根引起的根癌病危害着许多多年生水果、坚果和观赏性植物。研究癌病危害着许多多年生水果、坚果和观赏性植物。研究发现发现iaaM和和ipt2个基因在这个疾病中起重要作用。采用个基因在这个疾病中起重要作用。采用RNAi技术技术,在拟南芥和番茄中沉默在拟南芥和番茄中沉默ia

19、aM和和ipt2个基因成个基因成功地抵抗了根癌病功地抵抗了根癌病。LOGO4.3植物雄性不育的研究植物雄性不育的研究 刘乐承等人采用刘乐承等人采用RNAi技术技术下调了白菜下调了白菜BcMF4基因的表达，基因的表达，导致了菜心转基因植株部分花粉导致了菜心转基因植株部分花粉的不育，证明的不育，证明BcMF4基因在普基因在普通白菜和菜心等白菜植物的花粉通白菜和菜心等白菜植物的花粉发育中起着重要作用发育中起着重要作用.Cigan等利用等利用RNAi技术直技术直接沉默玉米的花粉囊基因表达接沉默玉米的花粉囊基因表达的启动子的启动子MS45,从而抑制花粉从而抑制花粉囊的形成囊的形成,形成玉米的雄性不形成玉

20、米的雄性不育株育株;利用不同的启动子使已经利用不同的启动子使已经沉默的启动子沉默的启动子MS45重新表达重新表达,玉米植株重新恢复育性。玉米植株重新恢复育性。LOGO4.4植物品种改良中的应用植物品种改良中的应用v日本生物技术研究所使用RNA干扰花色素苷和类黄酮生物合成的关键酶查耳酮合成酶(CHS)基因,成功地将花由原先的蓝色转变为白色和粉色,创造了新的商品花卉。vOgita等利用RNAi抑制咖啡因合成酶(theobromine synthase)基因的表达,结果咖啡因含量降低了57成。vLiu(2002)等利用RNAi技术对棉籽油的成分进行改良,应用RNAi技术下调两个主要脂肪酸脱氢酶基因的

21、表达,从而将棉籽油中的高油酸和高硬脂含量水平降低.v利用RNAi通过敲除22kD玉米贮藏蛋白的表达，培育出高赖氨酸玉米品种(segaletal.，2003)。vGanga等(2005)采用果实特异启动子结合RNAi技术来抑制番茄内源光形态建成调节基因DET1的表达,结果类胡萝卜素和类黄酮含量明显升高,而果实的其它品质参数没有发生大的改变。表明利用器官特异基因的沉默可以改善植物营养品质。LOGORNAi技技术作作为一种便捷一种便捷实用的基因用的基因组研究方法研究方法,预示着一个示着一个崭新的新的RNA时代即将来代即将来临。RNAi技术将有助于人们更深技术将有助于人们更深入完整地认识和了解作物的生长发入完整地认识和了解作物的生长发育现象育现象,揭示作物生长发育的内在揭示作物生长发育的内在规律和分子基础规律和分子基础,调控作物有益性调控作物有益性状的高效表达状的高效表达,使有害基因处于沉使有害基因处于沉默状态默状态,这对于加速分子育种技术这对于加速分子育种技术在作物育种上的应用在作物育种上的应用,加快选育抗加快选育抗病、抗虫、抗逆、高产、优质等各病、抗虫、抗逆、高产、优质等各种不同育种目标的新品种具有重要种不同育种目标的新品种具有重要的意义。的意义。5 RNAi存在存在问题与展望与展望LOGO