重组与鉴定精选课件.ppt

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1、关于重组与鉴定关于重组与鉴定第一页，本课件共有85页第七章第七章 基因的重组与转移过程基因的重组与转移过程第二页，本课件共有85页切切接接转转增检检第三页，本课件共有85页一、DNA的体外重组（切与接）n n同种内切酶产生的粘性末端的连接同种内切酶产生的粘性末端的连接n n同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接n n不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接n n人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接n n粘性末端的更换粘性末端的更换n n重组率重组率第四页，本课件共有85页(1)同种内切酶生产的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoREcoREcoR

2、I II5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火退火退火退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG第五页，本课件共有85页(2)同尾酶生产的粘性末端的连接BamHIBamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGTACTAG 55 GATCAT5 5 TGATCAACTAGT5 BclIBclIBclIGCCTAGGATCC5 TACTAG GATCA退

3、火退火退火退火退火退火T4-DNA ligaseT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT第六页，本课件共有85页(3)不同种酶产生的粘性末端的连接不同种酶产生的粘性末端的连接n n用两种限制性内切酶分别消化载体和外源DNA片段,使载体和外源目的基因的两端分别形成不同的粘性末端.将它们混合,在连接酶的作用下相同的粘性末端可退火形成重组DNA分子,实现DNA定向连接.第七页，本课件共有85页(4)不同粘性末端的连接BamHIBamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG5 5 CT

4、GCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstIPstIPstI3 T4-DNA polT4-DNA polT4-DNA pol切平切平切平切平切平切平5 CG5 GCKlenowKlenowKlenow补平补平补平补平补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG55第八页，本课件共有85页(5)人工粘性末端的连接 5突出末端5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCG5 5KlenowKlenowKlenow补

5、平补平补平补平补平补平KlenowKlenowKlenow补平补平补平补平补平补平GGATCCCTAGGATCCCTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTTdTTdTTdTTdTdGTPdGTPdGTPdCTPdCTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火退火退火退火退火退火BamH IBamH IBamH IBamH IBamH

6、IBamH IEcoR IEcoR IEcoR IBamH IBamH IBamH I第九页，本课件共有85页(6)人工粘性末端的连接 3突出末端CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdCTPdGTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火退火退火退火退火Pst IPst IPst IPst IPst IPst IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCC

7、CCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenowKlenowPst IPst IPst ISph ISph ISph I第十页，本课件共有85页平末端DNA片段的连接n n同聚物加尾法同聚物加尾法n n衔接物加尾法衔接物加尾法n nDNADNA接头连接法接头连接法第十一页，本课件共有85页同聚物加尾法同聚物加尾法oo不需要模板不需要模板oo存在单一的脱氧核苷酸存在单一的脱氧核苷酸oo有带有带3-OH

8、3-OH的单链延伸末端的单链延伸末端ooTdTTdTa.a.用用55末端特异的核酸外切酶处末端特异的核酸外切酶处理片断理片断A A，BB。形成延伸的末端。形成延伸的末端b.b.分别加入分别加入d ATP,dTTPd ATP,dTTP及末端转及末端转移酶，各自形成多聚尾巴移酶，各自形成多聚尾巴c.c.退火；退火；d.d.转化大肠杆菌挑选重组子转化大肠杆菌挑选重组子第十二页，本课件共有85页衔接物加尾法衔接物加尾法衔接物衔接物(linker):(linker):用化学方法用化学方法合成的一段由合成的一段由10-1210-12个核苷个核苷酸组成酸组成,具有一个或数个限具有一个或数个限制酶识别位点的平

9、齐末端制酶识别位点的平齐末端的双链寡聚核苷酸片段的双链寡聚核苷酸片段.第十三页，本课件共有85页DNA接头连接法接头:人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段第十四页，本课件共有85页第十五页，本课件共有85页PCR 产物的连接产物的连接n n引入酶切位点 在引物两端引入限制性内切酶位点在引物两端引入限制性内切酶位点,同时要加同时要加3-43-4个保护碱基个保护碱基,或突变碱基创造酶切位点或突变碱基创造酶切位点n nT/A克隆 目前使用最广泛的目前使用最广泛的PCRPCR产物克隆方法产物克隆方法n n平末端克隆第十六页，本课件共有85页5.载体和外源载体和外

10、源DNA插入片段的连接结果插入片段的连接结果n n载体自身环化连接（能存活)n n载体之间互相连接（能存活)n n 插入片段互相连接（不能存活)n n一个载体与1个插入片段重组（能存活）n n几个载体与一个插入片段重组（能存活）第十七页，本课件共有85页重组率n n重重组组率率 =含含含含有有有有外外外外源源源源DNADNA的的的的重重重重组组组组分分分分子子子子数数数数 /载载体体分分子子总总数数n n 在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25-75%n n 重重组组率率是是衡衡量量连连接接反反应应效效率率的的重重要要指指标标，较较高高的的重重组率可以大大简化组率可以

11、大大简化DNA重组的后续操作重组的后续操作第十八页，本课件共有85页提高重组率的方法n n提高外源提高外源DNA片段与载体的分子比片段与载体的分子比：3 3:1-1-10:1n n载体载体DNADNA分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团：5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRIEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 pGCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火退火退火退火退火退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOH

12、HOOHHO碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶第十九页，本课件共有85页二、重组DNA分子的转化和扩增（转与增）n n转化n n转染n n感染第二十页，本课件共有85页n n转化：指 感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。n n转染：专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。第二十一页，本课件共有85页(一一)转化转化1 细菌常用的转化方法细菌常用的转化方法a.a.热激法转化感受态细胞热激法转化感受态细胞 b.b.PEG介导的原生质体转化介导的原生质体转化 c.c.高

13、压电穿孔法转化高压电穿孔法转化 d.d.显微注射法转化显微注射法转化e.e.接合转化接合转化f.f.噬菌体转染噬菌体转染第二十二页，本课件共有85页转转 化化 方方 法法转转 化化 效效 率率Ca Ca 诱诱 导导10107-87-8原生质体转化原生质体转化10105-65-6噬菌体转化噬菌体转化10107-87-8电电 穿穿 孔孔 法法10106-96-9（100Kb100Kb）结结 合合 转转 化化10104-54-5第二十三页，本课件共有85页1 1、CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化CaCa2+2+诱导的完整

14、细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），菌等），菌等），菌等），19701970年建立此技术，其原理是年建立此技术，其原理是年建立此技术，其原理是年建立此技术，其原理是CaCa2+2+与细菌外膜磷脂与细菌外膜磷脂与细菌外膜磷脂与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细

15、胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态 n n感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞(Competent cells):(Competent cells):就是处于能吸收外源就是处于能吸收外源就是处于能吸收外源就是处于能吸收外源DNA的生理状态的细胞的生理状态的细胞.第二十四页，本课件共有85页The binding and uptake of DNA by a competent bacterial cell第二十五页，本课件共有85页第二十六页，本课件共

16、有85页2、聚乙二醇聚乙二醇(PEG)介导的细菌原生质体的转化n n革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用用原生质体原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组质粒或重组DNADNA分子分子n n酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转原生质体法进行转化化第二十七页，本课件共有85页细菌原生质体

17、细菌原生质体的制备的制备的制备的制备不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如细菌需生长在高渗培养基中（如细菌需生长在高渗培养基中（如细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%10.3%的蔗糖等渗的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器

18、皿应保持无水无去溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂污剂 第二十八页，本课件共有85页细菌原生质体细菌原生质体的转化的转化n n取取0.2-1ml的原生质体悬浮液（的原生质体悬浮液（10108-10-10-10-109 9个原生质体），个原生质体），加入加入10-20 m m m ml DNA重组连接液，同时加入含有重组连接液，同时加入含有PEG1000和和CaCa2+的等渗溶液，混匀的等渗溶液，混匀 细菌原生质体细菌原生质体的再生的再生n n原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨壁。再生在特

19、殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素酸和微量元素第二十九页，本课件共有85页3 3、电穿孔转化电穿孔转化 将将将将待待待待转转转转化化化化的的的的质质质质粒粒粒粒或或或或DNADNA重重重重组组组组连连连连接接接接液液液液加加加加在在在在电电电电穿穿穿穿孔孔孔孔转转转转化化化化仪仪仪仪的的的的样样样样品品品品池池池池中中中中，两两两两极极极极施施施施加加加加高高高高压压压压电电电电场场场场。在在在在强强强强大大大大电电电电场场场场的的的的作作作作用用用用下下下下，细细细细菌菌菌菌细细细细胞胞胞胞壁壁壁壁和和和和细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜产产产产生生生生缝缝缝缝隙隙隙隙，质质质质粒粒粒粒或或

20、或或DNADNA重重重重组组组组分分分分子子子子便便便便可可可可进进进进入入入入细细细细胞内胞内胞内胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大体细胞均有效，但转化效率差别很大体细胞均有效，但转化效率差别很大体细胞均有效，但转化效率差别很大第三十页，本课件共有85页4 4、结合转化法结合转化法n n通过细菌供体细胞同受体细胞间的直接接触而传递外源DNA的方法。尤其适用于那些难以采用前面一些方法进

21、行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌。转化过程是由接合型质粒完成。第三十一页，本课件共有85页（二）感染（二）感染n n将以l l噬菌体为载体的噬菌体为载体的DNA分子包装成病分子包装成病毒颗粒，使其感染受体菌的过程称为感毒颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染。染。第三十二页，本课件共有85页（三）三）转染转染 以以以以噬菌体为载体，但不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用噬菌体为载体，但不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用噬菌体为载体，但不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用噬菌体为载体，但不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用DNADNA连接酶使连接酶使连接酶使连接酶使噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA环化，再

22、通过质粒转化方式导入受体菌的过程环化，再通过质粒转化方式导入受体菌的过程环化，再通过质粒转化方式导入受体菌的过程环化，再通过质粒转化方式导入受体菌的过程。感受态细胞的培养：感受态细胞的培养：感受态细胞的培养：感受态细胞的培养：将将将将大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌在在在在含含含含有有有有麦麦麦麦芽芽芽芽糖糖糖糖（不不不不含含含含葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖）和和和和MgClMgCl2 2的的的的培培培培养养养养基基基基中中中中培培培培养养养养至至至至ODOD600 600=0.5=0.5吸附吸附吸附吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，加入经体外包装好的重

23、组噬菌体悬浮液，加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30303030保温保温保温保温10101010分钟分钟分钟分钟转转转转染染染染裂裂裂裂解解解解:加加加加入入入入20202020倍倍倍倍体体体体积积积积的的的的新新新新鲜鲜鲜鲜培培培培养养养养基基基基，30303030培培培培养养养养2 2 2 2小小小小时时时时，直直直直至至至至培培培培养养养养液液液液中中中中菌菌菌菌体体体体裂裂裂裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选第三十三页，本课件共有85页(四四)、重组、重组DNA导入真核细胞的方法

24、导入真核细胞的方法1、重组DNA导入酵母菌细胞n n原生质体转化法n n碱金属离子介导的酵母菌完整细胞转化n nPEG转化法n n电击法第三十四页，本课件共有85页(1)酵母菌原生质体转化法酵母菌原生质体转化法酵母菌原生质体转化法酵母菌原生质体转化法n n早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在化法，在化法，在化法，在CaCa2+2+和和和和PEGPEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的的存在下，转化细胞可达原生质体总

25、数的的存在下，转化细胞可达原生质体总数的的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-1-2%2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约重制约重制约重制约n n原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数纳

26、多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的的的的25-33%25-33%第三十五页，本课件共有85页(2)碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒、热休克处理后，也可高效吸收质粒、热休克处理后，也可高效吸收质粒、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且：，而且：n n吸收线型吸收线型DNA的能力明显大于环状的能力明显大于环状DNA，两者相差，两者相差，两者相差，

27、两者相差80倍倍第三十六页，本课件共有85页(3)酵母菌电击转化法n n酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒收质粒DNA,但在此过程中应避免使用但在此过程中应避免使用PEG，它对，它对受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范适用范围广围广，而且转化率可高达，而且转化率可高达105/m mg DNA。第三十七页，本课件共有85页转化质粒在酵母细胞中的命运n n单双链单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双

28、均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的链的10-3010-30倍倍n n含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制双链并复制n n不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体合入染色体n n克隆在克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体体细胞的染色体DNA的同源序列，会发生高频同源整的同源序列，会发生高频同源整的同源序列，会发生高频同源整的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的合，整合子占转化子总数的合，整合子占

29、转化子总数的合，整合子占转化子总数的50-80%50-80%第三十八页，本课件共有85页2、重组、重组DNA导入植物细胞导入植物细胞n n农杆菌介导的Ti质粒遗传转化法 双子叶植物的转化效率可高达双子叶植物的转化效率可高达80%-90%80%-90%n n植物病毒介导的感染 用病毒作为载体将外源基因导入植物组织和细胞，不受单子叶和双子叶限制。用病毒作为载体将外源基因导入植物组织和细胞，不受单子叶和双子叶限制。n n基因枪法n n电击法n n原生质体融合n n花粉管通道法第三十九页，本课件共有85页1、植物病毒介导的转染程序 在在大大约约300300种种特特征征清清楚楚的的植植物物病病毒毒中中，

30、单单链链RNARNA病病毒毒约约占占91%91%，双双链链RNARNA病病毒毒、双双链链DNADNA病病毒毒、单单链链DNADNA病病毒毒各各占占3%3%。利利用用植植物物病病毒毒载载体体转化植物细胞大致有以下两种战略：转化植物细胞大致有以下两种战略：第四十页，本课件共有85页转染植物细胞原生质体n n以双链以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，基因组作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生

31、成整株植物。成整株植物。第四十一页，本课件共有85页转染植物组织n n植植植植物物物物双双双双生生生生病病病病毒毒毒毒（GeminivirusesGeminivirusesGeminivirusesGeminiviruses）为为为为一一一一单单单单链链链链DNADNADNADNA病病病病毒毒毒毒，成成成成熟熟熟熟的的的的双双双双生生生生病病病病毒毒毒毒呈呈呈呈双双双双颗颗颗颗粒粒粒粒状状状状，每每每每一一一一个个个个颗颗颗颗粒粒粒粒中中中中含含含含有有有有一一一一条条条条不不不不同同同同的的的的DNADNADNADNA单单单单链链链链。其其其其中中中中A A A A链链链链能能能能单单单单独

32、独独独在在在在植植植植物物物物细细细细胞胞胞胞中中中中复复复复制制制制，并并并并含含含含有有有有一一一一部部部部分分分分病病病病毒毒毒毒包包包包衣衣衣衣蛋蛋蛋蛋白白白白基基基基因因因因；B B B B链链链链编编编编码码码码另另另另一一一一部部部部分分分分包包包包衣衣衣衣蛋蛋蛋蛋白白白白基基基基因因因因及及及及感感感感染染染染性性性性基基基基因因因因。A A A A、B B B B两两两两条条条条链链链链必必必必须须须须同同同同处处处处于于于于一一一一个个个个植植植植物物物物细细细细胞胞胞胞中中中中，方方方方能能能能形形形形成成成成有有有有感感感感染染染染力力力力的的的的病病病病毒毒毒毒。双双

33、双双生生生生病病病病毒毒毒毒具具具具有有有有广广广广泛泛泛泛的的的的宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞范范范范围围围围，因因因因此此此此是是是是一一一一种种种种很很很很有有有有潜潜潜潜力力力力的的的的植植植植物物物物病毒载体。病毒载体。病毒载体。病毒载体。第四十二页，本课件共有85页2、植物细胞的直接转化程序枪击法枪击法枪击法枪击法 将将将将待待待待转转转转化化化化的的的的DNADNA沉沉沉沉淀淀淀淀在在在在细细细细小小小小金金金金属属属属珠珠珠珠的的的的表表表表面面面面，用用用用特特特特制制制制枪枪枪枪将将将将金金金金属属属属珠珠珠珠直直直直接接接接打打打打入入入入植植植植物物物物细细细细胞胞

34、胞胞，枪枪枪枪的的的的威威威威力力力力为为为为430 430 m m/s s，植植植植物物物物细细细细胞胞胞胞通通通通常常常常是是是是胚胚胚胚胎胎胎胎细细细细胞胞胞胞、玉玉玉玉米米米米籽籽籽籽、叶叶叶叶子子子子等等等等，但但但但进进进进去去去去的的的的DNADNA片片片片段段段段整合效率极低整合效率极低整合效率极低整合效率极低第四十三页，本课件共有85页3、电击法n n将高浓度的质粒将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在质体悬浮液中，混合物在 200-600 V/cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培

35、养基中生长组织培养基中生长 1-2 周，再生出整株植周，再生出整株植物物第四十四页，本课件共有85页4、融合法n n将外源将外源DNADNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁物细胞壁n n所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物难题，即：原生质体很难再生出整株植物第四十五页，本课件共有85页5

36、、花粉管导入法n n将外源将外源DNADNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。是我国科学家周光宇首先提出设计的因的转移。是我国科学家周光宇首先提出设计的n n特点：直接、简便。特点：直接、简便。受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有代过程，排除了植株再生的障碍，特

37、别适合于难以建立有代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的精卵或早期胚胎细胞，导入的精卵或早期胚胎细胞，导入的精卵或早期胚胎细胞，导入的DNADNA分子整合效率较高分子整合效率较高分子整合效率较高分子整合效率较高第四十六页，本课件共有85页3、重组、重组DNA导入动物细胞导入动物细胞n n磷酸钙沉淀法n n脂质体

38、介导感染法n n显微注射法 转基因动物的有效途径；包括外源基因的制备、收集受精卵、显微注射、受精卵转基因动物的有效途径；包括外源基因的制备、收集受精卵、显微注射、受精卵移植移植n n病毒感染法n nDEAE葡聚糖转然技术n n电击法第四十七页，本课件共有85页(1)磷酸钙沉淀法：经典而简单的方法 先将先将DNA溶解在钙盐溶液中，不停搅拌溶解在钙盐溶液中，不停搅拌逐滴加到磷酸盐溶液中，形成磷酸钙微结晶逐滴加到磷酸盐溶液中，形成磷酸钙微结晶与与DNA的共沉淀物，再与受体细胞混合、的共沉淀物，再与受体细胞混合、保温，保温，DNA可进入细胞核内，并整合到寄主可进入细胞核内，并整合到寄主染色体上，多用于

39、单层培养的细胞，也可用于染色体上，多用于单层培养的细胞，也可用于悬浮培养的细胞。悬浮培养的细胞。第四十八页，本课件共有85页(2)脂质体载体法：脂质体载体法：用脂质体包埋核酸分子，然后导入细胞用脂质体包埋核酸分子，然后导入细胞(3)显微注射法显微注射法n n理想外源基因的制备理想外源基因的制备n n收集受精卵：从供体动物中取出单细胞的受精卵n n显微注射显微注射n n将带有目的基因的受精卵移入代理母体内，收受精卵得到将带有目的基因的受精卵移入代理母体内，收受精卵得到孕育，转化率，孕育，转化率，50-100%50-100%(4)DAGE葡聚糖转染技术葡聚糖转染技术n n一般用于基因的瞬时表达，对

40、细胞有毒性一般用于基因的瞬时表达，对细胞有毒性,有挑选性有挑选性n n用于转染少量用于转染少量DNADNA第四十九页，本课件共有85页n n转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNADNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受

41、一个载体分转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNADNA转转转转化后，受体细胞接纳化后，受体细胞接纳化后，受体细胞接纳化后，受体细胞接纳DNADNA的个数，即克隆数（在筛选时，的个数，即克隆数（在筛选时，的个数，即克隆数（在筛选时，的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）未接纳载体或重

42、组子的受体细胞不长）未接纳载体或重组子的受体细胞不长）未接纳载体或重组子的受体细胞不长）（五）转化率及其影响因素（五）转化率及其影响因素第五十页，本课件共有85页n npUC18pUC18对对对对大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌的的的的转转转转化化化化率率率率为为为为10108 8，即即即即每每每每微微微微克克克克pUC18pUC18中中中中只只只只有有有有10108 8个个个个分分分分子子子子能能能能进进进进入入入入受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞。一一一一微微微微克克克克pUC18pUC18共共共共有有有有3.4X103.4X101111个个个个分分分分子子子子（6.02X106.02X1

43、017 17/2686X6602686X660），也也也也就就就就是是是是说说说说，每每每每34003400个个个个pUC18pUC18分分分分子子子子才有才有才有才有一一一一个分子进入受体细胞个分子进入受体细胞个分子进入受体细胞个分子进入受体细胞n n 另另另另一一一一方方方方面面面面，在在在在实实实实际际际际操操操操作作作作过过过过程程程程中中中中，转转转转化化化化一一一一微微微微克克克克pUC18pUC18共共共共需需需需2ml2ml感感感感受受受受态态态态细细细细胞胞胞胞，大大大大约约约约含含含含有有有有2X102X101010个个个个大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌细细细细胞胞胞胞，

44、也也也也就就就就是是是是说说说说，每每每每200200个细胞只有一个细胞能接纳个细胞只有一个细胞能接纳个细胞只有一个细胞能接纳个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNApUC18 DNA 第五十一页，本课件共有85页普通转化实验中,n npBR322质粒:106转化子菌落/ugn n噬菌体噬菌体:10:104-10-106 噬菌斑噬菌斑/ug重组DNA分子转化频率一般下降102-10-104倍原因:n n 载体分子同插入DNADNA片段间的连接作用常是无效的,降低了有功能的质粒或噬菌体降低了有功能的质粒或噬菌体DNADNA的实际数量.n n 含有插入外源DNADNA片段的载体分子一般比较大,导

45、致转化频率再度明显下降.第五十二页，本课件共有85页转化率的影响因素载体本身的性质：载体本身的性质：载体本身的性质：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同 载体的空间构象载体的空间构象质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，

46、其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级 ,插入片段的大小插入片段的大小插入片段的大小插入片段的大小对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低第五十三页，本课件共有85页n n受体细胞方面受体细胞方面受体细胞方面受体细胞方面:受体细胞必须与载体相匹配，例如：受体细胞必须与载体相匹配，例如：受体细胞必须与载体相匹

47、配，例如：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322pBR322转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌JM83JM83株，转化率很株，转化率很株，转化率很株，转化率很低；但对大肠杆菌低；但对大肠杆菌低；但对大肠杆菌低；但对大肠杆菌ED8767ED8767株的转化率则较高株的转化率则较高株的转化率则较高株的转化率则较高 n n转化方法方面转化方法方面转化方法方面转化方法方面CaCa2+2+诱导转化诱导转化诱导转化诱导转化 10106 6-10-107 7/m m m mg DNAg DNA 原生质体转化原生质体转化原生质体转化原生质体转化 10105 5-10-106 6/m m m

48、 mg DNAg DNAl l l l-DNA-DNA转染转染转染转染 10107 7-10-108 8/m m m mg DNAg DNA电穿孔转化电穿孔转化电穿孔转化电穿孔转化 10106 6-10-109 9/m m m mg DNAg DNA供受体的比例供受体的比例供受体的比例供受体的比例:50-100ng DNA50-100ng DNA50-100ng DNA50-100ng DNA对应于对应于对应于对应于101010108 8 8 8 个受体细胞个受体细胞个受体细胞个受体细胞,加大加大加大加大DNADNADNADNA不能提高转化率不能提高转化率不能提高转化率不能提高转化率第五十四页

49、，本课件共有85页转化细胞的扩增n n转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：在一起，如：n n Ca2+诱导转化后的诱导转化后的诱导转化后的诱导转化后的37培养一个小时培养一个小时n n 原生质体转化后的再生过程原生质体转化后的再生过程n n l l噬菌体转染后的噬菌体转染后的噬菌体转染后的噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作培养等，均属扩增操作 第五十五页，本课件共有85页三、转化子的筛选和鉴定（检）由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此

50、由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子转化子与与非转化非转化子、子、重组子重组子与非重组子、与非重组子、目的重组子目的重组子与非目的重组与非目的重组子子第五十六页，本课件共有85页1、载体表型检测法载体表型检测法(1)根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法.质粒及柯斯质粒质粒及柯斯质粒:具有抗药性标记或营养标记噬菌体:形成噬菌斑.抗药性记号的插入失活抗药性记号的插入失活或-半乳糖苷酶基因一半乳糖苷酶基因一类的显色反应类的显色反应是两个典型的方法.第五十七页，本课件共有85页编码有四环素抗性基因编码有四环素抗性基因编码有四