植物细胞制药精选课件.ppt

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1、关于植物细胞制药第一页，本课件共有86页第一节第一节 概述概述第二节第二节 植物细胞的形态和生理特性植物细胞的形态和生理特性第三节第三节 植物细胞培养的基本技术植物细胞培养的基本技术第四节第四节 影响植物次级代谢产物累积的因素影响植物次级代谢产物累积的因素第五节第五节 植物细胞培养的生物反应器植物细胞培养的生物反应器第六节第六节 进展与展望进展与展望第二页，本课件共有86页第一节 概述高等植物次级代谢产物极其丰富多样，除药用之高等植物次级代谢产物极其丰富多样，除药用之外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料。重要原料。人们通过研究，一

2、方面通过化学合成的方法来人们通过研究，一方面通过化学合成的方法来生产，另一方面通过植物细胞培养方法来生产。目生产，另一方面通过植物细胞培养方法来生产。目前已经研究过的近前已经研究过的近300种植物细胞培养物可以生产种植物细胞培养物可以生产400多种人们感兴趣的成分。多种人们感兴趣的成分。第三页，本课件共有86页一、基本概念一、基本概念1.植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度）下，研究植物的（培养基）及环境条件（光照、温度）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术

3、。细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。第四页，本课件共有86页植物无菌培养技术分如下几类：植物无菌培养技术分如下几类：幼苗及较大植株的培养，即为幼苗及较大植株的培养，即为植物培养（植物培养（plant culture）；）；从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养叫做织的培养叫做“愈伤组织培养愈伤组织培养”（callus culture）；）；能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养，称为液体培养，称为“悬浮培养悬浮培养”（suspension culture）；）；第五页，本课件共有86

4、页离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养，称为未成熟果实的培养，称为“器官培养器官培养”（organ culture）；）；未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为“胚胚胎培养胎培养”（embryo culture）。）。第六页，本课件共有86页2.悬浮培养悬浮培养悬浮培养悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分散是指在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件下组性的细胞和小的细胞聚集体的培养。

5、在此培养条件下组织化水平较低。织化水平较低。3.细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞养，诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。无性繁殖系。第七页，本课件共有86页4.分生组织培养分生组织培养分生组织培养（分生组织培养（meristem culture）又称生长锥培又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不织，如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超过超

6、过0.1mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，的快速繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组织，通常包括而是利用较大的茎尖组织，通常包括12个叶原基。个叶原基。第八页，本课件共有86页5.外植体外植体外植体（外植体（explant）是指用于植物组织（细胞）培养是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织

7、培养。进行组织培养。第九页，本课件共有86页6.器官形成器官形成器官形成（器官形成（organogenesis）一般是指在组织培养或一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽或根之后，再形成维管组织而将二者连成同部位分别形成芽或根之后，再形成维管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株。如果培养过程中小植株的发生途一个轴，最后形成小植株。如果培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极为近似

8、时，通常称为径与正常的受精卵发育方式极为近似时，通常称为胚胎形成胚胎形成（embryogenesis）。）。当在体细胞或花药培养中培养物当在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的是小孢子这样的 单倍体细胞，其所形成的胚胎结构叫做单倍体细胞，其所形成的胚胎结构叫做“胚状体胚状体”（embryoid，或，或 embryo-like）或或“不定胚不定胚”（adventitious embryo）。）。第十页，本课件共有86页无性繁殖系（无性繁殖系（clone）又叫克隆，是指使用母体培养又叫克隆，是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获

9、得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。养物无性系等。在上述无性系的培养中，有时其局部的组织无论在在上述无性系的培养中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体无性系的变异体”（clonal variant）。）。7.无性繁殖系无性繁殖系第十一页，本课件共有86页细胞本身发

10、生遗传变异或应用诱变处理发生的遗细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为传变异所得的新细胞，即为突变体（突变体（mutant）。）。由单由单细胞形成的无性系称为细胞形成的无性系称为“单细胞无性系单细胞无性系”；如果这种单如果这种单细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做叫做“单细胞变异体单细胞变异体”。8.突变体突变体第十二页，本课件共有86页由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为一代称为“第一代培养第一代培养”。连续多代的培养即为连续多代的培养即为“继继代培

11、养代培养”（subculture），），又称又称“连续培养连续培养”。但习惯。但习惯上上“连续培养连续培养”一词多用于不断加入新的培养基，一词多用于不断加入新的培养基，并连续收集培养物以保持平衡而进行的长期不转移并连续收集培养物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。的悬浮培养。9.继代培养继代培养第十三页，本课件共有86页10.次级代谢和次级代谢产物次级代谢和次级代谢产物人们把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及人们把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类（这些成分通常称为初级代谢产物）以外，具有如下特糖类（这些成分通常称为初级代谢产物）以外，具有如下特征的成分称为次级代谢产物：征

12、的成分称为次级代谢产物：有明显的分类学区域界限；有明显的分类学区域界限；其合成需在一定的条件下才能发生；其合成需在一定的条件下才能发生；缺乏明确的生理功能；缺乏明确的生理功能；是生命的多余成分。是生命的多余成分。第十四页，本课件共有86页现代定义现代定义：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。上述作用的物的合成、代谢及分解作用的综合体现。上述作用的结果导致了次级代谢产物的产生，如生物碱、黄酮体、结果导致了次级代谢产物的产生，如生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。萜类、有机酸、木质素等。第十五页，本课件共有86页二、植物细胞培养

13、的发展简史二、植物细胞培养的发展简史19世纪上半页，世纪上半页，Schleiden和和Schwann提出了细胞提出了细胞学说；学说；20世纪初，德国著名植物学家世纪初，德国著名植物学家Haber landt依据细胞依据细胞理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞的观点；割，直至单个细胞的观点；第十六页，本课件共有86页20世纪世纪20年代初至年代初至30年代，在胚胎培养和器官培年代，在胚胎培养和器官培养领域中取得了一些成果。养领域中取得了一些成果。Hanning首次在无机盐溶液首次在无机盐溶液及有机营养成分的培养基上成功地培养

14、了萝卜和辣根菜及有机营养成分的培养基上成功地培养了萝卜和辣根菜的胚，观察到离体胚均能正常发育，同时发现有促进提的胚，观察到离体胚均能正常发育，同时发现有促进提早萌发成苗的事实。早萌发成苗的事实。自此植物器官与营养需求之间关系研究、原生自此植物器官与营养需求之间关系研究、原生质体、培养基以及培养方法的研究获得了高度重视，质体、培养基以及培养方法的研究获得了高度重视，基因工程技术也被用于植物次级代谢产物的生产中。基因工程技术也被用于植物次级代谢产物的生产中。第十七页，本课件共有86页30年代末至年代末至40年代，研究工作主要集中在植物年代，研究工作主要集中在植物细胞器官与营养需求之间的关系上。细胞

15、器官与营养需求之间的关系上。Overbeek（1941）在曼陀罗幼胚的培养基中，以椰子乳作为附加）在曼陀罗幼胚的培养基中，以椰子乳作为附加物，发现幼胚可以成熟。在茎尖培养方面的最早物，发现幼胚可以成熟。在茎尖培养方面的最早研究工作，是从我国学者罗士韦（研究工作，是从我国学者罗士韦（1946）利用寄生）利用寄生植物菟丝子茎尖培养，观察到花的形成开始的。此研究植物菟丝子茎尖培养，观察到花的形成开始的。此研究对于后人用组织培养方法诱导花芽形成起到了积极作用。对于后人用组织培养方法诱导花芽形成起到了积极作用。第十八页，本课件共有86页40年代末至年代末至50年代，植物组织培养进入了一个崭年代，植物组织

16、培养进入了一个崭新阶段。新阶段。Skoog和我国学者崔澄在研究烟草茎段和髓和我国学者崔澄在研究烟草茎段和髓培养及其器官形成的工作中，发现腺嘌呤或腺苷能够培养及其器官形成的工作中，发现腺嘌呤或腺苷能够解除培养基中生长素（解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，）对芽形成的抑制作用，并诱导芽的形成，确定了腺嘌呤并诱导芽的形成，确定了腺嘌呤/生长素的比例是控生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。研究结果显示：该比制芽和根形成的主要条件之一。研究结果显示：该比例高时，产生芽；比例低时，则形成根。例高时，产生芽；比例低时，则形成根。Miller等等（1956）发现了激动素（）发现了激动素（

17、kinetin，KT），后来又发），后来又发现激动素亦可促进芽的形成，其效力约为腺嘌呤的现激动素亦可促进芽的形成，其效力约为腺嘌呤的30000倍。倍。1956年，年，Routie和和Nickell在一个专利中首在一个专利中首次提出利用细胞培养技术来生产有用的次级代谢产物。次提出利用细胞培养技术来生产有用的次级代谢产物。第十九页，本课件共有86页60年代初，年代初，Cocking等人首次利用真菌的纤维素酶等人首次利用真菌的纤维素酶成功地分离出植物的原生质体。成功地分离出植物的原生质体。Muraskign和和Skoog于于1962年开发了化学成分完备的生长培养基（年开发了化学成分完备的生长培养基（

18、Muraskign and Skoog Medium，MS培养基），为植物细胞培养及其培养基），为植物细胞培养及其次级代谢产物的生产奠定了坚实的基础。次级代谢产物的生产奠定了坚实的基础。60至至70年代中叶的主要工作是开发培养基和研究培养年代中叶的主要工作是开发培养基和研究培养方法，对植物细胞生理、生化代谢及生物反应器对植物细方法，对植物细胞生理、生化代谢及生物反应器对植物细胞生理状态的影响知之较少，而次级代谢产物产率低则是胞生理状态的影响知之较少，而次级代谢产物产率低则是制约商业化开发的主要障碍。制约商业化开发的主要障碍。第二十页，本课件共有86页1975至至1985年期间，科学家们主要进行

19、了优化细胞年期间，科学家们主要进行了优化细胞生长和次级代谢产物形成的研究，二者的结合，导致了硬生长和次级代谢产物形成的研究，二者的结合，导致了硬紫草两段培养法生产紫草宁及其衍生物的商业产品。紫草两段培养法生产紫草宁及其衍生物的商业产品。植物细胞工程在经历了植物细胞工程在经历了80年代后期的低潮以后，年代后期的低潮以后，90年代初又焕发了新的活力。科学家们进行了深入的年代初又焕发了新的活力。科学家们进行了深入的研究和开发工作，特别是应用了分子生物学技术。利研究和开发工作，特别是应用了分子生物学技术。利用红豆杉（用红豆杉（Taxus chinensis）细胞培养生产抗癌新药紫）细胞培养生产抗癌新药

20、紫杉醇（杉醇（taxol），是近年来推动本领域快速发展的热点），是近年来推动本领域快速发展的热点与动力，与动力，Phyton公司已在公司已在75000L反应器中利用红豆杉反应器中利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇，显示了光明的前景。细胞培养生产紫杉醇，显示了光明的前景。第二十一页，本课件共有86页第二节 植物细胞的形态和生理特征一、植物细胞的形态一、植物细胞的形态植物细胞的形态多种多样，随植物种类、存在植物细胞的形态多种多样，随植物种类、存在部位和功能的不同而异。部位和功能的不同而异。游离的或排列疏松的薄壁细胞多呈球形、类圆形游离的或排列疏松的薄壁细胞多呈球形、类圆形和椭圆形；排列紧密的细胞多呈角形

21、；具有支持作用和椭圆形；排列紧密的细胞多呈角形；具有支持作用的细胞，细胞壁常增厚，呈类圆形、纺锤形等；具有的细胞，细胞壁常增厚，呈类圆形、纺锤形等；具有输导作用的细胞则多呈管状。输导作用的细胞则多呈管状。第二十二页，本课件共有86页植物细胞大小不一。植物基本组织细胞体积较大，植物细胞大小不一。植物基本组织细胞体积较大，种子植物薄壁细胞的直径在种子植物薄壁细胞的直径在20100微米之间；储藏组织微米之间；储藏组织细胞的直径可达细胞的直径可达1mm。苎麻纤维一般为。苎麻纤维一般为200mm，有的，有的可达可达500mm以上。最长的细胞是无节乳管，长达数米至以上。最长的细胞是无节乳管，长达数米至数十

22、米不等。数十米不等。第二十三页，本课件共有86页二、植物细胞的结构特征二、植物细胞的结构特征根据典型细胞核的有无可将生物细胞分为原核细胞根据典型细胞核的有无可将生物细胞分为原核细胞（prokaryotic cell）和真核细胞（）和真核细胞（eukaryotic cell）。）。真核细胞有典型的、为双层膜所包被着的细胞核，原核细真核细胞有典型的、为双层膜所包被着的细胞核，原核细胞中只有类核（胞中只有类核（nucleoid）。类核没有核膜包被，常）。类核没有核膜包被，常常只有一条常只有一条DNA，其周围即为细胞质。高等植物的细，其周围即为细胞质。高等植物的细胞均为真核细胞。与动物细胞及微生物细胞

23、相比，植物胞均为真核细胞。与动物细胞及微生物细胞相比，植物细胞有细胞有3个特点，即具有细胞壁、液泡和质体（如叶绿体）个特点，即具有细胞壁、液泡和质体（如叶绿体）。第二十四页，本课件共有86页三、细胞后含物和生理活性物质三、细胞后含物和生理活性物质细胞中除含有生命的原生质体外，还有许多非生细胞中除含有生命的原生质体外，还有许多非生命的物质，它们均为细胞代谢过程中的产物。一类是后命的物质，它们均为细胞代谢过程中的产物。一类是后含物，系储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，如糖类含物，系储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，如糖类（saccharide）、盐类（）、盐类（salts）、生物碱、苷、有机酸、）

24、、生物碱、苷、有机酸、挥发油等；另一类为生理活性物质，对细胞内生化代谢和挥发油等；另一类为生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用，含量虽少，但其生理作用却非常生理活动起着调节作用，含量虽少，但其生理作用却非常重要，如酶、维生素、植物激素和抗生素等。重要，如酶、维生素、植物激素和抗生素等。第二十五页，本课件共有86页1.细胞后含物细胞后含物（1）生物碱）生物碱生物碱（生物碱（alkaloide）是一类含氮的有机化合物，广）是一类含氮的有机化合物，广布于植物界。含生物碱较多的植物科有：茄科、罂粟科、布于植物界。含生物碱较多的植物科有：茄科、罂粟科、小檗科、豆科、夹竹桃科等。按照植物化

25、学分类学的观小檗科、豆科、夹竹桃科等。按照植物化学分类学的观点，亲缘关系相近的植物，常含有化学结构相似的成分。点，亲缘关系相近的植物，常含有化学结构相似的成分。此外，一种植物所含的同一类成分中也经常存在多种化此外，一种植物所含的同一类成分中也经常存在多种化学成分，如人参中含有几十种人参皂苷。它们均属于三学成分，如人参中含有几十种人参皂苷。它们均属于三萜皂苷类成分。中草药中含有多种生物碱，如麻黄碱、萜皂苷类成分。中草药中含有多种生物碱，如麻黄碱、咖啡、阿托品、喹啉、黄连素等，其生理活性都很强。咖啡、阿托品、喹啉、黄连素等，其生理活性都很强。第二十六页，本课件共有86页（2）糖苷类）糖苷类糖苷（糖

26、苷（glucosides）是指某些有机化合物和糖经苷键）是指某些有机化合物和糖经苷键结合而成的化合物，例如黄酮苷是黄酮苷元和糖连接而成。结合而成的化合物，例如黄酮苷是黄酮苷元和糖连接而成。很多糖苷类化合物对疾病都有很好的治疗作用，如洋地黄很多糖苷类化合物对疾病都有很好的治疗作用，如洋地黄毒苷有强心作用；大黄中的蒽醌苷有强烈的泻下作用；紫毒苷有强心作用；大黄中的蒽醌苷有强烈的泻下作用；紫草中紫草宁是紫草中蒽醌类化合物的总称，除作为天然色草中紫草宁是紫草中蒽醌类化合物的总称，除作为天然色素（如口红）外，尚具有很好的抗癌活性。素（如口红）外，尚具有很好的抗癌活性。第二十七页，本课件共有86页（3）挥

27、发油）挥发油挥发油（挥发油（volatile oil）是一类具有芳香气味，在常温）是一类具有芳香气味，在常温下易于挥发的油类。在伞形科、姜科、唇形科等植物中多下易于挥发的油类。在伞形科、姜科、唇形科等植物中多有分布。很多挥发油可作药用，如薄荷油、丁香油、桉油有分布。很多挥发油可作药用，如薄荷油、丁香油、桉油等。等。（4）有机酸）有机酸有机酸（有机酸（organic acids）是糖类代谢的中间产物。）是糖类代谢的中间产物。植物果实中酸味以及细胞液的酸性反应，主要是由植物果实中酸味以及细胞液的酸性反应，主要是由于有机酸的存在。常见的植物有机酸有：苹果酸、于有机酸的存在。常见的植物有机酸有：苹果酸

28、、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。第二十八页，本课件共有86页2.生理活性物质生理活性物质（1）酶类）酶类生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。包括酶、维生素、植物激素动起调节作用的物质的总称。包括酶、维生素、植物激素和抗生素等。和抗生素等。酶（酶（enzymes）是一种有机催化剂。酶反应一般在常）是一种有机催化剂。酶反应一般在常温、常压、中性水溶液中进行，高温、强酸、强碱和某些温、常压、中性水溶液中进行，高温、强酸、强碱和某些重金属离子，会使其失活。重金属离子，会使其失活。第二十九页，本课件共有8

29、6页（2）维生素）维生素维生素（维生素（vitamin）是一类复杂的有机物，常参）是一类复杂的有机物，常参与酶的形成，对植物的生长、呼吸和物质代谢有调节与酶的形成，对植物的生长、呼吸和物质代谢有调节作用，如对难以生根的植物，用维生素作用，如对难以生根的植物，用维生素B12处理后可处理后可促进不定根的生长。促进不定根的生长。（3）植物激素）植物激素植物激素是植物细胞原生质体产生的一类复杂的调植物激素是植物细胞原生质体产生的一类复杂的调节代谢的有机物质，对生理过程（如细胞分裂和繁殖）产节代谢的有机物质，对生理过程（如细胞分裂和繁殖）产生作用，其量虽微，但作用甚大。生作用，其量虽微，但作用甚大。第三

30、十页，本课件共有86页（4）抗生素和植物杀菌素）抗生素和植物杀菌素抗生素（抗生素（antibiotic）是由微生物（如某些菌类植）是由微生物（如某些菌类植物）产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质，如物）产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质，如青霉素、链霉素等。高等植物如葱、蒜、辣椒、萝卜青霉素、链霉素等。高等植物如葱、蒜、辣椒、萝卜等也能产生杀菌的物质，称为植物杀菌素（等也能产生杀菌的物质，称为植物杀菌素（plant fungicidin）。）。第三十一页，本课件共有86页四、植物培养细胞的生理特性四、植物培养细胞的生理特性植物培养细胞不同生长阶段的持续时间及特征。植物培养细胞不同生长阶段

31、的持续时间及特征。延迟期（延迟期（lag phase）细胞分裂的初始期和最大生长期之间，其持续时细胞分裂的初始期和最大生长期之间，其持续时间取决于培养前的条件、时期和培养基性质，其特征间取决于培养前的条件、时期和培养基性质，其特征是细胞数量、干重近乎恒定，细胞壁厚度达最大；高是细胞数量、干重近乎恒定，细胞壁厚度达最大；高RNA含量；高蛋白质合成能力；高聚核糖体含量；有含量；高蛋白质合成能力；高聚核糖体含量；有丝分裂加速；增加细胞的细胞质部分。丝分裂加速；增加细胞的细胞质部分。第三十二页，本课件共有86页加速期（加速期（acceleration phase）细胞最大生长期和最大细胞浓度，最佳细胞

32、最大生长期和最大细胞浓度，最佳DNA浓度浓度和蛋白质累积率，持续时间和蛋白质累积率，持续时间34代，其特征为常数：代，其特征为常数：干重；增加：细胞数、干重；增加：细胞数、DNA和蛋白质浓度；减少：有和蛋白质浓度；减少：有丝分裂活性、丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力；增加细胞鲜含量和蛋白质合成能力；增加细胞鲜种、干重及种、干重及RNA酶活性。酶活性。第三十三页，本课件共有86页对数期（对数期（log phase）介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间，其，其特征为蛋白质合成能力减退；变化：聚核糖体浓度向有利特征为蛋白质合成能力减退；变化：聚核糖体

33、浓度向有利于单核糖体和寡核糖体形成的方向减少。于单核糖体和寡核糖体形成的方向减少。稳定期（稳定期（stationary phase）细胞数稳定，细胞数稳定，其特征为细胞高液泡化、极度脆弱、其特征为细胞高液泡化、极度脆弱、高度分化，有机化合物的浓度高。高度分化，有机化合物的浓度高。第三十四页，本课件共有86页由上所述可以知道，植物培养细胞重量的增加主要由上所述可以知道，植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的累积则主要在稳定期完取决于对数期，而次级代谢产物的累积则主要在稳定期完成。当然植物细胞与哺乳动物细胞及微生物细胞有很多的成。当然植物细胞与哺乳动物细胞及微生物细胞有很多的不容

34、，并由此导致了一系列生理生化等方面的差异，比如不容，并由此导致了一系列生理生化等方面的差异，比如混合与传质等。就植物细胞而言，它们很少以单一细胞悬混合与传质等。就植物细胞而言，它们很少以单一细胞悬浮生长，而多以非均相集合体的细胞团形式存在。根据细浮生长，而多以非均相集合体的细胞团形式存在。根据细胞系的来源、培养基及培养时间等的不同，细胞团的细胞胞系的来源、培养基及培养时间等的不同，细胞团的细胞数目在数目在2200 之间，直径为之间，直径为2mm左右。左右。第三十五页，本课件共有86页细胞团产生的原因有两个：（细胞团产生的原因有两个：（1）细胞分裂之后没）细胞分裂之后没有进行细胞分离；（有进行细

35、胞分离；（2）在间歇培养过程中细胞处于对）在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其它数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其它形式形成粘性表面，从而形成细胞团。形式形成粘性表面，从而形成细胞团。植物细胞形态上的另一特性，就是其纤维素细胞壁植物细胞形态上的另一特性，就是其纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切能使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切能力小，故传统的搅拌式生物反应器容易损坏植物细胞的细力小，故传统的搅拌式生物反应器容易损坏植物细胞的细胞壁。再者，植物细胞培养基黏度度比较高，且培养时间胞壁。再者，植物细胞培养基黏度

36、度比较高，且培养时间的延长，细胞数量呈指数上升。的延长，细胞数量呈指数上升。第三十六页，本课件共有86页所有的植物都是好气性的，因此培养过程中需所有的植物都是好气性的，因此培养过程中需要不断地供氧。但是，与微生物细胞相反，它并不需要不断地供氧。但是，与微生物细胞相反，它并不需要很高的气液传质速率，而是要控制供氧量，以保持要很高的气液传质速率，而是要控制供氧量，以保持较低的溶氧水平。此外，大多数植物细胞液体培养的较低的溶氧水平。此外，大多数植物细胞液体培养的pH为为57，在此，在此pH水平，通气速率过高会驱除二氧化水平，通气速率过高会驱除二氧化碳而抑制细胞生长，这个问题可通过在通气过程中加碳而抑

37、制细胞生长，这个问题可通过在通气过程中加入一定浓度的二氧化碳来解决。注意光照的影响。入一定浓度的二氧化碳来解决。注意光照的影响。第三十七页，本课件共有86页植物细胞液体培养过程中的泡沫问题不象微生物植物细胞液体培养过程中的泡沫问题不象微生物细胞培养时那么严重，泡沫的性质也不同。气泡比微细胞培养时那么严重，泡沫的性质也不同。气泡比微生物培养系统中的大，而且由于其含有蛋白质或粘多生物培养系统中的大，而且由于其含有蛋白质或粘多糖，黏度较大，细胞极易被包埋在泡沫中，并从循环糖，黏度较大，细胞极易被包埋在泡沫中，并从循环的营养液中带出来，这就造成了非均相培养，通常需的营养液中带出来，这就造成了非均相培养

38、，通常需要采用化学或机械的方法加以控制，否则，随着泡沫要采用化学或机械的方法加以控制，否则，随着泡沫和细胞数量的增加，混合和培养过程的稳定性就要受和细胞数量的增加，混合和培养过程的稳定性就要受到影响。到影响。第三十八页，本课件共有86页在植物细胞液体培养过程中，细胞可能会黏附在植物细胞液体培养过程中，细胞可能会黏附于培养的反应器壁、电极或挡板的表面上。细胞对表于培养的反应器壁、电极或挡板的表面上。细胞对表面的黏附及其在器壁上的生长特性，是人们目前正在面的黏附及其在器壁上的生长特性，是人们目前正在研究的重点课题之一。通过改变培养基中某些离子的研究的重点课题之一。通过改变培养基中某些离子的成分，可

39、使表面吸附问题得到一定程度的改善。成分，可使表面吸附问题得到一定程度的改善。第三十九页，本课件共有86页第三节 植物细胞培养的基本技术一、植物材料的准备一、植物材料的准备用于植物组织培养的外植体，必须是无杂菌材料。微用于植物组织培养的外植体，必须是无杂菌材料。微生物在接触培养基时会大量繁殖，抑制培养物的生长，因生物在接触培养基时会大量繁殖，抑制培养物的生长，因此需灭菌处理。此需灭菌处理。许多化学试剂均能作为表面灭菌剂使用，原则上应尽许多化学试剂均能作为表面灭菌剂使用，原则上应尽可能选择那些灭菌后易于除去或容易分解的时间试剂。可能选择那些灭菌后易于除去或容易分解的时间试剂。第四十页，本课件共有8

40、6页灭菌剂的选择和处理时间的长短取决于所用材料灭菌剂的选择和处理时间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性。对灭菌剂敏感的外植体的灭菌时间对试剂的敏感性。对灭菌剂敏感的外植体的灭菌时间不宜过长；而不敏感的，灭菌时间则可适当延长。经不宜过长；而不敏感的，灭菌时间则可适当延长。经常使用的灭菌剂如下表。常使用的灭菌剂如下表。灭菌剂灭菌剂使用浓度使用浓度/%去除难易程度去除难易程度灭菌时间灭菌时间/min效果效果次氯酸次氯酸 钙钙次氯酸钠次氯酸钠过氧化氢过氧化氢溴溴 水水硝硝 酸酸 银银氯氯 化化 汞汞抗抗 生生 素素9 100.5 53121210.11450mg/L易易易易最易最易易易较难较难较难较难

41、中中5305305152105302103060很好很好很好很好好好很好很好好好最好最好较好较好第四十一页，本课件共有86页组织（器组织（器官）官）灭菌步骤灭菌步骤备注备注灭菌前处理灭菌前处理灭菌灭菌灭菌后处理灭菌后处理种子种子纯酒精中浸纯酒精中浸10min，再用，再用无菌水漂洗无菌水漂洗100g/L次氯酸次氯酸钙浸钙浸2030min，再，再用用10g/L溴水溴水浸浸5min无菌水洗无菌水洗3次，次，在无菌水中发在无菌水中发芽；或无菌水芽；或无菌水洗洗5次，在湿无次，在湿无菌纸上发芽菌纸上发芽用幼根或幼芽发用幼根或幼芽发生愈伤组织生愈伤组织果实果实纯酒精漂洗纯酒精漂洗20g/L次氯酸次氯酸钠浸

42、钠浸10min无菌水冲洗，无菌水冲洗，再剖除内部组再剖除内部组织的种子织的种子获得无菌苗获得无菌苗茎切段茎切段自来水洗净，自来水洗净，再用酒精洗再用酒精洗20g/L次氯酸次氯酸钠浸钠浸530min无菌水洗无菌水洗3次次储藏器官储藏器官自来水自来水20g/L次氯酸次氯酸钠浸钠浸2030min无菌水洗无菌水洗3次，次，滤纸吸干滤纸吸干叶片叶片自来水，吸干，自来水，吸干，纯酒精纯酒精1g/L氯化汞浸氯化汞浸1min无菌水反复冲无菌水反复冲洗，滤纸吸干洗，滤纸吸干选取嫩叶、叶片选取嫩叶、叶片平放在琼脂上平放在琼脂上植物不同组织（器官）的灭菌时间和步骤植物不同组织（器官）的灭菌时间和步骤第四十二页，本课

43、件共有86页植物材料灭菌后，即可进行培养。接种的外植体的植物材料灭菌后，即可进行培养。接种的外植体的形状和大小要根据试验目的及具体情况而定。当然，如果形状和大小要根据试验目的及具体情况而定。当然，如果所用外植体细胞多时，得到愈伤组织的机会必然也多。如所用外植体细胞多时，得到愈伤组织的机会必然也多。如要定量研究愈伤组织，则不仅外植体的大小要一致，而且要定量研究愈伤组织，则不仅外植体的大小要一致，而且其形状及组织部位也应基本类似。进行这类培养研究常常其形状及组织部位也应基本类似。进行这类培养研究常常选用较大材料，如人参、胡萝卜或甜菜的贮藏根、马铃薯选用较大材料，如人参、胡萝卜或甜菜的贮藏根、马铃薯

44、的块茎等。的块茎等。第四十三页，本课件共有86页二、培养基及其组成二、培养基及其组成培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的无培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的无菌土壤，其特点是营养成分的可调控性。菌土壤，其特点是营养成分的可调控性。植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。有商品化的培养基可以购买。素等化学成分。有商品化的培养基可以购买。第四十四页，本课件共有86页1.无机盐无机盐基本培养基是由各种浓度的无机盐溶液组成的，这基本

45、培养基是由各种浓度的无机盐溶液组成的，这些无机盐又有些无机盐又有“大量元素大量元素”和和“微量元素微量元素”之分。大量之分。大量元素是指使用浓度大于元素是指使用浓度大于30mg/L时的无机元素，包括时的无机元素，包括N、S、P、K、Mg、Ca、Cl和钠，而微量元素是指浓度低于和钠，而微量元素是指浓度低于30mg/L的无机元素，如的无机元素，如Fe、B、Mn、I和和Mo，以及极微，以及极微量的量的Cu和和Zn。某些情况下，还可加入。某些情况下，还可加入Ni、Co和和Al。这。这些微量元素作为辅因子或对酶合成而言，都是必须的，如镍些微量元素作为辅因子或对酶合成而言，都是必须的，如镍对脲酶的合成就是

46、至关重要的。对脲酶的合成就是至关重要的。第四十五页，本课件共有86页2.碳源碳源植物细胞培养物通常均为异养细胞。因此人们经常使植物细胞培养物通常均为异养细胞。因此人们经常使用碳水化合物、肌醇作为碳源，有时也用甘油、乳糖和半用碳水化合物、肌醇作为碳源，有时也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得乳糖等化合物。有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得所需的能量，此所谓光自养培养物。在某些情况下，培养所需的能量，此所谓光自养培养物。在某些情况下，培养基固化剂也可作为补充能量和碳源之用。基固化剂也可作为补充能量和碳源之用。此外，某些天然提取物对愈伤组织的诱导和培养也此外，某些天

47、然提取物对愈伤组织的诱导和培养也有重要意义，如椰子乳（椰子的液体胚乳），常用浓度有重要意义，如椰子乳（椰子的液体胚乳），常用浓度为为10%；也可用；也可用0.5%的酵母提取物或的酵母提取物或5%10%的番茄汁等。的番茄汁等。第四十六页，本课件共有86页3.植物生长调节剂植物生长调节剂植物激素是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在植物激素是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（极低浓度（1 M）时即能调节植物的生育过程，并能）时即能调节植物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素只从合成部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素只限于天然产生的调节物质，到目前位置，已

48、发现植物限于天然产生的调节物质，到目前位置，已发现植物组织中可以形成组织中可以形成5种植物激素，即生长素、分裂素、赤种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。植物生长调节剂既包括人工合成霉素、脱落酸和乙烯。植物生长调节剂既包括人工合成的具有生理活性的化合物，也包括一些天然的化合物以的具有生理活性的化合物，也包括一些天然的化合物以及植物激素。及植物激素。第四十七页，本课件共有86页4.有机氮源有机氮源使用较多的有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）使用较多的有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）或各种氨基酸。有机氮源对细胞的早期生长有利，氨基酸或各种氨基酸。有机氮源对细胞的早期生长有利

49、，氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源的供应，但应注意的是的加入主要是为了代替或增加氮源的供应，但应注意的是苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸可通过灭活位于叶绿体和细胞质苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸可通过灭活位于叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有补上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。偿此灭活作用的能力。第四十八页，本课件共有86页5.维生素维生素植物细胞通常是维生素自养型的，但在大多数情植物细胞通常是维生素自养型的，但在大多数情况下，其自身合成的量均不能满足植物细胞的需要，况下，其自身合成的量均不能满足植物细胞的需要，即使是光合成活性细胞或组织也是如

50、此。故对大多数即使是光合成活性细胞或组织也是如此。故对大多数培养基而言，除了必需加入的培养基而言，除了必需加入的B族维生素（如族维生素（如B1、B6和和泛酸）外，通常还需加入一定量的生物素和肌醇，后者泛酸）外，通常还需加入一定量的生物素和肌醇，后者是构成磷酸肌醇（细胞膜脂质部分含磷酸肌醇是构成磷酸肌醇（细胞膜脂质部分含磷酸肌醇2%8%）极性端的部分。）极性端的部分。第四十九页，本课件共有86页三、培养方法三、培养方法植物细胞培养，按培养对象来说，可分为原生质体培植物细胞培养，按培养对象来说，可分为原生质体培养和单倍体细胞培养；按照培养基类型可分为固体培养和养和单倍体细胞培养；按照培养基类型可分