人类基因组提取精选课件.ppt

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1、关关于人于人类类基因基因组组提取提取第一页，本课件共有45页人类基因组人类基因组DNADNA的提取的提取第二页，本课件共有45页提取方法提取方法:1从全血中提取2从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取第三页，本课件共有45页(全血）原理：全血）原理：v细胞裂解液：裂解细胞膜，收集细胞核vSDS：破裂核膜：破裂核膜v蛋白酶K K：使核蛋白降解成小片段并从DNADNA上解离 下来vv苯酚苯酚氯仿氯仿：抽提去除蛋白质：抽提去除蛋白质vv无水乙醇无水乙醇：沉淀DNAv75%乙醇乙醇：洗涤DNADNA沉淀沉淀真空干燥后，溶解于TETE中即得到高分量的DNADNA第四页，本课件共有45页（全血）操作方法：（全

2、血）操作方法：细胞裂解与细胞裂解与细胞裂解与细胞裂解与RNase/RNase/RNase/RNase/蛋白酶蛋白酶K K K K 消化消化1.1.取100 100 ll抗抗凝凝全全血血置置于于1.5ml 1.5ml EppendorfEppendorf离离心心管管中中，再再加加入入100 100 ll裂裂解解液液和和20 l RNaseA/蛋白酶K液液，用用移移液液器器来来回回吹吹打打混混匀匀，室室于于5555温温浴浴3535分分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。2.加加入入10l 3M的的NaAc(pH NaAc(pH 4.8)4.8

3、)，随随后后加加入入1250 1250 ll结结合合缓缓冲冲液液，充充分分振振荡荡混混匀匀，12，000 rpm离离心心30秒。第五页，本课件共有45页DNADNADNADNA与吸附柱结合与吸附柱结合与吸附柱结合与吸附柱结合3用移液器TipTip转转移移上上清清并并加加入入到到离离心心吸吸附附柱柱（套套好好收收集集管管）中中，放放置置1分分钟钟，1212，000 000 rpmrpm离离心心3030秒，倒掉收集管中的废液。注注意意：待转移上清约1300l1300l，离离心心吸吸附附柱柱容容量量约约650 650 ll，故需每次转移上清650 l到到离离心心吸吸附附柱柱中，离心，倒掉收集管中的废

4、液，重复实验操作步骤中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。第六页，本课件共有45页DNADNADNADNA的纯化的纯化的纯化的纯化:4.再再加加入入600 600 ll洗涤缓冲液（washing washing bufferbuffer）到到离离心心吸吸附附柱柱（套套好好收收集集管管）中中，12，000 000 rpm rpm 离离心心3030秒。5 5重重复复步步骤骤4一次，12，000 000 rpm rpm 离离心心3分分钟钟以以充充分除去洗涤缓冲液。分除去洗涤缓冲液。6小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50

5、 50 ll洗脱缓冲液(elution(elution buffer)buffer)到到离离心心吸吸附附柱柱中中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置放置1 1分钟，于分钟，于1212，000 rpm 离心30秒。秒。7取出Eppendorf Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组NANA。第七页，本课件共有45页（口腔上皮脱落细胞）原理（口腔上皮脱落细胞）原理 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA,除特殊要求外，白细胞，肝或脾组织是最常用的的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞，有时为了简易，还可以无创伤的采集材料，如用口

6、腔上皮脱落细胞，发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞；第八页，本课件共有45页（口腔上皮脱落细胞）操作方法：（口腔上皮脱落细胞）操作方法：1 1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心1010分钟，倒掉上清液；重复1次。次。2 2、沉沉淀淀中中加加1ml 1细胞核裂解液(STE)，打散细胞团、混匀，再加酶解混合液（含350l STE、150l 150l 10%10%SDSSDS和和10l 20mg/ml蛋蛋白白酶酶K K），摇摇匀匀，至至出出现现粘粘稠稠透透明明状状。3737温箱过夜或5034小时。

7、第九页，本课件共有45页3、加加等等体体积积饱饱和和酚酚（或或1/3体积的饱和NaCl），轻摇混匀10分钟，室温2000rpm2000rpm离心1010分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。的沉淀。4、小小心心移移上上清清至至另另一一离离心心管管（尽尽量量避避免免吸吸取取中中间间层层），加等体积氯仿混匀加等体积氯仿混匀5 5分钟，室温2000rpm2000rpm离心离心5分钟。5、重复步骤4一次。一次。第十页，本课件共有45页6、将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2.52.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNADNA沉沉淀淀，在

8、在新新配配制制的的70%70%乙乙醇醇洗洗二二次次，室室温温干燥干燥5分钟，再将DNADNA溶于溶于20-100l TE20-100l TE中。7 7、TE溶溶解解的的DNA，在在44下可保存一年，如要求长期保存，则需加2 2倍体积无水乙醇置-70-70保存。保存。第十一页，本课件共有45页 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第十二页，本课件共有45页一、一、概概念念核酸酶内切酶外切酶限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：能识别双链能识别双链DNA分子内部的分子内部的特异位点并裂解特异位点并裂解磷酸二酯键磷酸二酯键第十三页，本课件共有45页二、分二、分类类vv分分类类依据：酶的基因、蛋白依据：酶的

9、基因、蛋白质结构质结构、依、依赖赖的的辅辅助因子及助因子及与与DNADNA结结合和裂解的特合和裂解的特异异性性特性特性I I类类II II类类IIIIII类类内内内内切酶的蛋白切酶的蛋白切酶的蛋白切酶的蛋白结构结构结构结构单单单单一多功能的酶一多功能的酶一多功能的酶一多功能的酶内内切酶和甲基化酶切酶和甲基化酶分分开开共同共同共同共同亚亚亚亚基的基的基的基的双双双双功能功能功能功能酶酶酶酶限制和修限制和修限制和修限制和修饰饰饰饰活性活性活性活性3 3种种种种不同的不同的不同的不同的亚亚亚亚基基基基单单一成分一成分2 2种种种种不同的不同的不同的不同的亚亚亚亚基基基基所需所需所需所需辅辅辅辅助因子

10、助因子助因子助因子ATM,Mg2+,SAMATM,Mg2+,SAMMg2+Mg2+ATM,Mg2+,SAMATM,Mg2+,SAM寄主特寄主特寄主特寄主特异异异异性位点性位点性位点性位点识识识识别别别别序列序列序列序列EcoB:TGA(N)8TGCTEcoB:TGA(N)8TGCTEcoK:AAC(N)6GTGCEcoK:AAC(N)6GTGC回文序列回文序列（IIsIIs型除外）型除外）EcoP1:AGACCEcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAGEcoP15:CAGCAG第十四页，本课件共有45页 切割位点切割位点在距离在距离识别识别位点至位点至少少1000pb1000pb处随处随

11、机切机切开开一一条单链条单链位于寄主特位于寄主特异异性位性位点或其附近点或其附近距寄主特距寄主特异异性位点性位点33端端24-26pb24-26pb处处酶催酶催酶催酶催转换转换转换转换不能不能不能不能能能能能能能DNADNA易位作用易位作用易位作用易位作用能能能能不能不能不能不能不能不能甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点寄主特寄主特寄主特寄主特异异异异性位点性位点性位点性位点寄主特寄主特异异性位点性位点寄主特寄主特寄主特寄主特异异异异性位点性位点性位点性位点识别为识别为识别为识别为甲基化的序甲基化的序甲基化的序甲基化的序列列列列进进进进行切割行切割行切割行切割能能

12、能能能能能能能能序列特序列特序列特序列特异异异异的切割的切割的切割的切割不是不是不是不是是是是是是是基因工程中的用途基因工程中的用途基因工程中的用途基因工程中的用途无用无用无用无用十分有用十分有用作用不大作用不大作用不大作用不大第十五页，本课件共有45页三、作用机制三、作用机制 以环状或线性的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核苷酸糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3-羟基和5-磷酸基的DNA片段。第十六页，本课件共有45页四、切割方法四、切割方法识别和切割位点 4-6个碱基对且具有回文序列回文序列的DNA片段 大多数酶

13、是错位切割产生大多数酶是错位切割产生55或者3黏性末端例如：EcoR I 切割后产生5黏性末端黏性末端55-GAATTC-3 5-G AATTC-3AATTC-3 5-G AATTC-33-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5第十七页，本课件共有45页黏性末端黏性末端第十八页，本课件共有45页平末端平末端有一些酶沿对称轴切断DNA，产生的末端称为平端或钝端例如:SmaI第十九页，本课件共有45页同工异源酶同工异源酶 来源不同的酶，但能识别和切割同一位点 如如BamH I BamH I 和和Bst I(GBst I(GGATCC)同尾酶同尾酶 有些限制性内切酶识别序列不同，但是产生相有些限制

14、性内切酶识别序列不同，但是产生相 同的黏性末端。同的黏性末端。如如BamH IBamH I（GGATCCGGATCC）和）和 Sau3A I(NGATCN)琼脂糖凝胶电泳结果分析第二十页，本课件共有45页琼脂糖凝胶电泳结果分析琼脂糖凝胶电泳结果分析第二十一页，本课件共有45页琼脂糖凝胶电泳结果分析琼脂糖凝胶电泳结果分析 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶:天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些集团带有点荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。第二十二页，本课件共有45页 什么是琼脂糖凝胶电泳？琼脂糖凝

15、胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂凝胶分子筛作用，核算片段因其分子量或者分子形状不同，电泳速度有差异而分离。这种技术是基因操作的一种方法。第二十三页，本课件共有45页琼琼脂糖凝脂糖凝胶电胶电泳原理泳原理v琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力,同时也由此造成了经过一定时间的泳动后按大小形成的一条“条带”。其中线状的DNA可以通过。第二十四页，本课件共有45页琼琼脂糖凝脂糖凝胶电胶电泳原理泳原理:核酸分子是两性解离分子，在高于其

16、等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。第二十五页，本课件共有45页 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳对对核核酸酸的的分分离离结结果果与与核核酸酸的的分分子子量量、分分子子构构型型和和凝凝胶胶浓浓度度密切相关。密切相关。实实验验证证明明，DNADNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比。通过比较标准物与未知片段的移动距离便可测出未知片段的大小。但当DNA分分

17、子子超超过过20kb时时，普普通通琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶就就很很难难讲讲它们分开。它们分开。第二十六页，本课件共有45页1 1)核酸的分子量核酸的分子量质粒质粒DNADNA有三种形式有三种形式v1、共价闭环共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在常以超螺旋形式存在v 2 2、开环开环DNADNA:质粒质粒DNADNA两条链中有一条发生一处或多处两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子 vv 3、线性DNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.第二十七页，本课件共有45页2 2）核酸构型）核酸构型 不不同同构构型型的的DNA

18、在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中的的电电泳泳速速度度差差别别较较大大。在在分子量相当的情况下，不不同同构构型型的的质质粒粒DNA的移动速度次序为：共共价价闭闭环环DNADNA直直线线DNA开开环环的的双双链链环环状状DNA。这三种构型的相对迁移速率主要取决于凝胶浓度，同时也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。的影响。第二十八页，本课件共有45页超螺旋DNA：尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动它在凝胶中

19、的泳动速度最快速度最快。线性线性DNA：当DNADNA损伤在DNADNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNADNA，这种DNA的泳动速的泳动速率率介于超螺旋与切口质粒超螺旋与切口质粒DNA之间。之间。第二十九页，本课件共有45页开环DNA：在质粒DNADNA复制过程中，拓扑异构酶I I会在DNADNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢速率最慢，其，其“松散松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运

20、动。第三十页，本课件共有45页 一定大小的DNA片片段段在在不不同同浓浓度度的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中的的电电泳泳迁迁移移率率不不同同。要要有有效效地地分分离离大大小小不不同同的的DNADNA片片段，需选用适当的琼脂糖凝胶浓度。段，需选用适当的琼脂糖凝胶浓度。3 3）琼脂糖的浓度）琼脂糖的浓度第三十一页，本课件共有45页琼脂糖凝胶电泳的应用。琼脂糖凝胶电泳的应用。第三十二页，本课件共有45页vv蛋蛋白白质质和和核核酸酸，由由于于pH的的不不同同带带有有不不同同电电荷荷，且且在在电电场场中中受受力力大大小小不不同同，导致发生泳动的速度不同，最终可将其分离开来。v电泳缓冲液的pH在在6969之之

21、间间，离离子子强强度度0.020.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的的DNA片片段段，其其分分辨辨率率虽虽比比聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶低低，但但它它制制备备容容易易，分分离离范范围围广广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的的范范围围为为0.2-20kb0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNADNA片段。第三十三页，本课件共有45页vv电泳的缓冲液中充满了离子，因此可以导电。电泳的缓冲液中充满了离子，因此可以导电。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。极移动。由于糖由于糖-磷酸骨架在

22、结构上的重复性质，磷酸骨架在结构上的重复性质，相同相同数量的双链数量的双链DNADNA几乎具有等量的净电荷几乎具有等量的净电荷，因此它们能以，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。同样的速率向正极方向移动。第三十四页，本课件共有45页琼琼脂糖凝脂糖凝胶电胶电泳注意点泳注意点选择合适的电泳方法选择合适的电泳方法vv琼脂糖凝胶电泳：一般的核酸检测琼脂糖凝胶电泳：一般的核酸检测vv聚丙烯酰胺凝胶电泳：高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳：高分辨率v脉冲凝胶电泳：DNA链巨大链巨大凝胶浓度 浓度通常在浓度通常在0.50.52%之间，低浓度的用于大片段核酸的电泳，高浓度的用于小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使

23、用质量好的琼脂糖是解决办法。注意：高浓度的胶可能使分子大小相近的DNADNA带不易分辨，造成带不易分辨，造成条带缺失现象。条带缺失现象。第三十五页，本课件共有45页 缓冲液缓冲液:常常用用的的缓缓冲冲液液有有TAETAE和和TBE，而TBETBE比比TAE有着更好的缓冲能力。使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意：电电泳泳缓缓冲冲液液多多次次使使用用后后，离子强度降低，pHpH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电电泳泳产产生生条条带带模模糊和不规则糊和不规则的DNADNA带迁移的现象。带迁移的现象。第三十六页，本课件共有45页 电压和温度:电泳时电压不应该超过20V/cm20V/cm，电电

24、泳泳温温度度应应该该低低于于3030，对于巨大的巨大的DNADNA电泳，温度应该低于1515。注注意意：如如果果电电泳泳时时电电压压和和温温度度过过高高，可可能能导导致致出出现现条条带带模模糊糊和和不不规规则则的的DNADNA带迁移的的现现象象。特特别别是是电电压压太太大可能大可能导导致小片段致小片段跑跑出出胶胶而出而出现现缺缺带现带现象象第三十七页，本课件共有45页 DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计比较准确。需要注意的是Marker的电泳同样要符合DNA电泳

25、的操作标准。第三十八页，本课件共有45页核酸染色核酸染色剂剂 实验室常用的核酸染色剂是实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB）溴溴化化乙乙锭锭（EB）：是是一一种种吖吖啶啶类类染染料料，它它在在紫紫外外灯灯照照射射下下能能发发射射荧荧光光，当当DNADNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就就插插入入DNADNA分分子子中中形形成成荧荧光光络络合合物物，使使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射检测琼脂糖中的DNAvv优点：染色效果好，操作方便优点：染色效果好，操作方便v缺点：稳定性差，具有毒性。vv注注意意：观观察察凝凝胶胶时时应应根根据据染染料料不不同同使使用用合合

26、适适的的光光源源和和激激发发波波长长，如如果果激激发发波波长长不不对对，条条带带则则不不易易观观察察，会会出现条带模糊的现象。出现条带模糊的现象。第三十九页，本课件共有45页DNA样样品的品的纯纯度和度和状态状态v样品中含盐量太高和含含杂杂质质蛋蛋白白均均可可以以产产生生条条带带模模糊糊和条带缺失的现象。和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。vv变变性性的的DNA样样品品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNADNA条带迁移。条带迁移。用用20mM NaCl20mM NaCl缓冲液稀释可以防止缓冲液稀释可以防止DNADNA变性第四十页，本课件共有45页DNADN

27、A的上样的上样 正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。第四十一页，本课件共有45页琼脂糖凝胶电泳操作步骤琼脂糖凝胶电泳操作步骤v1 制备琼脂糖凝胶v2.胶板制备v3.加样v4.电泳v5.漂洗v6.观察照相第四十二页，本课件共有45页琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用v检测提取的DNAv设计完成引物，扩增好基因序列，做完PCR后，检测是否成功。v观察限制性内切酶的切割结果v通过切胶回收纯化某个片段第四十三页，本课件共有45页实验结果观察及记录实验结果观察及记录v在波长为254nm的长波长紫外灯下，观察染色的或已加有EB的电泳胶板v记录下结果，找出实验中的问题及不足。第四十四页，本课件共有45页感谢大家观看第四十五页，本课件共有45页