真核细胞提取与酶切鉴定精选课件.ppt

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1、关于真核细胞提取与酶切鉴定第一页，本课件共有35页实验本身实验本身:实验室规则实验室规则:时间、穿着、时间、穿着、仪器不能乱动仪器不能乱动、赔偿制度、赔偿制度、整洁、卫生。整洁、卫生。实验报告（如实记录）实验报告（如实记录）规范操作规范操作（辨认标签（辨认标签）、）、污染物、毒物、废弃物污染物、毒物、废弃物（酸碱烧伤大量自来水冲洗）（酸碱烧伤大量自来水冲洗）实验实验 第二页，本课件共有35页实验报告要求实验报告要求题目，组号题目，组号实验目的实验目的实验原理实验原理实验操作：如实记录实验操作：如实记录实验结果及结果分析：实事求是实验结果及结果分析：实事求是讨论或小结：认真分析，仔细思考讨论或小

2、结：认真分析，仔细思考第三页，本课件共有35页4真真核核细细胞胞基基因因组组DNA的的分分离离提提取取及及酶酶切切电电泳泳第四页，本课件共有35页 实验目的实验目的1.1.掌握人外周血基因组掌握人外周血基因组DNADNA的提取原理、提的提取原理、提取方法和注意事项。取方法和注意事项。2.2.学习琼脂糖凝胶电泳分离鉴定学习琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNADNA的原理的原理 和技术。和技术。第五页，本课件共有35页n基因组基因组DNADNA提取的操作流程提取的操作流程 实验步骤实验步骤第六页，本课件共有35页、取、取0.3ml0.3ml抗凝全血，加入到抗凝全血，加入到1.5ml 1.5ml Eppen

3、dorf Eppendorf 离心管中。离心管中。n 抗凝剂抗凝剂 EDTA-NaEDTA-Na2 2、枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂、枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂 第七页，本课件共有35页、加入、加入1ml STMT1ml STMT，充分混匀，充分混匀 使其溶血使其溶血。nSTMT（破坏细胞膜（破坏细胞膜)s sugarugar：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNADNA受机械作受机械作 用而降解。用而降解。T TrisrisHCl:HCl:不含金属离子不含金属离子,与与EDTAEDTA更能稳定更能稳定DNADNA的活性。的活性。M MgClgCl2 2:提供提供MgMg2

4、+2+，稳定，稳定DNADNA。T Triton X-100:riton X-100:非离子去污剂（表面活性剂），直接破裂非离子去污剂（表面活性剂），直接破裂 血中红细胞和白细胞膜，释出血红蛋白及血中红细胞和白细胞膜，释出血红蛋白及 细胞核。细胞核。第八页，本课件共有35页、10000g10000g离心离心2min2min，弃上清，弃上清。n注意离心机的使用注意离心机的使用 配平配平 上清丢弃到废液缸，尽量空净。上清丢弃到废液缸，尽量空净。第九页，本课件共有35页4 4、用、用0.4ml0.4ml生理盐水洗沉淀，生理盐水洗沉淀，10000g10000g 离心离心2min2min，弃上清。，弃上

5、清。n注意离心机的使用注意离心机的使用 配平配平 上清丢弃到废液缸，尽量空净。上清丢弃到废液缸，尽量空净。第十页，本课件共有35页、加、加450lNE450lNE溶液将沉淀重新悬浮。溶液将沉淀重新悬浮。nNENaCL:50mmol/L NaCL:50mmol/L EDTA:1.EDTA:1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2.2.降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性第十一页，本课件共有35页、加、加50l 10%SDS50l 10%SDS，迅速混匀，迅速混匀;再加再加50l50l蛋蛋 白酶白酶K K，轻轻摇匀后置，轻轻摇匀后置5050水浴水浴1h1h。nSDSSDS 1

6、.1.溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂2.2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来3.3.对对RNARNA、DNADNA酶有抑制作用酶有抑制作用4.4.与蛋白质形成与蛋白质形成R-O-SO3 R-O-SO3.R.R蛋白质复合物，使蛋白质变性蛋白质复合物，使蛋白质变性n蛋白酶蛋白酶K(K(或链霉蛋白酶或链霉蛋白酶)广谱蛋白酶，水解蛋白质。能在广谱蛋白酶，水解蛋白质。能在SDSSDS和和EDTAEDTA的存在下保持很高的存在下保持很高的活性。的活性。第十二页，本课件共有35页、加入、加入TETE饱合酚饱合酚500l

7、500l，轻摇，轻摇2min2min，10000g10000g离心离心 1min1min，将上层水相移至另一新，将上层水相移至另一新EppendorfEppendorf管内。管内。n酚能有效地使蛋白质变性；酚能有效地使蛋白质变性；n酚不能抑制酚不能抑制RNAaseRNAase的活性；的活性；n酚能溶解入酚能溶解入1010一一1515的水分。的水分。第十三页，本课件共有35页、加入、加入酚氯仿异戊醇酚氯仿异戊醇混合液混合液500l500l，轻摇，轻摇 1min1min，10000g10000g离心离心1min1min，将上层水相移至另，将上层水相移至另 一一EppendorfEppendorf管

8、内。管内。n氯仿也是一种蛋白变性剂，但氯仿的变性作用不氯仿也是一种蛋白变性剂，但氯仿的变性作用不如酚。如酚。n氯仿有助于加速有机相和水相的分离；氯仿有助于加速有机相和水相的分离；n使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一一使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一一种有机溶剂效果好。酚和氯仿两者交替反复抽提，种有机溶剂效果好。酚和氯仿两者交替反复抽提，还可克服酚的缺点。还可克服酚的缺点。第十四页，本课件共有35页、加入、加入氯仿异戊醇氯仿异戊醇混合液混合液500l500l，轻摇，轻摇 1min1min，10000g10000g离心离心1min1min，将上层水相移至另，将上层水相移至另 一新一新

9、EppendorfEppendorf管内。管内。（定体积）（定体积）n移上清时要定量，宁少勿多移上清时要定量，宁少勿多n氯仿：氯仿：将残留在水相中的酚带走将残留在水相中的酚带走 也可以再次使蛋白变性也可以再次使蛋白变性n异戊醇：异戊醇：降低分子表面张力，减少气泡产生降低分子表面张力，减少气泡产生 有助于分层有助于分层 上层为水相上层为水相 中间为变性的蛋白中间为变性的蛋白 下层为有机相下层为有机相第十五页，本课件共有35页1010、向上清中加入、向上清中加入1/101/10体积的体积的NaAc NaAc，并混匀。，并混匀。再加入再加入2 2倍体积的冰冻无水乙醇，充分混匀，倍体积的冰冻无水乙醇，

10、充分混匀，于于8080放置放置10min10min。n核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，能与钠、钾、核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，能与钠、钾、镁等很多镁等很多1 1价、价、2 2价阳离子形成盐类而沉淀，在许多价阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。n最常用的沉淀剂为最常用的沉淀剂为1 1价钠、钾、铵和锂等离子盐类，如价钠、钾、铵和锂等离子盐类，如醋酸钠、氯化钠等。醋酸钠、氯化钠等。n常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。第十六页，本课件共有35页1111、10,000g10,000g离心

11、离心5min5min，弃上清，弃上清,将小将小 管倒置于滤纸上。室温干燥管倒置于滤纸上。室温干燥10min10min。第十七页，本课件共有35页1212、加入、加入20l20l双蒸水溶解基因组双蒸水溶解基因组DNA DNA。基因组基因组DNA 8lDNA 8l10 10 X X H H 缓冲液缓冲液 1l 1l EcoR 1l EcoR 1l 离心甩一下，离心甩一下，3737温浴温浴1h1h。另外剩余的另外剩余的10l10l留做电泳分析用。留做电泳分析用。酶切酶切体系体系第十八页，本课件共有35页 酶切注意事项酶切注意事项n按顺序加样，每加一个样品更换一次按顺序加样，每加一个样品更换一次tip

12、tip头头n一定要将酶加进去一定要将酶加进去n加酶的时候一定保证低温，在冰上操作加酶的时候一定保证低温，在冰上操作n加完后要充分混匀，用离心机加完后要充分混匀，用离心机“甩甩”一下再水浴一下再水浴（配平后，随意调时间，将转速调到接近最大值，（配平后，随意调时间，将转速调到接近最大值，即刻再调回零）即刻再调回零）第十九页，本课件共有35页1313、1 1琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测(上样量上样量10l)10l)n10L 10L 酶切后基因组酶切后基因组DNADNA 2L 6Loading buffer 2L 6Loading buffern1010基因组基因组DNADNA 2L 6Loa

13、ding buffer 2L 6Loading buffern10L Marker10L Markern1TBE 1TBE 恒压恒压100V 100V 电泳电泳 0.5-1h0.5-1h第二十页，本课件共有35页 实验原理实验原理核酸：包括核酸：包括DNADNA、RNARNA两种分子。两种分子。DNADNA RNA RNA多呈单链线性分子多呈单链线性分子双链线性分子双链线性分子双链环状分子双链环状分子第二十一页，本课件共有35页 真核生物真核生物DNADNA95%95%存在于细胞核存在于细胞核5%5%存在于细胞器存在于细胞器真核生物真核生物RNARNA10%10%存在于细胞核存在于细胞核15%

14、15%存在于细胞器存在于细胞器75%75%存在于细胞质存在于细胞质第二十二页，本课件共有35页 分离纯化核酸总的原则分离纯化核酸总的原则n应保证核酸一级结构的完整性应保证核酸一级结构的完整性n排除其它分子的污染排除其它分子的污染第二十三页，本课件共有35页 完整性的保证完整性的保证n尽量简化操作步骤，缩短提取过程尽量简化操作步骤，缩短提取过程n减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解n减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解 如机械剪切力、高温如机械剪切力、高温n防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解 DNADNA酶、酶、RNARNA酶酶第二十四页，本课件共有35页 纯度的保证纯

15、度的保证n核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子剂和过高浓度的金属离子n其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度应降低到最低程度n排除其它核酸分子的污染排除其它核酸分子的污染第二十五页，本课件共有35页 从全血中制备基因组从全血中制备基因组DNADNA n首先用去污剂首先用去污剂TritonX-100TritonX-100直接破裂红细胞和白细胞膜，使直接破裂红细胞和白细胞膜，使之释放出血红蛋白及细胞核，通过离心分离即可获得白细之释放出血红蛋白及细胞核，通过离心分离即可

16、获得白细胞核；胞核；n用用SDSSDS破坏核膜；用破坏核膜；用EDTAEDTA抑制抑制DNaseDNase的活性；蛋白酶的活性；蛋白酶K K将蛋白质降将蛋白质降解成小肽或氨基酸，从而使解成小肽或氨基酸，从而使DNADNA释放入水相中。释放入水相中。n用酚氯仿抽提除去蛋白质，再用氯仿除去用酚氯仿抽提除去蛋白质，再用氯仿除去DNADNA溶液中残存的溶液中残存的蛋白质及酚；蛋白质及酚；n用无水乙醇沉淀水相中的用无水乙醇沉淀水相中的DNADNA，即可获得基因组，即可获得基因组DNADNA。破裂细胞破裂细胞消化蛋白质消化蛋白质有机抽提除去蛋白质有机抽提除去蛋白质沉淀水相沉淀水相中的中的DNA第二十六页，

17、本课件共有35页DNADNA抽提示意图抽提示意图第二十七页，本课件共有35页 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶是是识识别别DNADNA的的特特异异序序列列,并并在在识识别位点或其周围切割双链别位点或其周围切割双链DNADNA的一类的一类内切酶内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HMolecular scissor第二十八页，本课件共有35页 均来自微生物，并据此而进行命名；均来自微生物，并据此而进行命名；识别序列长度识别序列长度常为常为4 4 8 8 核苷酸序列核苷酸序列 ;大部分酶识别序列呈二元旋转对称结构大部分酶识别序列呈二元

18、旋转对称结构 即即回文结构回文结构 ;其切割后的其切割后的DNADNA可产生不同的末端。可产生不同的末端。限制酶的特点（限制酶的特点（类酶）类酶）第二十九页，本课件共有35页 DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 n琼脂糖是从海洋植物琼脂中提取来的，为一琼脂糖是从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合链线性分子。种聚合链线性分子。n线性线性DNADNA分子在电场中的迁移率与其分子量的分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比对数成反比 nDNADNA的空间构型不同，即使分子量相同其的空间构型不同，即使分子量相同其迁移率也不相同迁移率也不相同 第三十页，本课件共有35页 核酸电泳的染色剂核酸

19、电泳的染色剂 n最常用的是溴乙锭染色法。最常用的是溴乙锭染色法。n(ethidium bromide(ethidium bromide，EB)EB)n对对1ng RNA1ng RNA，DNADNA均可显色。均可显色。nEBEB染料是一种强烈的诱变剂，操作时应注意防护，染料是一种强烈的诱变剂，操作时应注意防护，应戴上聚乙烯手套。应戴上聚乙烯手套。n在紫外线激发下，发出红色荧光在紫外线激发下，发出红色荧光(590nm(590nm）。第三十一页，本课件共有35页 实实 验验 结结 果果酶切后的基因组酶切后的基因组DNADNA第三十二页，本课件共有35页基因组基因组DNADNA第三十三页，本课件共有35页微量加样器的使用注意最大量程，两挡之间的关系；使用时应在量程之内调节，超过量程会损坏加样器用镊子取枪头（tip头），推出tip头勿用用力过猛不能将加样器倒置以防液体倒流损坏加样器；加样器的枪头（tip头）一定要拧紧第三十四页，本课件共有35页感感谢谢大大家家观观看看第三十五页，本课件共有35页