植物细胞工程课件第五章细胞融合.ppt

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1、细胞融合细胞融合CellFusion细细 胞胞 工工 程程电电 子子 课课件件华华中中农农业业大大学学生生命命科科学学技技术术学学院院细胞融合的概念与意义细胞融合的概念与意义融合细胞的制备融合细胞的制备细胞融合的方法细胞融合的方法融合细胞的选择与鉴定融合细胞的选择与鉴定主主要要内内容容番番茄茄薯薯多多利利白菜白菜甘蓝甘蓝5.1细胞融合的概念与意义细胞融合的概念与意义细胞融合（细胞融合（cellfusion）即即细细胞胞杂杂交交（cellhybridization），在在外外力力（诱诱导导或或促促融融剂剂）作作用用下下，两两个个或或两两个个以以上上的的细细胞胞或或原原生生质质体体相相互互接接触触

2、，从从而而发发生生膜膜融融合合、胞胞质质融融合合和和核核融融合合并并形形成成杂杂种种细细胞胞的的现现象。象。细胞接触细胞接触膜融合膜融合胞质融合胞质融合对称杂种对称杂种（symmetrichybrid）非对称杂种非对称杂种（asymmetrichybrid）胞质杂种胞质杂种(cybrid)对称融合对称融合（symmetricfusionsymmetricfusion）非对称融合非对称融合（a asymmetricfusionsymmetricfusion）用用于于细细胞胞核核或或细细胞胞质质失失活活的的方方法法分分为为物物理理和和化化学学两两大类：大类：o物物理理方方法法常常采采用用射射线线处

3、处理理，如如X X射射线线、r r射射线线等等，它们能使细胞核失活；它们能使细胞核失活；o化学处理目前常用的试剂有：化学处理目前常用的试剂有：O核失活碘乙酰胺（核失活碘乙酰胺（IOAIOA）、碘乙酸）、碘乙酸(IA)(IA)；O质质失失活活罗罗丹丹明明（R-6-GR-6-G）。R-6-GR-6-G是是一一种种亲亲脂脂染染料料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。o对对称称杂杂种种：亲亲本本双双方方原原生生质质体体完完全全融融合合在在一一起起，相相互互之之间间未未发发生生排排斥斥，杂杂种种的的体体细细胞胞染染色色体体数数目目为为双双亲亲之之

4、和和，其其外外部部形形态态呈呈中中间间类型。类型。结结果果在在导导入入有有用用基基因因的的同同时时，也也带带入入了了亲亲本本的的全全部部不不利利基基因因（或或性性状状），一一个个杂杂种种中中有有两两套套不不尽尽相相关关的的基基因因并并不不是是试试验验所所期期望望的的，这这样样常常导导致致部部分分或或完完全全不不育育，因因而而难难以以形成育种上的有用材料。形成育种上的有用材料。o不不对对称称杂杂种种：亲亲本本双双方方原原生生质质体体发发生生部部分分融融合合，或或发发生生了了融融合合，但但融融合合体体在在分分裂裂过过程程中中一一方方的的部部分分核核或或质质被被排排斥斥，因因而而其其体体细细胞胞染染

5、色色体体数数目目达达不不到到双双亲亲之之和和。其其外外部部形形态态呈呈双双亲亲的的中中间间型型或或偏偏一一方方形形态态，一一般般表表现现为为雄雄性性器器官官退退化化，正常花粉粒极少，育性低。正常花粉粒极少，育性低。o胞胞质质杂杂种种：携携带带一一个个亲亲本本的的核核和和两两个个亲亲本本的的细胞质。细胞质。细胞融合的意义细胞融合的意义实现远缘遗传重组实现远缘遗传重组创造新的遗传型创造新的遗传型转移抗逆性状，改良作物品质转移抗逆性状，改良作物品质通过原生质体融合转移细胞质基因控制通过原生质体融合转移细胞质基因控制的性状的性状植植物物next 第一个体细胞杂种第一个体细胞杂种 (Carlson(Ca

6、rlson，1972)1972)第一个第一个属间体细胞杂种属间体细胞杂种PomatoPomato （MelchersMelchers，19781978）禾本科禾本科 eg.籼稻与野生稻籼稻与野生稻木本植物木本植物eg.柑橘柑橘PotatoTomatoPomato+据据不不完完全全统统计计，通通过过体体细细胞胞杂杂交交至至少少已已获获得得4444个个种种内内，103103个个同同属属异异种种，4848个个属属间间，5 5个个科科间间的的细细胞胞杂杂种种，其其中中非非对对称称融融合合的的体体细胞杂种在细胞杂种在90%90%以上。（李杰等，以上。（李杰等，20032003）19801980年年，Bu

7、tenkoButenko、KuchkoKuchko获获得抗得抗Y Y病毒的马铃薯杂种植株。病毒的马铃薯杂种植株。中中国国农农业业科科学学院院烟烟草草研研究究所所得得到到品品质质优优良良、兼兼抗抗多多种种病病害害的的烟烟草新品系。草新品系。用用于于单单克克隆隆抗抗体体、核核酸酸疫疫苗苗制制备备，为为大大规规模模生生产产特定生物制品培育种子细胞。特定生物制品培育种子细胞。动动物物个个体体克克隆隆，培培育育动动物物新新品品种种，使使牲牲畜畜迅迅速速实实现良种化。现良种化。在在基基础础理理论论研研究究上上动动物物细细胞胞融融合合技技术术对对研研究究细细胞胞分分化化、基基因因定定位位、肿肿瘤瘤发发生生机

8、机制制与与诊诊治治等等方方面都有重要意义。面都有重要意义。细胞融合的意义细胞融合的意义动动物物TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodiesGeorgesJ.F.KoehlerFederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunologyBasel,Switzerlandb.1946d.1995CarMilsteinArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofM

9、olecularBiologyCambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)d.20025.2融合细胞的制备融合细胞的制备5.2.1植物原生质体的制备植物原生质体的制备原生质体原生质体(protoplast)除除去去细细胞胞壁壁的的细细胞胞或或是是说说一一个个被被质质膜膜所所包包围围的的裸裸露细胞。露细胞。Isolated protoplasts have been described as naked cells because the cell wall has been removed by either a mechanic

10、al or an enzymatic process.In the isolated protoplast the outer plasma membrane is fully exposed.18801880年，年，HansteinHanstein首次起用首次起用原生质体原生质体(protoplast)(protoplast)一词。一词。亚原生质体亚原生质体(subprotoplast)核质体核质体(nuclearplast)胞质体（胞质体（cytoplast）原原生生质质体体的的分分离离基础材料准备基础材料准备预处理与酶解预处理与酶解原生质体活力测定原生质体活力测定原生质体收集与纯化原生质

11、体收集与纯化用于分离原生质体的材料准备用于分离原生质体的材料准备 无菌试管苗叶片无菌试管苗叶片子叶和下胚轴子叶和下胚轴愈伤组织和培养细胞愈伤组织和培养细胞 预处理及酶解预处理及酶解 酶的种类酶的种类v纤维素酶（纤维素酶（Cellulase）v半纤维素酶（半纤维素酶（Hemicellulase）v果胶酶（果胶酶（Pectinase）v溶剂：原生质体培养基或特殊配制。溶剂：原生质体培养基或特殊配制。v渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。醇等。酶溶剂及其渗透压酶溶剂及其渗透压 酶处理酶处理 酶解温度酶解温度酶浓度酶浓度酶解时间酶解时间原生质体游离原生质体游离 沉

12、淀法沉淀法 原生质体的收集和纯化原生质体的收集和纯化 飘浮法飘浮法 界面法界面法采用漂浮法分离形成的原生质体带0.6ml含原生质体含原生质体悬浮液悬浮液12ml0.45mol/L甘露醇甘露醇400g5min0.45mol/L蔗糖蔗糖碎片带碎片带（比原生（比原生质体轻）质体轻）含原生质体带含原生质体带以柑桔为例以柑桔为例25%蔗糖溶液蔗糖溶液13%甘露醇溶液甘露醇溶液果胶酶果胶酶纤维素酶纤维素酶过滤、离心过滤、离心 原生质体活力测定原生质体活力测定目测法目测法在显微镜下观察，在显微镜下观察，根据细胞形态、流根据细胞形态、流动性确定原生质体动性确定原生质体活力。活力。FDAFDA（二乙酸荧光素）法

13、（二乙酸荧光素）法 机理？机理？有活力的有活力的Protoplast发荧光发荧光无活力的无活力的Protoplast被染色被染色伊凡蓝法伊凡蓝法 机理？机理？影响原生质体影响原生质体活力的因素活力的因素分离材料的分离材料的生理状态生理状态酶解条件酶解条件酶质量、浓度、酶质量、浓度、酶解温度、酶酶解温度、酶解时间、酶溶解时间、酶溶液的渗透压液的渗透压分离条件分离条件离心次数、离离心次数、离心速度、纯化心速度、纯化方法、分离持方法、分离持续时间续时间环境条件环境条件操作环境的温操作环境的温度、分离用具度、分离用具的影响的影响5.2.2动物单细胞的制备动物单细胞的制备 用用胰胰蛋蛋白白酶酶、机机械械

14、法法或或二二者者兼兼用用来来分分离离细细胞胞，对对其其进进行行单单层层或或悬悬浮浮培培养养，获获得得单单个个分分散的细胞。散的细胞。自发融合自发融合诱发融合诱发融合NaNONaNO3 3高高pH-pH-高高CaCa离子离子仙台病毒仙台病毒PEGPEG电场电场5.3细胞融合的方法细胞融合的方法5.3.1生物融合法生物融合法-仙台病毒仙台病毒法法病毒类是研究得最早的促融剂病毒类是研究得最早的促融剂疱疱疹疹病病毒毒、天天花花病病毒毒、副副流流感感型型病病毒毒、副副黏黏液液病病毒毒等等致致癌癌、致致病病病毒，都能诱导细胞融合病毒，都能诱导细胞融合毒性大，应用受到限制毒性大，应用受到限制德国生理学家德国

15、生理学家 Johannes Mller Johannes Mller 1801-1858 1801-1858 1958年年，日日 本本 学学 者者 冈冈 田田 善善 雄雄（Okada）发发现现了了HVJ病病毒毒可可促促进细胞融合。进细胞融合。仙仙台台病病毒毒（HVJ）毒毒力力低低，对对人人的危害小的危害小易易被被紫紫外外线线或或丙丙炔炔内内酯酯所所灭灭活活日本学者日本学者OkadaOkada诱导细胞融合的不诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的是仙台病毒内部的RNA，而是它的外，而是它的外膜。膜。不不同同细细胞胞融融合合速速度度不不同同，快快的的370C中中5min即可。即可。细胞的融合与病毒的数量

16、、温度有关。细胞的融合与病毒的数量、温度有关。每一细胞必须有足够数量的病毒颗粒附在细每一细胞必须有足够数量的病毒颗粒附在细胞膜上，细胞才能凝集。胞膜上，细胞才能凝集。融合要在较高的温度中进行，一般是融合要在较高的温度中进行，一般是370C。融合成本低，勿需特殊设备；融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。融合过程不受物种限制。5.3.2化学融合法化学融合法-PEG法法PEG诱导融合的特点诱导融合的特点桥梁桥梁PEG被洗掉被洗掉+-+-+-+-电荷重排电荷重排原生质体膜接触原生质体膜接触融合融合+-+-+-+-+-+-PEG的的作作用用机机

17、理理 融合液融合液：CaCl22H2O810mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇甘露醇或山梨醇0.51.0molpH5.6诱导液诱导液：融合液融合液PEG2045稀释液稀释液：A液（液（g/100ml）pH6.0B液（液（g/100ml）pH10.5葡萄糖葡萄糖7.21甘氨酸甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.169P1P2P1P2 混合静止混合静止1min.融融合合融合液融合液加入加入PEG稀稀释释洗洗涤涤加入稀加入稀释释液液加入培养基加入培养基培培养养选选择择洋葱根尖原生质体洋葱根尖原生质体（40）烟草叶肉原生质体烟草叶肉原生质体 （4040）烟草叶肉细胞和洋

18、葱根烟草叶肉细胞和洋葱根尖细胞原生质体融合尖细胞原生质体融合烟草叶肉和洋葱根尖细烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合胞原生质体的异源融合 PEG融合的融合的影响因素影响因素原生质体的原生质体的群体密度群体密度PEG的相对的相对分子量与含量分子量与含量Ca2+浓度浓度和和pH值值融合液的渗融合液的渗透压和温度透压和温度培养时间培养时间其他其他-的原生的原生质体悬浮液形成质体悬浮液形成的异核体频率最的异核体频率最高。高。PEG6000效果较效果较好；含量以好；含量以-较为适较为适宜。宜。Ca2+可提高可提高PEG诱导频率；同时诱导频率；同时与与pH值相关。值相关。甘露醇浓度为甘露醇浓度为0.4

19、mol/L0.7mol/L范围内。保温温度范围内。保温温度一般在一般在C左右。左右。NO3-/NH4+;与与DMSO并用并用异核发生率第异核发生率第四天达高峰，四天达高峰，之后下降。之后下降。电电融融合合法法（electrofusiontechnique）是是20世世纪纪80年年代代发发展展起起来来的的细细胞胞融融合合技技术术，以以电降解及双向电泳的联合作用为基础。电降解及双向电泳的联合作用为基础。5.3.3物理融合法物理融合法-电融合法电融合法电融合过程的分子机制电融合过程的分子机制+-+-+-+-+-+-负极负极正极正极+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+

20、-+-+-烟草原生质体（烟草原生质体（40）原生质体成串（原生质体成串（40）原生质体融合原生质体融合电融合仪的结构特点电融合仪的结构特点交变电场部分交变电场部分高频直流电击部分高频直流电击部分电融合的电融合的影响因素影响因素基因型基因型原生质体原生质体的密度的密度Ca2+浓度浓度交变电场交变电场强度强度直流高电直流高电压脉冲压脉冲电融合法的优点：电融合法的优点：融合技术操作简便。融合技术操作简便。不存在对细胞的毒害问题；不存在对细胞的毒害问题；融合效率高；融合效率高；其他方法其他方法激光诱导细胞融合法激光诱导细胞融合法空间细胞融合技术空间细胞融合技术离子束细胞融合技术离子束细胞融合技术5.4

21、融合细胞的选择与鉴定融合细胞的选择与鉴定细胞融合的方式细胞融合的方式细胞融合的产物细胞融合的产物自体融合自体融合异体融合异体融合同核体（同核体（homokaryonhomokaryon）异核体（异核体（heterokaryonheterokaryon）5.4.1动物融合细胞的选择培养技术动物融合细胞的选择培养技术方方法法细胞的形态大小细胞的形态大小细胞繁殖细胞繁殖状态上的差异状态上的差异融合细胞对温度、药物的融合细胞对温度、药物的敏感性、营养要求不同等敏感性、营养要求不同等次黄嘌呤鸟嘌呤次黄嘌呤鸟嘌呤核糖磷酸转移酶核糖磷酸转移酶缺失型细胞株缺失型细胞株（含有次黄嘌呤含有次黄嘌呤H，氨基喋呤，氨

22、基喋呤A和胸腺嘧啶和胸腺嘧啶T）HGPRG-otherHAT培养基培养基次黄嘌呤胸腺嘧次黄嘌呤胸腺嘧啶核糖磷酸转移啶核糖磷酸转移酶缺失型细胞株酶缺失型细胞株（含有次黄嘌呤（含有次黄嘌呤H，氨基喋呤，氨基喋呤A和和5-甲基脱氧胞苷甲基脱氧胞苷M）HGPRT-dcD-HAM培养基培养基植物体细胞杂交过程示意图植物体细胞杂交过程示意图(1)(1)(2)(3)(4)(5)5.4.2植物体细胞杂种选择与鉴定植物体细胞杂种选择与鉴定杂种细胞杂种细胞选择系统选择系统形态特征选择形态特征选择互补选择互补选择荧光标记选择荧光标记选择生长特性选择生长特性选择next形态特征选择（形态特征选择（morphology

23、traitselection)根根据据细细胞胞或或原原生生质质体体的的大大小小、颜颜色色、漂漂浮浮密密度度、电电泳泳迁迁移移速速率率、细细胞胞繁繁殖殖状状态态上上的的差异等进行选择。差异等进行选择。大豆下胚轴大豆下胚轴原生质体原生质体烟草叶肉烟草叶肉原生质体原生质体一半含有叶绿素，一半含有叶绿素，另一半含淀粉粒另一半含淀粉粒补充糖补充糖生长特性选择（生长特性选择（growthtraitselection)eg1.粉蓝烟草粉蓝烟草郎氏烟草郎氏烟草无生长素无生长素Carlson，1972eg2.互补选择（互补选择（complenetary selectioncomplenetary selecti

24、on）v 抗抗性性互互补补（resistande resistande complenetary complenetary selection)selection)v 营营 养养 缺缺 陷陷 型型 互互 补补（auxotroph auxotroph complemetary selectioncomplemetary selection）v 遗遗 传传 互互 补补（genetic genetic complemetary complemetary selectionselection）Nicotiana sylvestrisNicotiana knightiana抗卡那霉素、抗卡那霉素、失去再

25、生植失去再生植株能力株能力有生长有生长Callus能力、但从未能力、但从未形成植株形成植株卡那霉素卡那霉素eg1.eg2.两两个个不不同同类类型型的的硝硝酸酸还还原原酶酶缺缺失失突突变变体体烟烟草草融融合合，二二亲亲本本均均不不能能在在在在硝硝酸酸盐盐为为唯唯一一氮氮源源的的培培养养基基上上生生长长，而而杂杂种种细细胞则可以生长（胞则可以生长（Glimelius，1978）。）。荧光标记选择荧光标记选择：亲本标记不同荧光：亲本标记不同荧光eg.异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素（FITC）和和异异硫硫氰氰酸酸罗罗丹明（丹明（RITC）分别发出绿色和红色）分别发出绿色和红色2体细胞杂种的鉴定体细胞杂种的鉴定形态鉴定形态鉴定细胞学鉴定细胞学鉴定生化鉴定生化鉴定分子鉴定分子鉴定根据双亲的形根据双亲的形态学性状观察态学性状观察进行鉴定。进行鉴定。细胞器鉴定、细胞器鉴定、染色体鉴定。染色体鉴定。同功酶鉴定。同功酶鉴定。RFLP鉴定、鉴定、RAPD标记鉴标记鉴定。定。18条染色体条染色体36条染色体条染色体RAPD带型带型RAPD带型带型思考题思考题原生质体定义原生质体定义原生质体分离、纯化方法原生质体分离、纯化方法原生质体融合方法及原理原生质体融合方法及原理原生质体融合的意义原生质体融合的意义体细胞杂种鉴定方法体细胞杂种鉴定方法体细胞杂种应用实例体细胞杂种应用实例