生化技术凝胶过滤精选课件.ppt

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1、关于生化技术凝胶过滤第一页，本课件共有70页 凝胶过滤是凝胶过滤是20C-60Y20C-60Y发展起来的一种分离纯化方法；发展起来的一种分离纯化方法；又称分子筛层析、排阻层析又称分子筛层析、排阻层析原理：原理：凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被阻挡在外部，从而使混合溶液中各而大分子物质却被阻挡在外部，从而使混合溶液中各种组分按种组分按分子质量不同分子质量不同进行筛分进行筛分特点：特点：设备设备简单，操作方便、重复性好、回收率简单，操作方便、重复性好、回收率高高用途：用途：分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等，分离纯化蛋白质、核酸、

2、多糖、激素等，测定测定蛋白质分子质量、样品的浓缩和脱盐等蛋白质分子质量、样品的浓缩和脱盐等 第二页，本课件共有70页目目 的的n掌握凝胶的分类和性质掌握凝胶的分类和性质n掌握凝胶过滤的基本原理掌握凝胶过滤的基本原理n熟悉凝胶过滤的操作与应用熟悉凝胶过滤的操作与应用第三页，本课件共有70页第一节第一节 凝胶的分类及性质凝胶的分类及性质 第四页，本课件共有70页 凝胶是一类不溶于水，但在水中有较大膨胀度和较好分子凝胶是一类不溶于水，但在水中有较大膨胀度和较好分子筛作用的化合物筛作用的化合物 目前主要有目前主要有葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶、天然琼脂糖天然琼脂糖和和交联琼脂糖交联琼脂糖；其；其次，还有次，还

3、有聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（生物胶）、（生物胶）、交联葡聚糖与双丙交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶烯酰胺共聚凝胶，以及，以及交联琼脂糖与葡聚糖共价结合的交联琼脂糖与葡聚糖共价结合的凝胶凝胶等等第五页，本课件共有70页第六页，本课件共有70页第七页，本课件共有70页商商品品名名称称：Sephadex，由由葡葡聚聚糖糖右右旋旋糖糖酐酐(G型型)和和3-氯氯-1，2环氧丙烷环氧丙烷(交联剂交联剂)以醚键交联而成以醚键交联而成 在在交交联联葡葡聚聚糖糖G-25、G-50中中加加入入羟羟丙丙基基后后，即即可可构构成成烷烷基基化化（LH型）葡聚糖凝胶型）葡聚糖凝胶 一、葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶第八页，本

4、课件共有70页第九页，本课件共有70页性状：性状：外观为白色珠状颗粒，在显微镜下可见表面为外观为白色珠状颗粒，在显微镜下可见表面为网状网状皱纹皱纹溶溶解解性性：带带有有大大量量的的羟羟基基，亲亲水水性性好好，因因此此在在水水溶溶液液或或电电解解质质溶溶液液中中极易膨胀极易膨胀 型型号号：Sephadex Sephadex G-nG-n（n n越越大大，则则交交联联度度越越小小，而而膨膨胀胀度度、吸吸水水量量和和筛孔直径则越大筛孔直径则越大）应用：应用：1.1.理化性质理化性质凝胶过滤层析：凝胶过滤层析：以以G G型型SephadexSephadex为固定相，水为流动相，为固定相，水为流动相，对

5、水溶性物质进行分离对水溶性物质进行分离凝胶渗透层析：凝胶渗透层析：以以LHLH型型SephadexSephadex为固定相，以有机溶剂为为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离流动相，对脂溶性物质进行分离第十页，本课件共有70页 在在水水溶溶液液、盐盐溶溶液液、碱碱溶溶液液、弱弱酸酸溶溶液液和和有有机机溶溶剂剂中中是是稳稳定的、不溶解的定的、不溶解的 强酸或氧化剂强酸或氧化剂溶液中，则容易使糖苷键水解断裂溶液中，则容易使糖苷键水解断裂 在在室室温温下下长长期期保保存存时时，应应加加入入适适量量的的防防腐腐剂剂如如CHClCHCl3 3、0.050.05NaNNaN3 3或或2020E

6、tOHEtOH等等 2.2.稳定性稳定性第十一页，本课件共有70页含含少少量量的的羧羧基基基基团团，为为弱弱酸酸性性物物质质。能能与与带带正正电电荷荷的的分分离物离物如碱性蛋白质等发生吸附如碱性蛋白质等发生吸附克克服服方方法法：提提高高洗洗脱脱液液的的离离子子强强度度至至0.050.05以以上上，可可克克服服此此非非特异性吸附特异性吸附 常用含有常用含有NaClNaCl的缓冲液作洗脱液。的缓冲液作洗脱液。新新购购得得葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶对对蛋蛋白白质质往往往往有有不不可可逆逆的的吸吸附附性性能能，虽虽然然吸吸附附的的数数量量较较少少，但但在在定定量量测测定定或或者者分分离离纯纯化化极极难难得得

7、到到的的物物质质时时，也也需先用易得到的蛋白质进行需先用易得到的蛋白质进行预层析预层析，以便消除其影响，以便消除其影响 3.吸附性吸附性第十二页，本课件共有70页葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶对对芳芳香香族族化化合合物物或或杂杂环环化化合合物物以以及及某某些些凝凝集集素素具具有有较较强强的的吸吸附附作作用用，若若采采用用凝凝胶胶过过滤滤层层析析分分离离它们时，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理它们时，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理 第十三页，本课件共有70页第十四页，本课件共有70页琼琼脂脂糖糖是是从从琼琼脂脂中中分分离离出出来来的的一一种种由由D-D-半半乳乳糖糖和和3,63,6脱脱水水的的L

8、-L-半半乳糖连接而成的多糖。其商品名因生产厂家不同而异乳糖连接而成的多糖。其商品名因生产厂家不同而异瑞典、中国瑞典、中国 ：SepharoseSepharose美美国国：Bio-gel Bio-gel A A 15m15m，排排阻阻分分子子量量小小于于1515millionmillion的的分分子子，即即15 15 10 106 6（排阻限度）（排阻限度）英国：英国：SegavacSegavac，粉状、颗粒状粉状、颗粒状丹麦：丹麦：GelaroseGelarose除除SegavacSegavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售 二、琼脂糖凝胶二、琼脂糖凝胶第十

9、五页，本课件共有70页1.1.性性 质质高温时呈液态，经凝集即成琼脂糖凝胶高温时呈液态，经凝集即成琼脂糖凝胶对尿素、盐酸胍等具有较强的抵抗力，在对尿素、盐酸胍等具有较强的抵抗力，在pH4.0pH4.09.09.0缓冲液中缓冲液中稳定稳定层析流速较高层析流速较高干胶易脱水破裂，一般存放于含防腐剂的水溶液中，干胶易脱水破裂，一般存放于含防腐剂的水溶液中，避免剧烈搅拌避免剧烈搅拌第十六页，本课件共有70页Sepharose 2B(2)、4B(4)和和6B(6)Sepharose 6B的机械强度大于的机械强度大于2B，但是筛孔小于但是筛孔小于2B Sepharose与与1，3-二二溴溴异异丙丙醇醇(1

10、,3-dibromopropanol)在在强强碱碱性条件下反应后，即生成性条件下反应后，即生成CL型交联琼脂糖型交联琼脂糖(Sepharose CL）这这种种琼琼脂脂糖糖的的筛筛孔孔与与同同浓浓度度的的、未未交交联联的的琼琼脂脂糖糖相相同同，但但耐耐热热、耐耐酸酸碱碱。但但是是在在氧氧化化剂剂存存在在下下，会会有有少少量量的的多多糖糖链链发发生生解解聚聚（稳稳定定性性提提高高）2.2.应用形式（按浓度分）应用形式（按浓度分）第十七页，本课件共有70页3.3.特特 点点 机械强度和筛孔的机械强度和筛孔的稳定性稳定性都比葡聚糖凝胶好；且层析时都比葡聚糖凝胶好；且层析时流速较快流速较快第十八页，本课

11、件共有70页商商品品名名称称：Bio-gel（生生物物胶胶）。以以甲甲撑撑双双丙丙烯烯酰酰胺胺(双双体体)作作交交联联剂剂，以以过过硫硫酸酸铵铵作作催催化化剂剂，在在N，N，N，N-四四甲甲基基乙乙二二胺胺(TEMED)加加速速剂剂的的作作用用下下（化化学学催催化化），将将丙丙烯烯酰酰胺胺(单单体体)聚聚合合而而成成 当当改改变变单单体体浓浓度度时时，就就可可得得到到吸吸水水率率不不同同的的产产物物。商商品品聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝胶型号有凝胶型号有Bio-gel P-2到到P-300，其阿拉伯数字表示排阻限度其阿拉伯数字表示排阻限度 如如 Bio-gel P-150的排阻限度为小于的排阻限度为

12、小于150 103 Da三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶第十九页，本课件共有70页 聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶一一般般制制成成珠珠状状颗颗粒粒，使使用用前前必必须须溶溶胀胀。能能忍忍受受浓浓的的盐盐、尿尿素素和和胍胍盐盐等等溶溶液液的的浸浸泡泡；耐耐酸酸碱碱，但但要要避避免免长长期期与与强强酸酸和和强强碱碱接接触触，如如果果与与其其接接触触并并在在高高温温条条件件下下，酰酰胺胺基基将将迅迅速速发发生生分解分解 聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶对对芳芳香香族族的的、酸酸性性和和碱碱性性的的化化合合物物稍稍有有吸吸附附现现象象 克服吸附的方法：提高洗脱液的离子强度克服吸附的方法：提高洗脱液的离子

13、强度 第二十页，本课件共有70页SephacrylSephacryl是是由由烯烯丙丙烷烷基基葡葡聚聚糖糖与与甲甲撑撑双双丙丙烯烯酰酰胺胺共共价价交交联联制制成成。此凝胶属此凝胶属硬性凝胶硬性凝胶，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团耐耐酸酸碱碱、耐耐去去污污剂剂、耐耐解解离离剂剂，甚甚至至可可用用去去污污剂剂、盐盐酸酸胍胍或或尿尿素素溶溶液作洗脱剂液作洗脱剂 多多用用于于蛋蛋白白质质、核核酸酸、多多糖糖和和蛋蛋白白聚聚糖糖的的分分离离纯纯化化，也也用用于于病病毒毒颗粒颗粒的分离的分离四、四、SephacrylSephacryl第二十一页，本课件共有70页

14、由高交联度的琼脂糖与葡聚糖共价结合而成由高交联度的琼脂糖与葡聚糖共价结合而成特特点点：具具有有良良好好的的分分子子筛筛特特性性和和理理化化稳稳定定性性。溶溶液液的的酸酸碱碱度度可可在在pH3pH3 1212范范围围内内变变化化；溶溶液液中中加加入入去去污污剂剂(如如1 1SDS)SDS)和和(或或)解解离离剂剂(如如8 8mol/Lmol/L尿尿素素、6 6mol/Lmol/L盐盐酸酸胍胍)时时，也也不不会会影影响响分分离离效果效果 五、五、SuperdexSuperdex第二十二页，本课件共有70页SuperoseSuperose：高交联度的多孔琼脂糖珠高交联度的多孔琼脂糖珠玻玻璃璃珠珠：有

15、有大大量量的的网网孔孔，且且分分布布均均一一。机机械械性性能能良良好好，在在较较高高的的层层析析流流速速下下，分分辨辨率率并并不不受受影影响响，其其缺缺点点是是对对蛋蛋白白质质等等物质有物质有吸附吸附能力能力聚苯乙烯凝胶聚苯乙烯凝胶五、其五、其 他他第二十三页，本课件共有70页第二节第二节 基本原理基本原理第二十四页，本课件共有70页一、基本原理一、基本原理 凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径较凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径较一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻某些一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而

16、小分子化合物则可以在筛孔中自大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度用由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度用 表示表示 洗脱体积；洗脱体积；外水体积；外水体积；凝胶床体积凝胶床体积 在一定层析条件下，在一定层析条件下，和和 均为固定值，而均为固定值，而 随着被分离物分子量的随着被分离物分子量的变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多），变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多），越小，越小，越小越小第二十五页，本课件共有70页 各组分间的各组分间的 值差异越大，分离效果越好；值差异越大，分离效果越好；差异

17、越小差异越小,则则分离效果很差，或根本无法分离分离效果很差，或根本无法分离 流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分第二十六页，本课件共有70页 1、当当Kav=0时时，则则Ve=Vo，即即对对于于根根本本不不能能进进入入凝凝胶胶内内部部的的大大分分子子物物质质全全排排阻阻，洗洗脱脱体体积积等等于于空空隙隙体体积积即即外外水水体体积积（图图中中组组分分）2、当当Kav=1时时，Ve=Vo+Vi。即即小小分分子子可可完完全全渗渗入入凝凝胶胶内内部部时

18、时，洗洗脱脱体体积积应应为为空空隙隙体体积积与与内内水水体体积积之之和和。Ve=Vo+Vi（图图中中组组分分）第二十七页，本课件共有70页3 3、当当0 0K Kavav1 1时时，V Ve e=V Vo o+K Kavav（V Vi i V Vg g）。表表示示固固定定相相中中只只有有一一部部分分可可被被组组分分扩扩散散渗渗入入，一一部部分分被被排排阻阻，V Ve e即即在在V Vo o与与V Vo o+V Vi iV Vg g之间变化（图中组分之间变化（图中组分）4 4、有时、有时K Kavav1 1，表示凝胶对组分有吸附作用表示凝胶对组分有吸附作用 （从内水中洗从内水中洗脱出来的含量下降

19、），此时脱出来的含量下降），此时V Ve eV Vo o+V Vi iV Vg g。例如一些芳香族化例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex G-25Sephadex G-25中的中的洗脱体积远超出理论计算的最大值洗脱体积远超出理论计算的最大值第二十八页，本课件共有70页二、二、值的测定值的测定只要测出只要测出 、和和 ，即可计算出，即可计算出 值值 1.的测定：的测定：（1 1）计算法：）计算法：2.2.（2 2）测定法：）测定法：第二十九页，本课件共有70页 的测定：的测定：用蓝色的葡聚糖用蓝色的葡聚糖20002000（M=200

20、M=200万），在万），在SephadexSephadex中被完全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉眼或中被完全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测（分光光度计检测（210210、260260或或620nm620nm）洗脱体积）洗脱体积 的测定：的测定：用用 、N-N-乙酰酪氨酸或其他小分子物乙酰酪氨酸或其他小分子物质作为洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱体质作为洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是积刚好是 （=1=1）当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则 介于介于 和和 之间（即之间（即 =0=0 1 1）第三十页，

21、本课件共有70页第三十一页，本课件共有70页第三节第三节 操操 作作第三十二页，本课件共有70页（一）凝胶的选择（一）凝胶的选择 1.1.型号：型号：凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同如：如：Sephadex G Sephadex G 型多用于分离蛋白质；型多用于分离蛋白质；生物胶和生物胶和 SephacrylSephacryl等多用于分离核酸；等多用于分离核酸；要除去蛋白质中的盐类，多用要除去蛋白质中的盐类，多用Sephadex G-25Sephadex G-252.2.粒粒度度：粒粒度度与与交交联联度度无无关关。与与粗粗颗颗粒粒相相比比，细细颗颗粒粒凝凝胶胶之

22、之间间空空隙隙小小，装装柱柱易易均均匀匀，分分离离效效果果好好，但但流流速速慢慢；而而粗粗颗颗粒粒凝凝胶胶流流速速快，宜用小颗粒直径的层析柱快，宜用小颗粒直径的层析柱 一、凝胶的选择与处理一、凝胶的选择与处理第三十三页，本课件共有70页第三十四页，本课件共有70页（二）凝胶用量计算（二）凝胶用量计算 由于凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出由于凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出的凝胶用量需增加的凝胶用量需增加101020%20%第三十五页，本课件共有70页（三）凝胶的处理（三）凝胶的处理 将所用的干胶置于将所用的干胶置于5 51010倍量的倍量的D.WD.W中，充分浸泡（

23、表中，充分浸泡（表6-26-2溶胀溶胀时间），用倾斜法去除表面悬浮的小颗粒，再用时间），用倾斜法去除表面悬浮的小颗粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl室温浸泡室温浸泡0.5h0.5h，抽滤除去碱液，抽滤除去碱液，用用D.WD.W洗至中性。再用抽气方法以洗至中性。再用抽气方法以D.WD.W或平衡液除去凝胶颗粒之或平衡液除去凝胶颗粒之间的气泡间的气泡第三十六页，本课件共有70页1 1柱子的选择柱子的选择当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高柱长相同时，直径大者比小者分辨率高柱长相同时，

24、直径大者比小者分辨率高床体积相同时，柱长长者比短的分辨率高床体积相同时，柱长长者比短的分辨率高一一般般理理想想的的层层析析柱柱直直径径与与长长度度之之比比是是1 1：25251 1：100100；层层析析柱柱外外面面最最好好有有夹夹套套，能能控控制制温温度度（柱柱温温箱箱），以以保保证证结结果果的的重重复复性性 2 2装柱：装柱：常用湿装法（第三章）常用湿装法（第三章）3 3凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定 二、凝胶柱的制备二、凝胶柱的制备第三十七页，本课件共有70页流速、柱长对分离的影响流速、柱长对分离的影响 第三十八页，本课件共有70页 加加样样量量与与层层析析柱柱床床体体积积及及检检测测方方法法

25、的的灵灵敏敏度度有有关关。床床体体积积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少越小、方法灵敏度越高时，加样量越少 层层析析的的目目的的在在于于分分析析时时，加加样样量量占占床床体体积积的的12，作作制制备、脱盐用时，占备、脱盐用时，占2030 一一般般来来说说，加加样样量量越越少少，分分辨辨率率越越高高。具具体体加加样样体体积积由由分分配系数配系数(Kav)或洗脱体积或洗脱体积(Ve)来决定来决定三、加样与洗脱三、加样与洗脱（一）加（一）加 样样第三十九页，本课件共有70页第四十页，本课件共有70页 V VeAeA、V VeBeB：组分组分A A、B B的洗脱体积的洗脱体积 K KavAavA、K

26、KavBavB：组分：组分A A、B B的分配系数的分配系数 V Vs s：A A、B B两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）V Vs s=V=VeA eA V VeBeB当当样样品品体体积积V Vp pV Vs s时时，理理论论上上的的洗洗脱脱图图形形是是两两种种物物质质恰恰好好分分开开(图图中中)。但但由由于于样样品品流流过过柱柱时时的的扩扩散散作作用用，其其体体积积会会逐逐渐渐增增大大，致致使使其其洗洗脱脱体体积积远远比比原原来大来大加样量（加样量（V Vp p）的确定）的确定第四十一页，本课件共有70页 图图、中中A A、B B两两种种物物质质有

27、有一一定定程程度度的的交交叉叉，这这表表明明二二者者只只是是部部分分分分开开。因因此此，当当V Vp p等等于于或或大大于于V Vs s时时，A A、B B两两种种物物质质就不能完全分开就不能完全分开(图中图中)当当V Vp pV Vs s时，时，A A、B B两种物质就能分开两种物质就能分开(图中图中)根据根据 V Ve e=V=Vo o+K+Kavav（V Vt t V Vo o）又又 V Vs s=V=VeAeAV VeB eB =（K KavAavAK KavB avB）（）（V Vt t V Vo o）第四十二页，本课件共有70页 V Vs s=（K KavAavAK KavB av

28、B）（）（V Vt t V Vo o）=（K KavAavAK KavB avB）（）（V Vi i+V+Vg g）A A、B B两种物质能分开的最低限：两种物质能分开的最低限：V Vp pV Vs s最大最大V Vs s时的必要条件：时的必要条件：KKavAavAK KavB avB 最大，为最大，为1 10 01 1 V Vi i+V+Vg g最大，一般为最大，一般为V Vt t/2/2则：则：最大理论加样量最大理论加样量V Vp pV Vs sV Vt t/2/2最大理论加样量的计算最大理论加样量的计算第四十三页，本课件共有70页 为为提提高高分分离离效效果果，除除了了缩缩小小加加样样体

29、体积积以以外外，样样品品的的黏黏度度也也一一般般以以小小于于2 2cp(cp(厘厘帕帕，P=P=N/mN/m2 2s s)，或或者者与与洗洗脱脱液液的黏度相当为宜的黏度相当为宜 葡聚糖使粘度上升葡聚糖使粘度上升 黏度的影响黏度的影响第四十四页，本课件共有70页粘度对柱层析的影响粘度对柱层析的影响 第四十五页，本课件共有70页1.1.洗脱液的选择原则洗脱液的选择原则 能溶解被洗脱物质而又不使其变性或失活能溶解被洗脱物质而又不使其变性或失活 一一般般以以单单一一缓缓冲冲液液（如如PBSPBS、Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液等等）或或盐盐溶溶液液，有有时时甚至用甚至用D.WD.W作为洗

30、脱液作为洗脱液 2.2.洗脱速度洗脱速度 若流速不均匀，收集的每一部分洗脱体积不恒定，若流速不均匀，收集的每一部分洗脱体积不恒定，K Kavav就难以确定就难以确定 最最好好的的装装置置是是恒恒流流泵泵(微微量量泵泵、蠕蠕动动泵泵)，可可以以使使流流速速在在较较大大范范围围内内恒恒定定。若若无无此此装装置置，可可用用控控制制操操作作压压的的办办法法进进行行，其其装装置置可可使使用用恒压瓶恒压瓶 一一般般，洗洗脱脱速速度度慢慢，分分离离效效果果就就好好；但但若若太太慢慢，又又会会因因扩扩散散加剧而影响分离效果加剧而影响分离效果(二二)洗洗 脱脱第四十六页，本课件共有70页。第四十七页，本课件共有

31、70页Sephadex Sephadex G-50G-50及及其其以以下下（交交联联度度大大）的的流流速速与与操操作作压压之之间间的的关关系遵守系遵守DarcysDarcys规律规律u u：线性流速：线性流速(ml/cmml/cm2 2h)h)K K：常数：常数(粗、中、细颗粒的各不相同粗、中、细颗粒的各不相同)P P：操作压：操作压(cp)cp)L L：柱长柱长流速与操作压流速与操作压第四十八页，本课件共有70页 K Ko o仅与凝胶的性质有关，而与柱子直径基本无关。仅与凝胶的性质有关，而与柱子直径基本无关。但但是是G-75G-75以以上上各各种种型型号号交交联联葡葡聚聚糖糖的的流流速速还还

32、与与柱柱直直径径大大小小有关有关 当洗脱液的黏度为当洗脱液的黏度为lcplcp时的表达式时的表达式第四十九页，本课件共有70页第五十页，本课件共有70页 一般，洗脱流速慢，则分离效果就好；但太慢又会因扩散加剧一般，洗脱流速慢，则分离效果就好；但太慢又会因扩散加剧而影响分离效果而影响分离效果第五十一页，本课件共有70页四、凝胶柱的再生及保存四、凝胶柱的再生及保存（一）再生（一）再生 使用过一次或几次的凝胶柱，通常用使用过一次或几次的凝胶柱，通常用3 34 4倍床体积的洗脱液倍床体积的洗脱液冲洗，再用平衡液平衡即可；但使用过多次后，凝胶冲洗，再用平衡液平衡即可；但使用过多次后，凝胶床体积变小、床体

33、积变小、流动速度下降、杂质过多流动速度下降、杂质过多等，其处理方法是等，其处理方法是 先用水反复进行逆向冲洗（反冲），再用缓冲液进行平先用水反复进行逆向冲洗（反冲），再用缓冲液进行平衡；衡；把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行处理，把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行处理，然后重新装柱然后重新装柱第五十二页，本课件共有70页膨胀状态膨胀状态 即在水相中保存。可加入即在水相中保存。可加入0.02%0.02%的叠氮钠（的叠氮钠（NaNNaN3 3）溶液等防腐溶液等防腐剂或加热灭菌后于低温短时间保存。剂或加热灭菌后于低温短时间保存。一一般般不不用用氯氯仿仿、丁丁醇醇、甲甲苯苯等等

34、为为防防腐腐剂剂。因因为为它它们们能能引引起起凝凝胶胶颗颗粒粒的的收收缩缩，同同时时还还能能进进入入层层析析仪仪器器的的塑塑料料部部件件，使使塑塑料料变软，造成不良后果变软，造成不良后果（二）保（二）保 存存第五十三页，本课件共有70页第五十四页，本课件共有70页半收缩状态：半收缩状态：用用完完后后水水洗洗净净，然然后后再再用用60%60%70%70%乙乙醇醇洗洗，则则凝凝胶胶体体积缩小，于低温较长时间保存积缩小，于低温较长时间保存干燥状态：干燥状态：用用水水洗洗净净后后，加加入入含含乙乙醇醇的的水水洗洗，并并逐逐渐渐加加大大含含醇醇量量，最最后后用用95%95%乙乙醇醇洗洗，则则凝凝胶胶脱脱

35、水水收收缩缩，再再用用乙乙醚醚洗洗去去乙乙醇醇，抽抽滤滤至干，于至干，于60608080烘干后长时间保存烘干后长时间保存不脱水而直接烘干会黏结成块不脱水而直接烘干会黏结成块第五十五页，本课件共有70页第四节第四节 应应 用用第五十六页，本课件共有70页原原理理：盐盐类类小小分分子子物物质质进进入入凝凝胶胶筛筛孔孔，而而大大分分子子物物质质则则被被排排阻阻在在外外（分子筛原理）（分子筛原理）优点：优点：与透析相比，速度快，不会引起大分子物质变性与透析相比，速度快，不会引起大分子物质变性材料：材料：细颗粒葡聚糖凝胶细颗粒葡聚糖凝胶G-25G-25 一、脱盐和浓缩一、脱盐和浓缩第五十七页，本课件共有

36、70页分分离离对对象象：溶溶解解度度、带带电电性性等等理理化化性性质质相相似似而而分分子子质质量量不不 同同，或者是聚合度不等的混合物溶液或者是聚合度不等的混合物溶液实例：实例：Sephadex G-200Sephadex G-200层析纯化层析纯化AFPAFP 制制备备Ag-AbAg-Ab复复合合物物 溶溶于于少少量量0.1mol/L 0.1mol/L Gly-HClGly-HCl缓缓冲冲液液中中，并并用用本本液液透透析析2h 2h 上上Sephadex Sephadex G-200G-200柱柱 得得AFPAFP峰峰 置置0.1mol/L0.1mol/L柠檬酸柠檬酸-磷酸缓冲液（磷酸缓冲液

37、（pH4.8pH4.8）透析）透析 上柱洗脱上柱洗脱 AFPAFP纯品纯品二、分离生命物质二、分离生命物质第五十八页，本课件共有70页第五十九页，本课件共有70页第六十页，本课件共有70页热热源源物物质质：指指微微生生物物产产生生的的分分子子量量很很大大的的某某些些多多糖糖蛋蛋白白复复 合物等，能使人体发热的物质合物等，能使人体发热的物质材料：材料：Sephadex G-25Sephadex G-25（8080120120目目 ）特点：特点：比活性炭吸附、离子交换吸附等方便比活性炭吸附、离子交换吸附等方便 实实例例：用用Sephadex Sephadex G-25G-25凝凝胶胶层层析析除除去

38、去氨氨基基酸酸粗粗品品中中的的热热源源质质：利利用用热热源源（大大分分子子蛋蛋白白类类）的的K Kavav=0=0，而而氨氨基基酸酸的的K Kavav11，将将试试剂剂量量控控制在柱体积的制在柱体积的202030%30%，能实现完全分离，能实现完全分离三、去热源物质三、去热源物质第六十一页，本课件共有70页 原原理理：Kav=b lgM+c 或或lgM=adKav(M为为分分子子质质量量，常常数数a、b、c、d均大于均大于0)先做标准曲线，再在相同条件下测样品先做标准曲线，再在相同条件下测样品Kav 也可用以下也可用以下4个指标代替个指标代替VeVo：分离体积分离体积Ve/Vo：相对保留体积（

39、另相对保留体积（另R Vo/Ve）Ve/Vt：简化的洗脱体积，受柱的填充情况的影响较小简化的洗脱体积，受柱的填充情况的影响较小 Ve：洗脱体积洗脱体积特点：简便实用，所需样品量较少特点：简便实用，所需样品量较少 四、测定分子质量四、测定分子质量第六十二页，本课件共有70页pH6pH68 8的的范范围围内内，曲曲线线线线性性才才比比较较好好；而而在在极极端端pHpH时时，由由于于变变性性等原因易偏高等原因易偏高 一般一般适用于球状适用于球状propro的分子量测定，而纤维状的分子量测定，而纤维状propro不合适不合适糖蛋白中若糖蛋白中若糖的比例糖的比例5 5时，测定结果偏大时，测定结果偏大不受

40、不受变性剂变性剂如尿素和盐酸胍的影响如尿素和盐酸胍的影响有些酶类不适用。如有些酶类不适用。如淀粉酶淀粉酶，能与葡聚糖凝胶形成络合物，能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异常反应常反应用凝胶过滤法测定分子量的局限性用凝胶过滤法测定分子量的局限性第六十三页，本课件共有70页第六十四页，本课件共有70页第六十五页，本课件共有70页第六十六页，本课件共有70页第六十七页，本课件共有70页 若若在在SephadexSephadex分分子子上上连连接接DEAEDEAE、羧羧甲甲基基或或磺磺酸酸乙乙基基等等离离子子基基

41、团团，可可使使凝凝胶胶在在具具有有分分子子筛筛基基础础上上，还还具具有有离离子子交交换换能能力，大大提高力，大大提高SephadexSephadex在生化制药中的应用范围在生化制药中的应用范围 如如：DEAE-Sephadex DEAE-Sephadex A-25A-25可可用用于于制制备备无无热热原原物物质质的的去去离离子子水水五、其五、其 他他第六十八页，本课件共有70页4 4在在凝凝胶胶层层析析柱柱中中分分离离某某有有效效成成分分时时，洗洗脱脱体体积积为为140140mlml，其其外水体积和总体积分别为外水体积和总体积分别为6060mlml和和200200mlml，求分配系数是多少求分配系数是多少?思考题思考题 解：解：V Ve e=V=Vo o+K+Kavav（V Vt t V Vo o ）140 140=60+K=60+Kavav（200200 60 60）K Kavav=0.57=0.57第六十九页，本课件共有70页感感谢谢大大家家观观看看第七十页，本课件共有70页