体外受精技术精选课件.ppt

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1、关于体外受精技术第一页，本课件共有71页体体外外受受精精的的概概念念狭义：将动物受精过程中的精卵结合在体外环境下完成的现象。包括自然条件下的体外受精(两栖类和鱼类)，和人为培养条件下的体外受精(哺乳动物)。广义：经过特殊处理的精子在体外使卵母细胞受精的技术，所以体外受精的胚胎移植后所生婴儿又称为“试管婴儿”。包括卵母细胞的体外成熟和受精卵的体外培养两项配套技术。优点：与体内受精相比，所需精子数减少，提高精液利用率。Example:流式细胞含仪分离的性控精子只能用于体外受精。第二页，本课件共有71页国国内内外外研研究究现现状状 1878年，Schenk(Germany)将体内成熟的家兔和豚鼠卵子

2、与附睾精子放入子宫液中培养，观察到第二极体的排出和卵裂现象；1945年，张明觉(华裔)偶然获得兔体外受精卵，但无重复性，且无试管动物出生；1951，张明觉与Austin(澳)同时发现精子获能现象；1959年，他首次获得体外受精兔；80年代以来，对胚胎需求量的加大，促进了家畜体外受精的研究，牛、绵羊、山羊、猪等体处胚相继获得了成功，国内90年代在家畜上也获得了成功；现已将卵母细胞体外成熟-体外受精-早期胚体外发育-冷冻保存结合在一起，建立工厂化胚胎生产。第三页，本课件共有71页国国内内外外研研究究现现状状世界体外受精的首创纪录动物种类首创纪录文献兔Thibault(1954)叙利亚仓鼠Yanag

3、inmachi,chang(1963)小鼠Whittingham(1968)中国仓鼠Pickworth,Chang(1969)猫Hammer(1970)土拨鼠Yanagimachi(1972)大鼠Miyamoto,Chang(1973)狗Mahi,Yanagimachi(1976)牛Brackett(1978)猪Iritani,Niwa(1977)绵羊Bondioli,Wright(1980)山羊花田章(1985)第四页，本课件共有71页国国内内外外研研究究现现状状我国体外受精的首创纪录动物种类首创纪录文献小鼠陈秀兰(1986)兔范必勤(1987)绵羊旭日干(1989)牛旭日干(1989)山羊

4、钱菊汾(1990)猪范必勤(1990)水牛蒋和生(1993)第五页，本课件共有71页体体外外受受精精技技术术流流程程 卵母细胞的体外成熟 精子的体外获能 卵母细胞的体外受精 受精卵的体外发育 配子的冷冻保存第六页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的采集与体外培养1.1.离体采集离体采集：30min内取卵巢，置生理盐水或PBS（25-35），3h内回收。卵泡抽吸法：卵泡抽吸法：针头穿刺，一次进针可抽吸卵巢皮质的多个卵泡 优点：回收速度快，不易造成卵母细胞的污染；缺点：容易损伤卵母细胞周围的卵丘细胞，影响其随后的成熟。第七页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产

5、技技术术要要点点卵母细胞的采集 卵巢解剖法卵巢解剖法：卵巢切为两半，去掉中间的髓质部分，刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗 优点：能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回收率也相对较高；缺点：回收的速度相对较慢，容易造成污染。第八页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的采集2.2.活体采集活体采集(Ovum Pick-Up,OPU)(Ovum Pick-Up,OPU)腔镜法腔镜法：腹壁切开一小口，插入腹腔镜，操作杆和穿刺针，配合将卵母细胞抽吸出来优点：比较直观，容易掌握；缺点：工作量大，对母牛有损伤，不能频繁手术。第九页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术

6、术要要点点卵母细胞的采集 B B型超声波法：型超声波法：超声波探头和采卵器插入到阴道子宫颈的一侧穹隆处。术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进行穿刺而将卵母细胞抽出 优点：不用手术，操作速度快，对母牛损伤小，可频繁采卵，且亦可对妊娠母牛采卵；缺点：操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备。第十页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的筛选 只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（B级）(1层以上卵丘细胞）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。A级：卵丘细胞致密，至少有5层以上；B级：卵丘细胞为2-4层；C级：卵

7、母细胞大部分被包裹；D级：卵母细胞少量被包裹；E级：裸卵。A、B级可用于培养，C、D级成熟率低。第十一页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟卵母细胞成熟目的：提供可利用的卵母细胞用于体外受精、克隆等；研究其体内成熟的模型。卵母细胞体外成熟的特征 生发泡破裂；染色体凝集；纺缍体形成；极体排出；透明带软化；卵丘细胞扩展。第十二页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟卵母细胞成熟培养液 以TCM-199较好，可使牛、羊、猪的卵母细胞体外成熟率高达80%以上。添加成分：促性腺激素：FSH、LH FCS、BSA：有认为FCS比

8、BSA好，而发情牛血清或发情羊血清比FCS好。抗生素第十三页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟培养1.Oocyte Collection Medium(OCM)2.最常用的是碳酸氢钠或Hepes缓冲的TCM-199;2.Oocyte Maturation Medium（1)Bovinesteerserum(2)Folltropin(3)Estradiol(4)NaPyruvate(5)Glutamine第十四页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟培养2.2.成熟培养时间成熟培养时间 一般22h-24h，但猪40h

9、-44h，马30h-36h，兔仅12h-15h 3.3.成熟培养的温度和气相环境成熟培养的温度和气相环境 人和啮齿类动物：37 牛、猪、羊和马等：3839。pH：7.7好于7.1，7.4，8.0 渗透压：330 Osm/kg好于300，320 气相：5%CO2 5%CO25%O290%N2 第十五页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟培养4.IVM4.IVM系统系统 开放培养系统开放培养系统 1ml-2ml成熟培养液直接置于平皿内或培养板内，放入50枚-200枚卵母细胞培养，上面不盖石蜡油。优点：简单，对培养液中的脂溶性物质没有若影响，能同时培养大量细胞

10、 缺点：渗透压变化较大，容易污染 第十六页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟培养 微滴培养系统微滴培养系统 将成熟培养液在做成50-500l的微滴，覆石蜡油，将卵母细胞置于其中培养。优点：渗透压比较稳定，不易污染；缺点：对脂溶性物质有稀释作用，成本高，培养结果易受石蜡油质量的影响。密闭培养系统密闭培养系统 置12ml培养液的试管中，胶塞，在培养箱或恒温水浴中培养；若采用培养皿或微滴培养，则可将其装入密闭的塑料袋内。优点：不要CO2培养箱，方便运输 缺点：pH不如前者稳定。第十七页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成

11、熟卵母细胞成熟的标志 第一极体的排出、卵丘细胞的扩展可作为成熟的标志，而生发泡破裂(GVBD)是卵母细胞恢复减数分裂的主要标准，因此常用地衣红染色才可判断。牛卵母细胞体外成熟标准：1级成熟卵：卵丘细胞完全扩展，卵丘细胞至少向外扩展3倍于裸卵直径；2级成熟卵：卵丘细胞中等扩展，卵丘细胞至少向外扩展2倍于裸卵直径；3级成熟卵：卵丘细胞轻度假扩展，卵丘细胞仍紧紧粘附于透明带上。1级和2级卵通常均已排出第一极体。第十八页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞体外成熟的质量评定 形态观察：形态观察：细胞质均匀、没有空泡 固定染色法固定染色法 ：0.1%透明质酸酶 醋酸酒精或醋

12、酸甲醇（1:3）固定24h48h 1%间苯二酚兰（Lacmoid）或1%地衣红（Orcein）的40%醋醋酸溶液染色酸溶液染色 受精和胚胎发育潜能的评定受精和胚胎发育潜能的评定 第十九页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟影响卵母细胞成熟的因素 卵母细胞的来源：不同种类的动物、不同生理阶段的动物(小牛低于成年牛)、卵母细胞的质量等；（1 1）动动物物种种类类与与年年龄龄：牛、羊效果较好，而马、猪较差。小牛卵母细胞的平均直径（118.041.15m）比成年母牛的（122.840.74m）小。体外成熟的小牛卵母细胞体外受精后发育潜力也低于成年卵母细胞第二十页

13、，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟（2）卵母细胞的形态 A、76.2%；B、67%；C、22%；D、11.4%（3）卵巢贮存时间与温度 30C 对成熟和胚胎发育不利(First&Parrish）绵羊的卵巢贮存在22C数小时对成熟无明显影响，但体温条件下则会使卵母细胞的质量下降(Moodie&Graham)第二十一页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟2.2.激素激素 目前大多数都离不开FSH或LH或两者的混合物，但仍有争议 GH能显著提高精子的受精率，促进卵裂及胚泡的形成 甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）胰岛素

14、 激活素 第二十二页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟3.3.生长因子生长因子 目前已经证实与卵母细胞成熟有关的生长因子有：上皮细胞生长因子（EGF）、转化生长因子和（TGF-，）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素类生长因子和（IGF-，）4.4.血清血清 胎牛血清（FBS）、发情牛血清（OCS）、发情前期母牛血清（POS）、超排母牛血清（SCS）、公牛血清（SS）。第二十三页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外保存1.371.37保存保存 应考虑保存时间与卵老化 2.2.低温保存低温保存 0-10 兔:10，受

15、精能力显著降低。第二十四页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外保存 3.3.冷冻保存冷冻保存 借鉴胚胎冷冻方法，现已建立了几种卵母细胞冷冻程序：A 慢速冷冻、慢速解冻法 B 慢速冷冻、快速解冻法 C 快速冷冻、快速解冻法 D 一步冷冻法 E 玻璃化法 F 超快速冷冻法 第二十五页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点影响卵母细胞成熟的因素培养条件：温度：37C较好，但各种动物最适温度不同，如兔子低于体温3C较好，牛35-39C都可，但38-39C最合适；培养基：水、血清（无血清、有血清)、无血清时添加BSA等；有血清时如胎牛血清、发情牛血

16、清、公牛血清、超排牛血清等；第二十六页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点1.精子的分离与洗涤(1)洗涤的目的：去掉精浆中抑制精子获能的因子和死精子，或洗去防冻剂及卵黄等成分，以获得活力好的精子。(2)精子分离及洗涤方法(3)悬浮法(Swim-up)：利用精子上游的特性将高活力的精子与死精子及精浆成分分开。(4)将精液置于获能液或受精液中，培养箱中孵育龄10-30分钟，吸取上层液体，再离心洗涤1-2次即可。精子的分离、洗涤与体外获能第二十七页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能 离心洗涤法：对于活力好的精子直接将其放入获能液

17、或受精液中，离心洗涤若干次便可。BSA/Percoll密度梯度离心法：利用形态正常精子密度高于异常精子的原理。如将BSA制成不连续的密度梯度或将Percoll制成30-40%或45-90%梯度，经平衡离心从而得到高受精力的精子。玻璃棉过滤法：采作小玻璃珠过滤除去死精子。因其成本高，较少采用。第二十八页，本课件共有71页（二）精子获能处理方法（二）精子获能处理方法 1.1.血清白蛋白法血清白蛋白法 将精子与血清白蛋白溶液进行长时间孵育。该法由于需要的时间较长，且诱发精子获能的作用不强，故仅在IVF技术研究的初期进行过尝试，具有一定作用，目前仅作为精子获能的一种辅助手段。2.2.高渗盐法高渗盐法

18、精子表面含有许多被膜蛋白，即所谓的“去能因子”。当用高离子强度溶液处理精子时，这些被膜蛋白将从精子的表面脱落，从而导致精子获能。由于高离子强度溶液对精子具有渗透打击作用，会影响精子的活力，故目前已废除不用。第二十九页，本课件共有71页（二）精子获能处理方法（二）精子获能处理方法3.3.卵泡液孵育法卵泡液孵育法 卵泡液含有来自血清的大分子物质，并含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在精液中添加一定浓度的卵泡液可诱发精子获能。10%卵泡液，牛受精分裂率（40.3%Vs 87.5%）和囊胚发育率（8.3%Vs 40.4%）均显著下降，但加入50%的卵泡内膜细胞条件液则能 。卵泡液可以用于精子的获能处

19、理，但不能用于IVF系统。第三十页，本课件共有71页（二）精子获能处理方法（二）精子获能处理方法4.4.钙离子载体法钙离子载体法 钙离子载体A23187能直接诱发Ca2+进入精子细胞内，提高细胞内的Ca2+浓度，从而导致获能。0.5mol/L1.0mol/L A23187溶液处理精子5 min，然后加入等量含1%BSA的BO溶液终止A23187的作用，即可将获能精子加到含卵母细胞的受精滴中进行IVF。注意控制A23187的工作浓度和作用时间，否则会导致精子的活力下降和死亡。第三十一页，本课件共有71页（二）精子获能处理方法（二）精子获能处理方法 5.5.肝素法肝素法 肝素是一种高度硫酸化的氨基

20、多糖类化合物，与精子结合后，能引起Ca2+进入精子细胞内部而导致精子获能。最初，制备好的精子常用含有肝素（100mg/L）的获能液预处理15 min，然后加到受精滴中进行IVF。现直接将肝素（50mg/L）添加到受精液中进行受精。第三十二页，本课件共有71页（三）精子获能的检测（三）精子获能的检测 1.精子形态及运动方式的观察 头部膨大，活力增强，超活化 2.顶体反应的检测 （1）双重染色法 优点：无需昂贵设备，简单易行；缺点：易发生误判 （2）透射电镜观察 成本高，制片繁琐，可操作性不强。第三十三页，本课件共有71页三、IVF培养系统（一）微滴系统（一）微滴系统 20-40l微滴受精液，覆石

21、蜡油，每滴放入IVM的卵母细胞10-20枚及获能处理的精子（1.0-1.5）106个/ml，孵育6-24 h 优点：受精液及精液的用量均较少，IVF的效果亦较好；缺点：结果易受石蜡油质量影响，操作繁琐，成本较高。第三十四页，本课件共有71页 （二）四孔培养板系统（二）四孔培养板系统 每孔加入500ml受精液和100-150枚IVM的卵母细胞，然后加入获能处理的精子（1.0-1.5）106个/ml，孵育6h-24h。优点：操作相对比较简单，受精结果不受石蜡油质量的影响；缺点：精子的利用率相对较低，IVF效果不如微滴法稳定。三、IVF培养系统 第三十五页，本课件共有71页 通常以精子穿透率、原核形

22、成率、受精分裂率和囊胚发育率来衡量。其中，囊胚发育率最为可靠。（一）固定染色法（一）固定染色法 受精810h 精子穿透率和多精子受精率；受精1820h 双原核形成率（二）体外培养（二）体外培养 受精48h 2-8细胞比例，7d 囊胚发育率，9d 囊胚的孵化率 三、IVF质量评定第三十六页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能 SpermSwim-upItisslowerthanthePercollprocedure,sometimesitdoesnotgivebetterresults.1.Thaw6to8strawsoffrozensemenin

23、thecyto-thawfor60seconds.Ifpossible,usesemenfromdifferentbulls.2.Combinecontentsofstrawsin5mlSp-TALP.Placesampleintotheincubator(38.5C)for5minutes.3.Centrifugesemen(200 xg;5min)anddiscardallbutthebottom1mlofsupernatant.4.Prepare4to5testtubescontaining1mlSp-TALP.Addapproximately250lofspermsuspensionv

24、eryslowlytothebottomofeachtubeusinga20gaugeneedleand1mlsyringe.Placetubesinincubator(38.5C)for1h.5Attheendofspermswim-up,aspiratethetop800lfromeachtubeandcombinesamples.Centrifuge(1000rpm)thecombinedsamplefor5minutes.Discardallbutthebottom500lofsupernate.第三十七页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外

25、获能Glass-woolFiltrationThis filtration procedure usually requires 10-15 minutes andgenerallyyieldsnearly100%viablesperm.1.Prepareinadvance0.2mlglasswoolcolumnsin1mlsyringesthatarerinsed10XwithMilli-Qwaterandautoclaved.2.Immediatelybeforestartingpurification,rinsecolumnseveraltimeswithHepes-TALPandfin

26、allywithSperm-TALPtoequilibratecolumn.3.Frozen-thawedsemen(3-5straws)iswashedtwicewith10-15mlSperm-TALPbycentrifugationat200 xg(10min)andthenresuspendedin0.6-0.8mlIVF-TALP.4.Spermsuspensionisthenlayeredoverthewetcolumnandallowedtofilterbygravity.5.Thenumberandviabilityoffilteredspermisdetermined.第三十

27、八页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能第三十九页，本课件共有71页 ThawstrawLayeringofspermontoPercoll.Aftercuttingthetipofthestraw(Leftpanel),thecontentsofthestrawareexpelledontothetopofthePercollgradient(rightpanel).Here,removalofthesemenisfacilitatedbyusingahomemadeplunger.Percollgradient:uptobottom45-90

28、%第四十页，本课件共有71页RemovalofspermfromthebottomofthePercollgradient.WashingsperminSp-TALP.Theleftpanelshowsthewashedandcentrifugedsperm.Therightpanelshowsthepelletofspermremaininginthetubeafteraspirationofthesupernatant.Percollmethod第四十一页，本课件共有71页Hemacytometerusedforcountingsperm.第四十二页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产

29、产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能2.精子的体外获能(1)卵泡液孵育法：卵泡液含有来自血清的大分子物质，并含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在精液中添加一定浓度的卵泡液可使精子获能。但不能用于体外受精(卵裂率和囊胚率下降)。(2)钙离子载体法：钙离子载体A23187能诱发Ca进入精子细胞内，诱发精子的超活化和顶体反应，从而导致获能。但其作用时间和浓度对于获能非常关键。第四十三页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能(3)肝素法：它与精子孵育后，能引起Ca进入精子内，导致获能。这是被广泛采用的获能法。原来将肝素(100mg/ml)获能液预

30、处理精液，再受精，现在直接将肝素(50mg/ml)添加到受精液中受精。实际操作时，常将多种因素共同使用，如咖啡因-肝素-BSA系统。第四十四页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能3.精子获能的检测(1)精子形态及运动方式改变(常用)：获能后的精子头部膨大，运动增强。(2)顶体反应的检测：双重染色法：取样固定染色(快绿FCF和曙红)涂片干燥观察若头部有厚的蓝绿区为无获能，若出现粉经为获能。电镜法：第四十五页，本课件共有71页2.体外授精 授精通常在覆盖下的微滴中进行，微滴以50-100ul，一般每滴中加5-10个卵母细胞，精子最终浓度为1X106个

31、/ML。培养条件：5%CO2、39C培养，BO液中6-8h，TALP液中18-24h。体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的体外获能与体外受精(牛)第四十六页，本课件共有71页1.Removeplatescontainingmaturedoocytesfromtheincubatorandplaceontheslidewarmer.2.Add25mlspermpreparationand25mlPHEmixintoeachwell.Whenpipettingthesperm,placethepipetteinthemiddleofthespermsuspensionratherthan

32、onthebottomtoavoidgrabbingdebristhatcansettletothebottomofthetube.3.Return4-wellplatetoincubatorfor8-10h.Manypeopledofertilizationfor18-20h.WhenwewereestablishingIVFinourlab,8-10hgavebetterresultsthanlongerincubationtimes.Recently,however,wehavegottengoodresultswith18-20hfertilizationtimes.Inadditio

33、n,longerfertilizationtimesmakeiteasiertoremovecumuluscellsafterfertilization.Todeterminetheincidenceofparthenogenesis,onewellshouldbepreparedwithoutsperm,butwithPHE.After810h,placetheseoocytesintoaseparateculturemediumdropandculturefor2daysbeforelookingatrateofparthenogenesis.体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点体外受

34、精第四十七页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点早期胚胎的体外发育阻滞期：各种动物的早期胚胎体外发育时都存在阻断期，因此可通过改善培养条件和在培养液中添加生长因子(TGF-或bFGF等)或细胞外基质因子克服阻断。但目前的发育率仍然比较低，约为40%，是限制体外受精应用的一个突出问题。各种动物阻断期：牛：猪：羊：第四十八页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点早期胚胎的体外发育 1.培养液2.添加的成分：3.(1)丙酮酸钠和乳酸钠：作为能量底物。4.(2)生物体液和蛋白质：FCS、NCS、发情母畜血清、BSA等。5.(3)激素：PMSG、FSH、胰岛素、

35、雌激素等，提高囊胚率。6.(4)生长因子及多肽：IGF，促进卵母细胞的成熟、受精和早期胚胎发育；EGF促进胚胎的分化和囊胚的形成；TGF促使牛的胚胎通过早期阻断；LIF(白血病抑制因子)提高孵化囊胚发育率，并抑制胚胎干细胞的体外分化。第四十九页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点早期胚胎的体外发育 2.胚胎的体外培养系统(1)常规培养系统：微滴法和培养板法。(2)输卵管离体培养法：克服阻断，但因繁琐不常用。(3)与体细胞共培养：如输卵管上皮细胞、滋养层细胞、颗粒细胞、子宫内膜细胞等。第五十页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点胚胎的冷冻保存1.1.常

36、规的慢速冷冻法常规的慢速冷冻法冷冻液:1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP 1.5M乙二醇+0.25蔗糖+P BSS液+0.1mg/mlPVP冷冻方法：在室温下，先将牛胚胎放入防冻液中平衡一段时间；装管；以每分钟1的速度降温至7；植冰；以每分钟0.5的速度降温至35；平衡10分钟后，投入液氮中保存。第五十一页，本课件共有71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点胚胎冷冻保存2.2.玻璃化冷冻玻璃化冷冻冷冻液：EFS40：40%乙二醇+0.3M蔗糖+18%聚蔗糖+PBSS冷冻步骤：首先将胚胎放入20%乙二醇溶液（EFS20）中平衡5min；用移卵管移入玻璃化溶液中

37、平衡10min；装管，封口；将细管投入液氮冷冻保存。第五十二页，本课件共有71页影影响响体体外外受受精精的的因因素素卵母细胞的成熟精子的体外获能第五十三页，本课件共有71页（一）卵母细胞的成熟度（一）卵母细胞的成熟度第五十四页，本课件共有71页（二）精子体外获能（二）精子体外获能第五十五页，本课件共有71页（三）公畜的影响（三）公畜的影响第五十六页，本课件共有71页Someinstrumentsusedtopickupembryosandoocytes.Fromlefttorightare1)a1ccsyringewithanextensionofrubbertubingconnectedto

38、aUnopette,2)awiretrol(fromDrummondScientific),3)thesamedeviceas#1withouttherubbertubingextensionand4)a5mlDrummondMicrodispenser.第五十七页，本课件共有71页Useofthewiretrolusingtwohands(leftpanel)oronehand(rightpanel).第五十八页，本课件共有71页TwomethodsforusingtheUnopettetip.Thedeviceontheleftpanelhasbeenmodifiedtoincludeap

39、ieceofrubbertubingbetweentheUnopetteandsyringetogivethetechniciangreatercontroloverthevolumeaspirated.第五十九页，本课件共有71页(A)OnaPetri-dish(i.e.Intergridplate)place3microdropsof70lholdingmediumsidebyside.(B)Placeoneblastocystintothemiddledrop(C(C-D)Insertthecottonplugsideofa0.25mlFrenchstrawintothewideendo

40、fthepipettip.D(E)Aspirateoneemptydrop.A(E)Aspirateairtocreatea0.5cmcolumnA(F)Aspiratethemicrodropcontainingembryo(makesurethattheembryoisaspiratedbyobservingunderthemicroscope;A(F)Aspirateairtocreatea0.5cmcolumnh(G)Aspiratetheremainingemptydropuntilthecottonplugiswet.R(H)Removetransferstrawfromsyrin

41、geandplaceonslidewarmeruntiluse.第六十页，本课件共有71页Whoshouldbetreatedwithinvitrofertilization?Invitrofertilizationcanbeusedasaneffectivetreatmentforinfertilityofallcausesexceptforwomenwithinfertilitycausedbyananatomicproblemwiththeuterus,suchassevereintrauterineadhesions.Itisgenerallyusedincoupleswhohavef

42、ailedtoconceiveafteratleastoneyearoftryingwhoalsohaveoneormoreofthefollowing:1.Blockedfallopiantubesorpelvicadhesionswithdistortedpelvicanatomy.WomenthathavehadtuballigationandareconsideringtubalreversalsurgeryaswellasmenthatareconsideringvasectomyreversalsurgerymightalsoconsiderIVF.2.Severemalefact

43、orinfertility(lowspermcountorlowmotility)3.Failed2-6cyclesofovarianstimulationwithintrauterineinsemination第六十一页，本课件共有71页Whoshouldbetreatedwithinvitrofertilization?4.Advancedfemaleage-over385.Reducedovarianreserve,whichmeanslowerquantity(andsometimesquantity)ofeggs.Aday3FSHandestradioltestandantralfo

44、lliclecountsareoftendoneasscreeningtestsforeggquantity(andquality).ReducedeggquantityandqualityisusuallytreatedwitheitherIVF,orwithIVFusingeggdonationfromanotherwoman.6.Severeendometriosis第六十二页，本课件共有71页Thegraphshowslivebirthratesforall23reportingIllinoisIVFcentersfor2002Theseclinicsreportedlivebirth

45、ratesrangingfrom13.5%to47.4%pereggretrievalforwomenunder35FiveIllinoisIVFprogramsfailedtoreporttheiroutcomedatatothegovernment(USlawrequiresreportingannually)第六十三页，本课件共有71页Howisinvitrofertilizationperformed?1.BasicscreeningtestsareperformedonbothpartnersatallIVFclinics.Ingeneral,sometestingofovarian

46、reserveshouldbedoneonthefemalepriortostartingtheinjections.Weuseday3FSHtestingaswellasantralfolliclecountsforthispurpose.Theresultsofthesetestsgiveussome abilitytopredictwhetherherovarieswillrespondwelltothedrugs(makesufficientfolliclesandeggs).ThenumberofeggsretrievedcorrelatesstronglywithIVFsucces

47、srates.2.Consentsaresignedbyallparties.3.Thewomanisstimulatedwithinjectedmedicationstodevelopmultipleeggdevelopment.Theseinjectionscontinueforabout8-10days.第六十四页，本课件共有71页Howisinvitrofertilizationperformed?4.Bloodandultrasoundtestingisdoneevery1-3daystomonitorthedevelopmentofthefollicles(egg-containi

48、ngstructures)intheovaries.Weneedtogetaminimumnumberof3folliclestodeveloptomaturityinordertobeabletoproceedwiththeeggretrieval.About90%ofwomenunder40withanormalFSHandnormalantralfolliclecountswilldevelopatleastthisminimumnumberoffollicles.Ifthismanymaturefolliclescannotbeobtainedfromthestimulationpro

49、cess-wewillcancelthecycle(notproceedtoeggretrieval).第六十五页，本课件共有71页Howisinvitrofertilizationperformed?5.Whenthewomansfolliclesaremature,atransvaginalultrasound-guidedeggretrieval(eggaspiration)procedureisperformedtoremovetheeggsfromthefollicles.Theaveragedurationofthisprocedureis5-6minutes(atourfacil

50、ity).6.Theembryosareculturedinthelaboratoryfor2-6days.7.Theembryotransferprocedureisdonewhichplacestheembryosinthewomansuteruswheretheywillhopefullyimplantanddeveloptoresultinalivebirth.ThisislikeaPapsmearforthewoman.Thereshouldbenodiscomfort.8.Ifthereareleftoverembryos(ofsufficientquality)beyondthe