高效液相色谱法知识讲解优秀PPT.ppt

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1、高效液相色谱法知识讲解第一页，本课件共有49页内容概要内容概要工作原理工作原理结构组成结构组成常见故障与维护常见故障与维护HPLC概述概述HPLC应用应用第2页/共49页第二页，本课件共有49页 高效液相色谱法(HPLC)是上个世纪七十年代迅速发展起来的一项高效、快速的分析分离技术，是现代分离测试的重要手段。色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(station phase)发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。一、一、HPLC HPLC 简介简介第3页/

2、共49页第三页，本课件共有49页 HPLC是在经典的液相色谱法基础上发展起来的，其以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。其分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细，需高压泵推动，柱效高，分析速度快。与气相色谱不同的是液相色谱中流动相亦参与组分的分离过程，其组成、比例和pH值可灵活调节，分离模式多样。在实际操作中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留值和选择性，从而使不同样品得到分离。第4页/共49页第四页，本课件共有49页 高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来，由于使用了高压输液泵、全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，实现了对样品的高速、高效和高灵敏度的分离

3、测定。高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验，并引入微处理机技术，极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度。现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，既能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等)，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全的分析工具。第5页/共49页第五页，本课件共有49页 高效液相色谱法的应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法

4、分析测定，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。HPLC因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析，世界各国己将该法收载于药典。第6页/共49页第六页，本课件共有49页液相色谱液相色谱检测器检测器UVVISFLDDAD ELSDECDRID 液相色谱检测器液相色谱检测器火焰离子化检测器、手性、化学发光、核磁共振、质谱检测器等新型检测技术第7页/共46页第7页/共49页第七页，本课件共有49页HPLCHPLC的特点的特点

5、GC与与LC的比较的比较测定对象拓展检测器不同第8页/共49页第八页，本课件共有49页 由于HPLC分析不受温度和样品沸点限制，因此具有更广阔的应用潜力。经过30多年的迅速发展，高效液相色谱法在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现已成为化学化工、环境、药学、食品等多个领域中最具优势的分离分析方法之一。第9页/共49页第九页，本课件共有49页第二节第二节 基本原理基本原理液相色谱根据分离机理的不同可分为：液固吸附色谱液液分配色谱离子交换色谱离子对色谱法 分子排阻色谱(或凝胶渗透色谱)第10/共49页 第十页，本课件共有49页（一）液一）液-固吸附色谱固吸附色谱 流动相为液体，固定

6、相为固体吸附剂，根据物质吸附作用的不同流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用的不同来分离物质。来分离物质。第11/共49页 第十一页，本课件共有49页 流动相和固定相都是液体的色谱法即为液流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液色谱，是利用液色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂于载体上的固定相。流动相，另一种是涂于载体上的固定相。流动相极性小于固定相极性的液流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配液色谱法称为正相分配色谱法。色谱法。流动相极性大于固定相极性的液流动相极

7、性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配色液色谱法称为反相分配色谱法。谱法。（二）液（二）液-液分配色谱液分配色谱第12/共49页 第十二页，本课件共有49页（三）离子交换色谱（三）离子交换色谱（四）离子对色谱法四）离子对色谱法（五）分子排阻色谱法（五）分子排阻色谱法第13/共49页 第十三页，本课件共有49页1100/1200 HPLC仪器的结构组成：仪器的结构组成：在线脱气机在线脱气机(G1322A,G1379A/B)二元二元/四元泵四元泵(G1310A,G1311A,G1312A/B)自动进样器自动进样器(G1313A,G1329A/B,G1367A/B/C/D)柱温箱柱温箱(G131

8、6A/B)二极管阵列检测器二极管阵列检测器(G1315A/B/C/D)数据处理系统数据处理系统三、三、HPLC结构组成结构组成第14/共49页 第十四页，本课件共有49页HPLC系统系统溶剂传输系统：心脏溶剂传输系统：心脏高压泵高压泵样品引入系统：样品引入系统：进样器进样器样品分离系统：关键样品分离系统：关键色谱柱色谱柱信号检测系统：信号检测系统：检测器检测器数据处理系统：数据处理系统：软件软件第15/共49页 第十五页，本课件共有49页泵的基本原理泵的基本原理往复活塞泵(单向阀)弹簧隔板/红宝石球串联柱塞泵消除流量脉冲 并联柱塞泵减小流量脉冲 第16/共49页 第十六页，本课件共有49页仪器

9、：仪器：四元泵四元泵不是个泵必配真空脱气机二元泵不是个泵必配真空脱气机二元泵各控制一种溶剂各控制一种溶剂四元泵在起作用：比例阀：比例阀 ：主动阀：主动阀：单向阀：单向阀第17/共49页 第十七页，本课件共有49页仪器：仪器：手动进样器手动进样器-六通阀六通阀/定量环定量环六通阀定量环LoadLoadInjectInject通废液口进柱定量环第18/共49页 第十八页，本课件共有49页仪器：自仪器：自动进样器动进样器自动进样自动进样100100样品盘样品盘/机器手机器手/自动洗针自动洗针机械手样品盘第19/共49页 第十九页，本课件共有49页色谱柱：色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架柱温箱、色谱柱外挂

10、架柱温箱外挂架第20/共49页 第二十页，本课件共有49页仪器：仪器：检测器检测器-紫外紫外UV/VisUV/Vis双灯，全波长检测双灯，全波长检测检测器流路第21/共49页 第二十一页，本课件共有49页仪器：化学工作站仪器：化学工作站进样器高压泵流动相色谱柱检测器数据处理第22/共49页 第二十二页，本课件共有49页固定相与流动相固定相与流动相反相反相HPLC 极性极性:固定相固定相 流动相流动相 固定相固定相-极性强极性强 流动相流动相(己烷己烷,庚烷庚烷)-极性弱极性弱 极性物质后出峰极性物质后出峰正相色谱正相色谱 20%反相色谱反相色谱80%正相色谱正相色谱 20%反相色谱反相色谱80

11、%与固定相与固定相极性相近极性相近tR长长主流第23/共49页 第二十三页，本课件共有49页流动相流动相(反相反相)常用溶剂：乙腈、甲醇、水等乙腈、甲醇、水等实际使用：甲醇甲醇-水水/乙腈乙腈-水混合体系水混合体系等度洗脱：流动相比例恒定流动相比例恒定梯度洗脱：逐步提高有机溶剂比例逐步提高有机溶剂比例第24/共49页 第二十四页，本课件共有49页流动相就比如人体的血液，其质量直接影响到整个系统的正常运行与否。应该使用HPLC级的溶剂，不能互相混溶的溶剂不可以直接切换！一般在水相和与其不混溶的溶剂切换时，使用异丙醇作为过渡溶剂。注意溶剂的截止波长。截止波长是指该溶剂可以在紫外检测器中使用的 最低

12、波长,低于该波长后,溶剂会有很强的紫外吸收，从而影响极限的稳定性、干扰对所分析物质的检测。四、四、HPLC常见故障与维护常见故障与维护1 1、HPLCHPLC对流动相的一般要求对流动相的一般要求第25/共49页 第二十五页，本课件共有49页 HPLC所使用的水必须是新鲜的和经过0.45m滤膜过滤过的。建议每天更换新鲜的水。长期不用时，必须把使用水的管路用有机溶剂置换，防止长霉。仪器使用完后要采用适当的溶剂冲洗等方法维护色谱柱和系统。如果使用了缓冲盐一定先将盐要冲洗干净。仪器长期不用时，不建议使用纯乙腈封存。因为乙腈有生成聚合物的趋 势。建议使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。当有流路堵塞时，可以

13、尝试将之反接后冲洗。污染的溶剂或溶剂瓶里的藻类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿命，并且影响泵和系统的的性能。这在水溶剂或磷酸盐缓冲液(pH 4 至7)中尤其如此。第26/共49页 第二十六页，本课件共有49页检查溶剂过滤器 查看过滤器是否变色(尤其是盛放水相的溶剂瓶)拧开脱气机出口或比例阀入口管线，此时溶剂会因为重力流出。当脱气机或溶剂过滤头堵塞时，溶剂会流出不畅或不流出临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常。清洁溶剂过滤器 将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下，用水冲洗残留之溶剂，然后将过滤器放在装有浓硝酸(35左右)的烧杯里浸一小时。用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器至水为中性可以把过滤器放在塑料烧杯内

14、超声清洗。但是不可使用玻璃器皿将过滤器重新装好。建议：定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶（可以高温灭菌），每三个月至少清洗一次第27/共49页 过滤器过滤器第二十七页，本课件共有49页将装有溶剂瓶的溶剂箱放在泵上面或较高处。当在四元泵上使用盐溶液或有机溶剂时，建议将盐溶液接 在下面的梯度阀口上，将有机溶剂接在上面的梯度阀口上，有机溶剂通道最好在水或盐溶液通道的正上面。建议用水定期冲洗所有MCGV通道除去可能在阀口析出的盐结晶。操作泵之前，用至少两个体积（标准脱气机30mL，对微脱气机10mL）冲洗真空脱气机,特别是当泵关闭了一段时间后(例如，过夜)，以及在通道中使用挥发性混合溶剂时，防止溶剂瓶内的玻璃

15、滤头(过滤器)堵塞及长菌，当滤头表面有黑色或黄色污染层说明发生了堵塞，应立即清洗或更换。定期检查排液阀的过滤白头。检查方法：拧开排液阀，以水作流动相。-对于标准脱气机(G1322A),流速5ml/min水，若压力大于10bar，则建议更换。-对于微量脱气机(G1379A),流速2ml/min水，若压力大于5bar，则建议更换第28/共49页 泵的使用要点泵的使用要点第二十八页，本课件共有49页当使用低流速时，检查所有1/16英寸接头有无渗漏（用压力测试或漏液测试。每当更换泵密封垫时 排液阀虑芯也应更换。更换活塞密封垫时检查活塞杆上是否有划痕。有划痕的活塞将导致轻度渗漏，并降低密封垫的使用寿命。

16、应尽早更换有划痕的活塞。使用缓冲溶液时，关泵前先用水冲洗系统。当需要长时间使 用0.1摩尔或更高浓度的缓冲液时，最好选用密封垫清洗附件，以减少对密封垫及活塞杆的磨损。如果使用了高浓度的缓冲盐，可以考虑用热水（5060）来冲洗盐通道来确保没有缓冲盐残留在系统中。更换活塞密封垫后应按照密封垫安装步骤对其进行磨合，但磨合不适用于正相密封垫。第29/共49页 第二十九页，本课件共有49页当泵头安装有柱塞清洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这样就会增加活塞杆运动时的阻力。所以开泵前一定要用10异丙醇，并将其流速调至约23滴/分钟使溶液流过冲洗装置。(对于二元泵SL，如果不使用盐溶液可以不开)10异丙醇有

17、助于降低水的表面张力，并有抑菌作用。不要用其它溶剂代替。当泵头安装有冲洗附件而不开启10异丙醇，会使密封垫及活塞杆的寿命减短(二元泵SL除外)，泵头如果发出“吱吱”声不影响使用和泵的精度如果有必要，可以改变压缩因子（compressibility）来达到更好的效果。第30/共49页 第三十页，本课件共有49页下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液 建议每天更换。避免溶剂瓶暴露在直射阳光下（尤其对于水、THF等）用氩气置换流动相上层的空气如果应用许可，在溶剂中加人0.00010.001 M的叠氮化钠(不适用于LC/MS)如果允许，可以考虑

18、永远在水相中加入5%或以上浓度的有机溶剂(甲醇、乙腈)。有时因为有气泡吸附在管壁上而造成气泡难以排出时，可以提起管线，使吸 入一个大气泡。让大气泡把吸附在管壁上的小气泡一起带走。如果在purge时发现从purge阀一直有气泡流出。这时应考虑并非泵里面仍有气泡，而是液体从一个内径较细的管路(Purge阀出口内径比较细)流入一个内径较粗的管线(废液管的内径要粗很多)所引起。第31/共49页 第三十一页，本课件共有49页泵的主要日常维护项目泵的主要日常维护项目：更换Purge Valve的PTFE过滤芯（Frit）清洗,更换主动阀阀芯清洗出口单向球阀更换柱塞杆或者柱塞杆密封圈第32/共49页 第三十

19、二页，本课件共有49页自动进样器自动进样器m样品在进样前必须经过适当的预先处理，需要经过亚微米滤膜的过滤或者离心，防止样品中的微小颗粒堵塞管路，最好使用流动相作为溶剂配制样品，所用溶剂应该对样品有较好的溶解性。m针座是喇叭口朝上暴露在空气中的，有时空气中的较大灰尘颗粒可能恰好落在针座的流路内而引起针座的堵塞。这时候可以尝试卸下针座，将它接在泵的出口上反冲，一般能解决问题。m如果经常使用缓冲溶液，除了泵头之外，ALS计量泵的柱塞及密封圈，六通阀的转子密封圈和定子密封圈应该定期清洗，防止有盐的颗粒磨损ALS一定要使用Agilent的样品瓶及瓶盖；使用不兼容的或者加工精度差的样品瓶及瓶盖会引起ALS

20、故障率的增加及性能的降低。第33/共49页 第三十三页，本课件共有49页漏液 针座磨损，堵塞 转子磨损进样量不准 转子磨损 计量泵故障 抽样速度太快，样品粘度太 进样阀的4废液口堵塞*机械臂移动故障 -抓不准样品瓶 传感器故障 周围环境差 样品瓶不标准初始化失败 Motor Temp 马达故障 传感器故障 周围环境差第34/共49页 自动进样器常见故障自动进样器常见故障第三十四页，本课件共有49页自动进样器日常维护自动进样器日常维护 定期检查各传动杆是否足够润滑，必要时先用酒精棉球擦拭干净后再给这些杆涂抹少量液润滑油，脏的传动杆使阻力增大从而造成自动进样器在取样过程中由于马达过热导致出错。检查

21、取样爪子的绿色胶套时否损坏，如果损坏请更换之，否则会使样品放置位置不正确而导致针或针座等的损坏。(仅对于标准自动进样器)用酒精棉签擦拭针座防止灰尘污染堵塞针与针座。必要时可以拆下超声清洗。第35/共49页 第三十五页，本课件共有49页UV灯不能点亮 灯坏了需要更换（一般是这个故障）主板或电源有问题基线不稳 流通池脏了 环境温度不稳定造成的基线波动 柱子脏了或没有平衡 泵压力不稳造成的基线波动 D2能量低或不稳定 出口废液管太短造成流通池压力不稳引起的基线问题第36/共49页 DAD常见故障及原因常见故障及原因第三十六页，本课件共有49页HPLC日常维护总结1清洗使用过缓冲盐的色谱柱时最好不要使

22、用100的水，因为大部分C18柱并不适合纯水的流动相。使用磷酸盐缓冲溶液，尽量避免和乙腈同时使用，因为磷酸盐在乙腈内溶解度很小。如果一定要使用的话，建议预先手动混合而非在线自动混合。注意不同检测器的出口废液管。因为Agilent设计的废液管同时有稳定流通池压力的阻尼作用。所以，废液管不能太短，否则可能引起流通池内压力不稳而造成基线波动。同时，注意保持废液管的畅通，因为不同流通池耐压不同，VWD 40bar，DAD 120bar MWD 120bar FLD 20bar RID 5bar(RID、FLD永远只能是最后一个检测器)，堵塞的废液管可能造成流通池过压而破裂2、HPLC日常维护日常维护第

23、37/共49页 第三十七页，本课件共有49页HPLC日常维护总结2定期清洗溶剂过滤头(35浓硝酸浸泡1小时，不建议使用超声波清洗)，流动相应经过0.45um或更小孔径的滤器过滤，如果使用滤膜，注意有机膜与水膜的区别。根据情况更换Purge阀内的在线过滤头（Purge阀打开，纯水5ml/min，压力超过10bar时需更换）。注意清洗在线脱气机及比例阀，尤其是长期使用水相或缓冲盐的通路，使用纯水冲洗后，再使用甲醇冲洗，可以打开Purge阀，使用5ml/min的流速。第38/共49页 第三十八页，本课件共有49页 HPLC日常维护总结3安装有seal wash组件的，无论是否使用缓冲盐，开泵之前都应

24、该使之充满流动的液体（10%IPA水溶液）并调流速为23滴/分钟。如果安装有自动Seal Wash，则可以通过软件自动控制。正相色谱、反相色谱切换时应使用IPA过渡，长期使用正相（正己烷等完全非极性溶剂），应更换正相柱塞密封垫。样品进样之前最好过滤，如果样品量太少，可以适当抬高进样针的位置流动相pH长期大于9.5或小于2.3时，进样阀应更换tefzel 转子密封圈。注意不同检测器流通池耐压问题，尽量避免使用pH9.5的流动相，以防腐蚀流通池石英窗，避免使用可能析晶的流动相，防止流通池堵塞。第39/共49页 第三十九页，本课件共有49页1100/1200 HPLC故障诊断几个基本规则重现性：如果

25、问题不重复出现，很难证实其确实存在，也很难诊断问题。唯一性：在排除故障的过程中一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联。恢复原状：如果使用更换组件方法来查找问题根源，则完毕后应将原有原来完好组件安装回原处；否则,换下的组件将来很难再利用,也可能造成误判。预见性：利用成功的故障排除经验来改善您目前的预防保养工作,使现有问题再发率降至最低。良好的记录习惯：一个好记录是成功地进行故障排除的关键。比如软件出了错误提示而关闭，那么最好的办法就是把屏幕copy下来以供诊断使用第40/共49页 3、HPLC常见故障诊断常见故障诊断第四十页，本课件共有49页HPLCHPLC故障诊断故障诊断1

26、-1-系统压力过高系统压力过高首先拧开排液阀，以纯水作流动相并设流速为5ml/min若压力超过10bar，应先更换排液阀的虑芯。若排液阀的虑芯没有堵塞，卸下色谱柱，然后用一个两通代替色谱柱，以水作流动相设流速为1ml/min。通常压力不会超过20bar,否则系统可能有堵塞。若上述的压力超过20bar,我们可按照从后到前的原则，依次拆下各条连接毛细管，最后就可以找到堵塞的地方。容易堵塞的地方：流动池入口管；自动进样器的针及针座；柱温箱加热块。第41/共49页 第四十一页，本课件共有49页HPLCHPLC故障诊断故障诊断2-2-系统压力过低系统压力过低首先拧开排液阀，设流速12ml/min后开泵，

27、观察有无液流；若有再仔细观察液流是否有倒吸现象。如不能确定可用量筒测量流速的准确性。上述无液流，或流速不准多数为主动阀阀芯或主动阀故障，或泵有严重漏液。可以将主动阀阀芯取出进行超声波清洗，也可以进一步尝试拆下出口球阀超声清洗。如仍有问题，可考虑更换阀芯。注意，千万不要把整个主动阀放入超声波清洗这样会损坏主动阀。若上述流速准确但拧紧排液阀后压力不稳定，请仔细检查有无漏液。通常漏液地方：各接口包括色谱柱，泵，进样阀等。第42/共49页 第四十二页，本课件共有49页HPLCHPLC故障诊断故障诊断3-3-保留时间不稳定保留时间不稳定首先观察保留时间是否有规律的变化，并同时观察压力是否稳定。若压力稳定

28、而保留时间呈有规律变化，多数是色谱柱未平衡好，特别是含有盐的流动相，需较长的时间去平衡。若压力稳定而保留时间无规律变化，应检查溶剂过滤头及真空腔是否有堵塞。再平衡色谱柱足够时间，如仍然不佳，可尝试更换一色谱柱。若压力不稳定，检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏等。第43/共49页 第四十三页，本课件共有49页HPLCHPLC故障诊断故障诊断4-4-峰面积重现性不好峰面积重现性不好首先观察压力是否稳定，以及观察峰面积变化是否有规律。若压力不稳定，请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏等。若压力

29、稳定但峰面积呈无规律变化，请检查样品量是否足够，确认样品的稳定性，必要时重新配制。检查进样阀是否漏液等。若压力稳定且峰面积呈规律变化，多数为色谱柱未平衡好。少数的情况进样阀4口阻塞（尤其是经常使用高浓度盐时可能发生）。第44/共49页 第四十四页，本课件共有49页HPLCHPLC故障诊断故障诊断5-5-基线不稳定基线不稳定基线漂移：色谱柱未平衡好，柱温未稳定，流动相变化等。基线噪音：很多原因都会引起基线噪音变大可能原因包括：流通池有气泡，流通池被污染，对紫外检测器可将流通池移走即可确认。色谱柱和或系统受污染。灯能量不足。外界因素影响，如电源，温度和湿度等。第45/共49页 第四十五页，本课件共

30、有49页HPLC在环保方面的应用五、五、HPLC的应用的应用1、农药残留量分析、农药残留量分析：含氯农药：含氯农药、有机磷、有机磷 农药农药、除虫菊等、除虫菊等2、致癌物质、致癌物质：硝基呋喃及其代谢物、霉素：硝基呋喃及其代谢物、霉素、亚硝、亚硝胺、苯并芘等胺、苯并芘等3、水质分析：内分泌污染物等、水质分析：内分泌污染物等4、其它、其它第46/共49页 第四十六页，本课件共有49页HPLC在生化方面的应用在生化方面的应用1、蛋白质分析、蛋白质分析2、肽类的分析、肽类的分析3、核酸、核酸4、氨基酸、氨基酸 5、其它、其它第47/共49页 第四十七页，本课件共有49页HPLC在医药方面的应用在医药方面的应用1、新药研发：目标物的检测、纯度等、新药研发：目标物的检测、纯度等2、药品的预处理：片剂，油膏，水剂等、药品的预处理：片剂，油膏，水剂等3、体液：血、尿、脊椎液、唾液等、体液：血、尿、脊椎液、唾液等4、抗菌素、抗菌素：青霉素：青霉素、甾族、甾族(激素激素)等等 5、其它、其它第48/共49页 第四十八页，本课件共有49页第49/共49页 第四十九页，本课件共有49页