离子交换柱层析法分离氨基酸精选课件.ppt
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1、关于离子交换柱层析法分离氨基酸第一页,本课件共有20页一、实验目的和要求1.学习采用离子交换柱层析法分离氨基酸的原理和方法。2.掌握离子交换柱层析法的基本操作技术,包括树脂的装柱加样、洗脱、检查等。第二页,本课件共有20页二、实验原理 离子交换树脂是具有酸性或碱性的合成聚苯乙烯-苯乙二烯不溶性高分子化合物。各种氨基酸分子的结构不同从而导致pI点不同。各种氨基酸在同一pH时带有不同的电荷,与离子交换树脂的亲和力有差异,因此可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来,达到分离的效果。第三页,本课件共有20页 树脂对离子的亲和力,与水合离子半径、电荷及离子的极化程度有关。水合离子半径愈小、电荷愈高、极
2、化程度愈大,则它的亲和力愈大。其中静电力起主要作用。在ph=5.8 的缓冲液中,在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性。本试验所用氨基酸中,Asp(天冬氨酸)是酸性氨基酸,pI=2.97;Lys(赖氨酸)是碱性氨基酸,pI=9.74。茚三酮跟蛋白质或者多肽在加热条件下发生紫色反应第四页,本课件共有20页三、实验试剂1、732阳离子交换树脂2、2 mol/L盐酸溶液。32 mol/L氢氧化钠溶液。4.标准氨基酸溶液:天冬氨酸2mg/mL、赖氨酸均配制成4mgmL的0.1mol/L盐酸溶液。5混合氨基酸溶液:将上述天冬氨酸、赖氨酸各溶液按1:3的比例混合。6.两种檬酸钠-氧氧化钠-盐酸
3、缓冲液(pH5.8,钠离子浓度0.45mol/L的缓冲液和钠离子浓度为0.90mol/L的缓冲液)取柠檬酸14.25g、氢氢化钠9.3g和浓盐酸5.25mL溶于少量蒸馏水后,定容至500Ml(另一种定容至250mL),冰箱保存。7显色剂:称取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中,加蒸馏水至100mL。850%乙醇水溶液。第五页,本课件共有20页离子交换树脂转型示意图第六页,本课件共有20页离子交换树脂分离氨基酸原理示意图第七页,本课件共有20页四、实验器材MC99-3自动液相色谱分离层析仪层析管(20cmX1cm)专用试管(50支)水浴锅铝制试管架X2分光光度计玻璃棒移液管洗瓶硅胶管第八页
4、,本课件共有20页五、实验步骤1、树脂的准备:将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成Na+型后洗至中性待用。方法如下:将干的强酸型离子交换树脂用蒸馏水浸过夜或搅拌2小时,使其充分溶胀,倾去细小颗粒,再用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡一小时(树脂换为氢型),倾去清液,洗至中性,再用2mol/L的氢氧化钠溶液做同样处理(树脂换为钠型),洗至中性待用。第九页,本课件共有20页2、连接装置梯度混合器恒流泵层析管部分收集器第十页,本课件共有20页3、装柱 干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度,一个同学一手手执烧杯,一手用玻璃棒快速在杯口搅动树脂,使
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