蛋白质工程重点精选课件.ppt

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1、关于蛋白质工程重点第一页，本课件共有154页基因工程和蛋白质工程基因工程和蛋白质工程第二页，本课件共有154页1、蛋白质工程的基本研究内容、蛋白质工程的基本研究内容蛋白质结构分析蛋白质结构分析 基础基础结构、功能的设计和预测结构、功能的设计和预测 基础的应用与验证基础的应用与验证创造和创造和/或改造蛋白质或改造蛋白质新蛋白质新蛋白质 终目标终目标第三页，本课件共有154页一、基本化学组件一、基本化学组件1.氨基酸氨基酸amino2.肽单位和多肽链肽单位和多肽链peptide unit,polypeptide chain 第四页，本课件共有154页氨基酸性质氨基酸性质极性氨基酸：Ser、Thr、

2、Cys、Asn、Gln、His、Tyr、Trp 二硫键疏水氨基酸：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Met疏水内核 荷电氨基酸：Arg、Lys（+）；Asp、Glu（-）PI，蛋白分离光谱特性、紫外线吸收特性检测第五页，本课件共有154页氨基酸的构型与构象氨基酸的构型与构象构型构型configuration：一个分子中原子的特定空间排布（：一个分子中原子的特定空间排布（L-型的单一手性分子）型的单一手性分子）构象构象conformation：组成分子的原子或基团绕单键旋转而：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布形成的不同空间排布旋转异构体旋转异构体rotamer：以

3、优势构象（交错构象：以优势构象（交错构象stagged conformation）出现的氨基酸残基）出现的氨基酸残基（用于模建）（用于模建）肽键肽键peptide bond:由一个氨基酸的由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。具有反式氨基脱水缩合而形成的化学键。具有反式(trans)和顺式和顺式(cis)两两种构型种构型第六页，本课件共有154页多肽链构象的表征参数多肽链构象的表征参数（1）扭角(torsion angle)或双面角(dihedral angle)系统（2）多肽链的构象角(,)（3）拉氏构象图（Ramachandra plot）及

4、多肽链构象的允许区第七页，本课件共有154页二、空间结构组件二、空间结构组件1.螺旋螺旋 helix2.层层 sheet3.环肽链环肽链 loop4.转角转角 turn第八页，本课件共有154页-螺旋螺旋 结构结构（-helix）多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为上升的距离即螺距为0.54nm,含含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为为0.15nm;肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺

5、基团的平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。基形成氢键。蛋白质分子为右手蛋白质分子为右手-螺旋。螺旋。第九页，本课件共有154页两亲性两亲性amphipathicity螺旋一侧主要分布亲水（荷电、极性）残基，另一侧主螺旋一侧主要分布亲水（荷电、极性）残基，另一侧主要集中疏水残基要集中疏水残基可用螺旋转轮可用螺旋转轮(helical wheel)的方式预测的方式预测对生物活性具有重要作用对生物活性具有重要作用疏水内核疏水内核solvent excluded core蛋白质结构具有的一个共同特征蛋白质结构具有的一个共同

6、特征 疏水内核是蛋白质折叠的主要驱动力疏水内核是蛋白质折叠的主要驱动力疏水内核是天然蛋白质稳定的基本结构因素疏水内核是天然蛋白质稳定的基本结构因素第十页，本课件共有154页-折叠折叠(-sheet)折叠的几种形式1.平行型平行型2.反平行型反平行型3.混合型混合型扭转的肽链扭转的肽链twistedstrand：链都是沿其前进方向不断扭转，从而使实际蛋白质结构中出现的链都是沿其前进方向不断扭转，从而使实际蛋白质结构中出现的 层层都不是平直的，而是一种扭转层。都不是平直的，而是一种扭转层。右手扭转右手扭转第十一页，本课件共有154页环肽链（环肽链（loop)1回折回折(reverse turn)（

7、1）转折（转角）转折（转角）(-turn)在在-转角部分，由四个氨基酸残基组成转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O 和第四个残基的和第四个残基的 N-H 之间形成氢之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中这类结构主要存在于球状蛋白分子中 （2）转折转折(-turn):由由3个氨基酸残基构成的转折个氨基酸残基构成的转折2发夹发夹 （1）发夹发夹(hairpin)通过一段短的环链将通过一段短的环链将2条相邻的条相邻的 链连接在一起链连接在一起环链可具有不同的长度（环链可具有不同

8、的长度（14，2）常具有重要的功能性意义常具有重要的功能性意义 （2）凸起凸起(bulge)第十二页，本课件共有154页环肽链的意义环肽链的意义连接二级结构元素的主要结构因素，在三级结构预测中，环链区构象的确定具有基本的重要性环链区常常出现在生物活性位置，三维结构构建具有功能意义环肽链结构库用于结构预测和模建第十三页，本课件共有154页三、蛋白质空间结构层次三、蛋白质空间结构层次一级结构（一级结构（primery structure）二级结构二级结构(secondary structure)结构模体结构模体(motif)结构域结构域(domain）三级结构（三级结构（tertiary stru

9、cture)/亚基（亚基（subunit）四级结构四级结构(quaternary structure)第十四页，本课件共有154页1.蛋白质的一级结蛋白质的一级结构构primery structure多肽链中氨基酸的排列序列多肽链中氨基酸的排列序列同源同源(homology)2.蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构secondary structure多肽链主链骨架中的若干肽段，各自沿着某个轴盘旋或折叠，并以多肽链主链骨架中的若干肽段，各自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键维系，从而形成有规则的构象，不涉及氨基酸残基的侧链构象。氢键维系，从而形成有规则的构象，不涉及氨基酸残基的侧链构象。-螺旋螺旋（-

10、helix）-折叠折叠 (-sheet)-转角转角 (-turn)-凸起（凸起（-burgle）无规则卷曲（无规则卷曲（random coil）第十五页，本课件共有154页3.结构模体结构模体（supersecondary structure，motif）介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有、和等。第十六页，本课件共有154页4.结构域结构域domain是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，一条多肽链在

11、这个域范围内来回折叠，但相邻的域常被一个或两个多肽片段连结。通常由50-300个氨基酸残基组成，其特点是在三维空间可以明显区分和相对独立，并且具有一定的生物功能如结合小分子。模体或基序（motif）是结构域的亚单位通常由23二级结构单位组成，一般为螺旋、折叠和环（loop）。第十七页，本课件共有154页5.三级结构三级结构tertiary structure 在二级结构的基础上再折叠在二级结构的基础上再折叠ABCA胰岛素的三级结构胰岛素的三级结构B溶菌酶分子的三级结构溶菌酶分子的三级结构C磷酸丙糖异构酶三级结构磷酸丙糖异构酶三级结构C丙酮酸激酶的三级结构丙酮酸激酶的三级结构D第十八页，本课件共

12、有154页6.四级结构四级结构quaternary structure亚基聚合而成的寡聚蛋白结构亚基聚合而成的寡聚蛋白结构侧重强调亚基之间的相互作用和空间排布情况侧重强调亚基之间的相互作用和空间排布情况均一、非均一；对称、不对称均一、非均一；对称、不对称亚基亚基(subunit)1)蛋白质分子的最小共价单位蛋白质分子的最小共价单位2)具有完整的三级结构具有完整的三级结构3)是四级结构的基本组件是四级结构的基本组件4)均一、非均一均一、非均一第十九页，本课件共有154页蛋白质结构类型型型 型型/型型 型型无规型富含二硫键和金属离子型无规型富含二硫键和金属离子型第二十页，本课件共有154页维持蛋白

13、质三维结构的作用力维持蛋白质三维结构的作用力盐键盐键又称盐桥或离子键（又称盐桥或离子键（ionic bond):正电荷与负电荷之间的一种静电正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。相互作用。氢键氢键(hydrogen bond):多肽主链上的羰基氧和酰胺氢之间、侧链与侧链、侧链多肽主链上的羰基氧和酰胺氢之间、侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。与介质水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。疏水作用疏水作用（hydrophobic interaction):介质中球状蛋白质的折叠总是倾介质中球状蛋白质的折叠总是倾向与把疏水残基埋藏在分子的内部，在稳定蛋白质的三维结构方

14、面占有向与把疏水残基埋藏在分子的内部，在稳定蛋白质的三维结构方面占有突出地位。突出地位。范德华力范德华力(van der waals force）：指分子间的作用力。广义上的范德：指分子间的作用力。广义上的范德华力包括华力包括3 3种较弱的作用力：定向效应，诱导效应，分散效应。种较弱的作用力：定向效应，诱导效应，分散效应。二硫键二硫键（disulfide bond）绝大多数情况下二硫键是在多肽链的绝大多数情况下二硫键是在多肽链的转角附转角附近形成的近形成的第二十一页，本课件共有154页二、蛋白质折叠的概念二、蛋白质折叠的概念蛋白质的折叠蛋白质的折叠protein folding 从体内新生的多

15、肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。折叠研究：研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定折叠研究：研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定性和与其生物活性的关系。性和与其生物活性的关系。蛋白质复性蛋白质复性：将蛋白质从结构不规则、无活性的状态，恢复到有唯：将蛋白质从结构不规则、无活性的状态，恢复到有唯一立体结构、有生物活性的一立体结构、有生物活性的 状态的过程。状态的过程。蛋白质变性：蛋白质变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间蛋白质在一定

16、的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性第二十二页，本课件共有154页1、“自组装学说”（self-assembly）20世纪60年代，Anfinsen基于还原变性的牛胰RNase在不需其他任何物质帮助下，仅通过去除变性剂和还原剂就使其恢复天然结构的实验结果，提出了“多肽链的氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必需的全部信息”的“自组装学说”。1965，中国，化学合成活性结晶牛胰岛素Anfinsen，1972，Nobel Price第二十三页，本课件共有154页2。“热力学假说”天然蛋白质多肽采取的构象是在一定环境条

17、件下热力学上最稳定的结果，采取天然构象的多肽链和它所处的一定环境条件（如溶液组分、pH、温度、离子强度等）整个系统的自由能最低，所以处于变性状态的多肽链在一定的环境条件下能够自发折叠成天然构象。第二十四页，本课件共有154页3、“辅助性组装学说”体内蛋白质的折叠往往需要有其他辅助因子的参与，并伴随有ATP的水解不仅仅受“热力学”控制，也受到“动力学”的控制二者是统一的二者所起作用大小在不同的蛋白质中可能不同1987年，Ellis第二十五页，本课件共有154页新支持新支持三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。（1988，邹承鲁）90年代辅助蛋白(Accessoryprotein)的发

18、现细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。第二十六页，本课件共有154页二、帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子分子伴侣（molecular chaperone）是一类相互之间有关系的蛋白，它们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非非共价共价的组装，并且不是组装完成的结构在发挥其正常的生物功能时的组成部分(1993,Ellis)折叠酶：催化与折叠直接有关的化学反应的酶。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl prolyl cis-trans isomerase,PPI)第二十

19、七页，本课件共有154页分子伴侣的定义完全是功能上的。分子伴侣与酶的异同点相同点参与促进一个反应而本身并不在最终产物中出现不同点分子伴侣对靶蛋白不具有高度专一性分子伴侣的催化效率很低分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进其正确折叠。第二十八页，本课件共有154页蛋白质折叠的特点不是一步形成的，而是通过一些中间折叠物而完成的。新生肽链的不完整性形成最终成熟蛋白分子中不存在也不应该有的瞬间结构。在大分子拥挤的环境下经常会产生错误折叠。折叠中间态的正确途径与错误途径竞争失败时。第二十九页，本课件共有154页分子伴侣在蛋白质分子折叠中的作用识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然结构。与这些中间物

20、结合，生成复合物，防止过早的或者错误的相互作用而阻止不正确的无效的折叠途径，抑制不可逆的聚合物的产生，促进折叠向正确的有效的途径进行。分子伴侣首先会识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然构象，而不会去理会天然构象。分子伴侣与早期形成的中间物相互作用而防止它们之间的聚合；一旦聚合形成，分子伴侣就无能为力了。可以说分子伴侣能“治病救人”，但并无“起死回生”的绝招。第三十页，本课件共有154页蛋白质二硫键异构酶(PDI)催化新生肽链的巯基氧化形成二硫键。催化新生肽链的巯基氧化形成二硫键。PDI 首先和含有巯基的肽链结合。首先和含有巯基的肽链结合。PDI 对含有二硫键蛋白折叠的底物特异性对含有二硫键蛋

21、白折叠的底物特异性不高。不高。通过二硫键的交换，通过二硫键的交换，PDI 可帮助蛋白快速找到可以达到的热力学上最稳定状可帮助蛋白快速找到可以达到的热力学上最稳定状态的二硫键对。态的二硫键对。PDI 含有两个含有两个 Cys-Gly-His-Cys 序列，并且序列，并且Cys上的巯基是非常活性的上的巯基是非常活性的.PDI 在动力学错配折叠中间体加速二硫键的交换中起到非常重要的作在动力学错配折叠中间体加速二硫键的交换中起到非常重要的作用。用。第三十一页，本课件共有154页肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)蛋白质的肽键几乎都是反式的（蛋白质的肽键几乎都是反式的（99.95%），但脯），但脯氨酰亚氨基的

22、肽键有氨酰亚氨基的肽键有6%是顺式的。是顺式的。脯氨酰亚氨基异构是很多蛋白体外折叠过程中的限脯氨酰亚氨基异构是很多蛋白体外折叠过程中的限速步骤。速步骤。PPI 可以提高脯氨酰亚氨基顺反异构可以提高脯氨酰亚氨基顺反异构300倍的效率。倍的效率。第三十二页，本课件共有154页第一遗传密码遗传信息的传递遗传信息的传递从核酸序列到功能蛋白质的从核酸序列到功能蛋白质的全过程。全过程。第一遗传密码第一遗传密码三联遗传密码三联遗传密码3个相连的核苷酸顺序决定蛋白质分子肽链中的一个相连的核苷酸顺序决定蛋白质分子肽链中的一个氨基酸。个氨基酸。第二遗传密码第二遗传密码现有的遗传密码仅有从核酸序列到无结构的多肽链的

23、现有的遗传密码仅有从核酸序列到无结构的多肽链的信息传递，因此是不完整的。信息传递，因此是不完整的。无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递部分无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递部分遗传密码的第二部分，即蛋白质中氨基酸序列与其遗传密码的第二部分，即蛋白质中氨基酸序列与其三维结构的对应关系，称之为第二遗传密码或折叠密三维结构的对应关系，称之为第二遗传密码或折叠密码码第三十三页，本课件共有154页第二遗传密码的特点简并性简并性氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结构。构。多意性多意性相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定

24、不同的三维相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的三维结构。结构。全局性全局性在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作用，并对分子总体结构产生重要影响；后形成的肽段可以用，并对分子总体结构产生重要影响；后形成的肽段可以影响已经形成的肽段个构象从而造成对分子整体的影响等。影响已经形成的肽段个构象从而造成对分子整体的影响等。第三十四页，本课件共有154页与蛋白错误折叠有关的疾病蛋白传染子导致的疾病（prion diseases）淀粉样蛋白病（amyloid diseases）癌症（cancer）第三十五页，本课件共有154页常见“折叠

25、病”老年性痴呆症(Alzheimer syndrome)病人脑中充满了由错误折叠蛋白形成的杂乱的蛋白质簇。主要分为两类：含有沉淀样蛋白（A ）的沉淀样斑，tau蛋白引起的神经细胞内自损伤。帕金森氏症（Parkinson disease）主要是由于蛋白质的错误折叠，病人随意运动的控制能力逐渐丧失，因为能产生多巴胺的神经细胞逐步被破坏，其原因和发生机制尚不清楚。某些肿瘤抑癌基因突变造成抑癌基因编码的蛋白质稳定性改变引起的一些癌症的发生。p53稳定性的降低导致癌症的发生。第三十六页，本课件共有154页三、折叠机制的理论模型三、折叠机制的理论模型 框架模型（框架模型（Framework Model）框

26、架模型假设蛋白质的局部构象依赖于局部的氨基酸序列。在多肽链折叠过程的起始阶段,先迅速形成不稳定的二级结构单元；称为“flickering cluster”,随后这些二级结构靠近接触,从而形成稳定的二级结构框架；最后，二级结构框架相互拼接，肽链逐渐紧缩，形成了蛋白质的三级结构。这个模型认为即使是一个小分子的蛋白也可以一部分一部分的进行折叠,其间形成的亚结构域是折叠中间体的重要结构。第三十七页，本课件共有154页疏水塌缩模型（Hydrophobic Collapse Model）在疏水塌缩模型中，疏水作用力被认为是在蛋白质折叠过程中起决定性作用的力的因素。在形成任何二级结构和三级结构之前首先发生很

27、快的非特异性的疏水塌缩。疏水内核包埋三、折叠机制的理论模型三、折叠机制的理论模型 第三十八页，本课件共有154页扩散扩散-碰撞碰撞-粘合机制粘合机制（Diffusion-Collision-Adhesion Model）该模型认为蛋白质的折叠起始于伸展肽链上的几个位点，在这些位点上生成不稳定的二级结构单元或者疏水簇，主要依靠局部序列的进程或中程（3-4个残基）相互作用来维系。它们以非特异性布朗运动的方式扩散、碰撞、相互黏附，导致大的结构生成并因此而增加了稳定性。进一步的碰撞形成具有疏水核心和二级结构的类熔球态中间体的球状结构。球形中间体调整为致密的、无活性的类似天然结构的高度有序熔球态结构。最

28、后无活性的高度有序熔球态转变为完整的有活力的天然态。三、折叠机制的理论模型三、折叠机制的理论模型 第三十九页，本课件共有154页成核成核-凝聚凝聚-生长模型（生长模型（Nuclear-Condensation-Growth Model）根据这种模型，肽链中的某一区域可以形成“折叠晶核”，以它们为核心，整个肽链继续折叠进而获得天然构象。所谓“晶核”实际上是由一些特殊的氨基酸残基形成的类似于天然态相互作用的网络结构，这些残基间不是以非特异的疏水作用维系的，而是由特异的相互作用使这些残基形成了紧密堆积。晶核的形成是折叠起始阶段限速步骤。三、折叠机制的理论模型三、折叠机制的理论模型 第四十页，本课件共

29、有154页拼版模型（拼版模型（Jig-Saw Puzzle Model）此模型的中心思想就是多肽链可以沿多条不同的途径进行折叠,在沿每条途径折叠的过程中都是天然结构越来越多,最终都能形成天然构象,而且沿每条途径的折叠速度都较快,与单一途径折叠方式相比,多肽链速度较快,另一方面,外界生理生化环境的微小变化或突变等因素可能会给单一折叠途径造成较大的影响，而对具有多条途径的折叠方式而言,这些变化可能给某条折叠途径带来影响,但不会影响另外的折叠途径,因而不会从总体上干扰多肽链的折叠,除非这些因素造成的变化太大以致于从根本上影响多肽链的折叠。三、折叠机制的理论模型三、折叠机制的理论模型 第四十一页，本课

30、件共有154页蛋白质设计的目的意义蛋白质设计的目的意义为蛋白质工程提供指导性信息探索蛋白质的折叠机制 蛋白质工程的核心内容之一蛋白质工程的核心内容之一第四十二页，本课件共有154页常见设计目标提高蛋白的热、酸稳定性增加活性降低副作用提高专一性进行结构-功能关系研究 第四十三页，本课件共有154页蛋白质设计的目标及解决办法蛋白质设计的目标及解决办法第四十四页，本课件共有154页蛋白质设计流程蛋白质设计流程1.根据结构或功能需求，从天然蛋白质的结构出发，确定突变位点及替换的氨基酸；2.预测修饰后的蛋白质结构；3.预测新蛋白质可能的性质；4.实验验证；5.循环至达到目标第四十五页，本课件共有154页

31、分子设计的步骤（1）建立所研究蛋白质的结构模型（2）找出对所要求的性质有重要影响的位置（3）选择一系列的在（2）中所选出位点上改变残基所得到的突变体（4）预测突变体的结构（5）定性或定量计算优化所得到的突变体结构是否具有所要求的性质 第四十六页，本课件共有154页设计应注意问题设计应注意问题应确定对蛋白质折叠敏感的区域：带有特殊扭角的氨基酸、盐桥、密堆积区应确定对功能非常重要的位置：结构结构功能关系功能关系应考虑剩余位置对所希望改变的影响当进行互换或插入/删除残基时应考虑它们对结构特征的影响第四十七页，本课件共有154页功能残基鉴定功能残基鉴定根据结构信息序列同源性分析实验技术手段随机突变删除

32、分析及连接段扫描突变第四十八页，本课件共有154页Sample 1:胰岛素的改造胰岛素的改造常规胰岛素的缺点常规胰岛素的缺点:在高于生理浓度在高于生理浓度(10-810-10 mol/L)自身聚合自身聚合药用浓度高药用浓度高,10-4 mol/L发挥生理功能需要单体形式与专一受体结合发挥生理功能需要单体形式与专一受体结合解决途径解决途径基于基于IGF-1是以单体形式存在是以单体形式存在,将胰岛素将胰岛素B链的链的B28-B29的残基序列颠倒成的残基序列颠倒成IGF-1 相应序列相应序列向胰岛素二聚体形成面引入带电荷或具有大的侧链向胰岛素二聚体形成面引入带电荷或具有大的侧链的残基的残基,以阻碍二

33、聚体的形成以阻碍二聚体的形成第四十九页，本课件共有154页Sample 2:酶分子的定向酶分子的定向进化进化l定点突变等基因改造技术，定点突变等基因改造技术，改变蛋白序列中的改变蛋白序列中的个别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特个别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋性进行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工程技术又称为白质工程技术又称为分子进化的理性设计分子进化的理性设计。第五十页，本课件共有154页人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法直接提取法制人胰岛素直接提取法制人胰岛素化学合成法制人胰岛素化学合成法制人胰岛素化学转型法制人胰岛素化学转型法制

34、人胰岛素在在pH为为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链链C末端的丙氨酸末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。团，最终获得人胰岛素。基因重组法基因重组法重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点第五十一页，本课件共有154页第五十二

35、页，本课件共有154页定点突变和随机突变其代表性的方法 定点方法定点方法旧的旧的u使用使用RE的片段改组的片段改组u盒式突变盒式突变新的新的u寡核苷酸定点突变寡核苷酸定点突变uPCR为基础的点突变为基础的点突变随机方法随机方法旧随机方法旧随机方法u紫外线紫外线X射线射线其他化学方法其他化学方法新的随机方法新的随机方法u转座子转座子u简并引物简并引物PCR介导的定点突变使用引物情况介导的定点突变使用引物情况利用引物在基因的利用引物在基因的5末端和末端和3末端产生定点突变末端产生定点突变利用引物在目的基因的中心区段产生定点突变利用引物在目的基因的中心区段产生定点突变第五十三页，本课件共有154页K

36、ary B.Mullisforhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)methodforhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudiesTheNobelPrizeinChemistry1993MichaelSmith定点突变定点突变第五十四页，本课件共有154页引物设计原则 引物应用核酸系列保守区内设计并具引物应用核酸系列保守区内设计并具有特

37、异性。有特异性。产物不能形成二级结构。产物不能形成二级结构。引物长度一般在引物长度一般在1530碱基之间。碱基之间。G+C含量在含量在40%60%之间。之间。碱碱基要随机分布。基要随机分布。引物自身不能有连引物自身不能有连续续4个碱基的互补。个碱基的互补。引物之间不能有引物之间不能有连续连续4个碱基的互补。个碱基的互补。引物引物5端可以端可以修饰。修饰。引物引物3端不可修饰。端不可修饰。引物引物3端要避开密码子的第端要避开密码子的第3位。位。第五十五页，本课件共有154页蛋白质融合表达的主要方法蛋白质融合表达的主要方法重组基因直接剪接于适当信号肽之后重组基因直接剪接于适当信号肽之后将外源按阅读

38、框架自我融合将外源按阅读框架自我融合目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C端或端或N端融合端融合分泌分泌-亲和融合亲和融合双亲和融合双亲和融合分泌分泌-插入融合插入融合第五十六页，本课件共有154页改造蛋白质的方法改造蛋白质的方法物物理理、化化学学法法：对对蛋蛋白白质质进进行行变变性性、复复性性处处理理，修修饰饰蛋蛋白白质质侧侧链链官官能能团团，分分割割肽肽链链，改改变变表表面面电电荷荷分分布布促促进进蛋蛋白白质质形形成成一一定定的立体构像等等。的立体构像等等。生生物物化化学学法法：使使用用蛋蛋白白酶酶选选择择性性地地分分割割蛋蛋白白质质，利利用用转转糖糖苷苷酶

39、酶、酯酯酶酶、酰酰酶酶等等去去除除或或连连接接不不同同化化学学基基团团，利利用用转转酰酰胺胺酶酶使使蛋蛋白白质发生胶连等等质发生胶连等等。第五十七页，本课件共有154页分子生物学途径分子生物学途径：利用体外重组或PCR技术进行定位突变（插入/删除/替换一个或多个氨基酸残基）；基因融合和剪接：将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。改造蛋白质的方法改造蛋白质的方法第五十八页，本课件共有154页改变蛋白质结构的核心技术基因的人工定点突变 插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基

40、酸残基。重组DNA技术或PCR方法第五十九页，本课件共有154页1.M131.M13载体法载体法(Kunkel 突变法)人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物将将待待研研究究的的基基因因插插入入载载体体M13M13，制制得得单单链链模模板板，合合成成相相应应的的互互补补链链，用用T4T4连连接接酶酶连连接接成成闭闭环环双双链链分子。（分子。（制备单链制备单链DNA常用菌株常用菌株是M13M13噬菌体）噬菌体）经经转转染染大大肠肠杆杆菌菌，双双链链分分子子在在胞胞内内分分别别复复制制，因因此此就就得得到到两两种种类类型型的的噬噬菌菌斑斑，含含错错配配碱碱基基

41、的的就就为为突突变变型型。再再转转入入合合适适的的表表达达系系统统合合成成突突变变型型蛋蛋白白质。质。经经此此扩扩增增出出来来的的基基因因有有1/21/2是是突突变变了了的的基基因因，经经一定的筛选便可获得突变基因。一定的筛选便可获得突变基因。第六十页，本课件共有154页2.2.重组重组PCR定点诱变法定点诱变法 利利用用两两个个互互补补的的带带有有突突变变碱碱基基的的内内侧侧引引物物及及两两个个外外侧侧引引物物，先先进进行行两两次次PCRPCR扩增，获得两条彼此重叠的扩增，获得两条彼此重叠的DNADNA片段。片段。两两条条片片段段由由于于具具有有重重叠叠区区，因因此此在在体体外外变变性性和和

42、复复性性后后可可形形成成两两种种不不同同的的异异源源双双链链DNADNA分分子子，其其中中一一种种带带有有凹凹险险末末端端的的DNADNA可可通通过过TaqTaq酶酶延延伸而形成带有突变位点的全长基因。伸而形成带有突变位点的全长基因。该该基基因因再再利利用用两两个个外外侧侧引引物物进进行行第第三三次次PCRPCR扩扩增增，便便可可获获得得人人工工定定点点突突变变的基因。的基因。3.3.大引物诱变法大引物诱变法 利利用用一一个个带带突突变变位位点点的的内内侧侧引引物物与与一一个个外外侧侧引引物物先先进进行行PCRPCR扩扩增增，再再以以扩扩增增产产物物作作为为引引物物与与另另一一个个外外侧侧引引

43、物物进进行行第第二二次次PCRPCR扩增而获得人工定点突变的全长基因扩增而获得人工定点突变的全长基因。第六十一页，本课件共有154页4.4.盒式突变盒式突变(cassette(cassette mutagenesis)mutagenesis)1985年Wells提出特点：区域性的突变，又称片段取代法(DNA fragment replacement)。要点：是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。优势：一次处理就可以得到多种突变型基因。第六十二页，本课件共有154页5.硫代负链法硫代负链法核核

44、苷苷酸酸间间磷磷酸酸基基的的氧氧被被硫硫替替代代后后修修饰饰物物（S S）dCTPdCTP）对对某某些些内内切切酶酶有有耐耐性性，在在有有引引物物和和（S S）dCTPdCTP）存存在在下下合合成成负负链链，然然后后用用内内切切酶酶处处理理，结结果果仅仅在在正正链链上上产产生生“缺缺口口”，用用核核苷苷酸酸外外切切酶酶IIIIII从从3 355扩扩大大缺缺口口并并超超过过负负链链上上错错配配的的核核苷苷酸酸，在在聚聚合合酶酶作作用用下下修修复复正正链链，就就可可以得到二条链均为突变型的基因。以得到二条链均为突变型的基因。第六十三页，本课件共有154页1、蛋白质结构的设计方法、蛋白质结构的设计方

45、法 从头设计从头设计二级结构模块单元的自组装配体诱导组装通过共价交叉连接实现肽的自组装在合成模板上肽的组装线性多肽折叠为球状结构基于组合库的全新蛋白质设计 第六十四页，本课件共有154页二级结构模块单元的自组装二级结构模块单元的自组装模块设计设计合成单一二级结构单元（螺旋或折叠股）作为多肽链的片段的模块，然后复制这些二级结构模块并把它们连接为整个蛋白质结构。优点：简单、直接、容易合成缺点：稳定性依赖于浓度、结构简单重复第六十五页，本课件共有154页配体诱导自组装配体诱导自组装典型的是以金属离子作为配体将配体结合位点设计在结构中几个相互作用片段的界面处如果这个位点对配体有很高的亲和力，则结合配体

46、的合适的自由能将充分克服熵消耗并肽自组装第六十六页，本课件共有154页通过共价交叉连接实现肽的自组装通过共价交叉连接实现肽的自组装二硫键DAB法：8股-barrel中形成简单的从上到下的连接方法肽键：赖氨酸的侧链基团以及谷氨酸、天冬氨酸的侧链羧酸彼此间形成肽键；或者与主链的N端或C端形成肽键适用于设计由平行或反平行二级结构单元组成的结构第六十七页，本课件共有154页在合成模板上肽的组装在合成模板上肽的组装模板组装合成蛋白法（TASPs,Mutter）使用人工模板形成turn或loop特点：每条肽链显示最低限度的浓度倚赖关系，但是一旦它们连接到模板上，它们的结构倾向于稳定并且不依赖于年度优点：能

47、模拟天然蛋白质的性质第六十八页，本课件共有154页线性多肽折叠为球状结构线性多肽折叠为球状结构最小化途径：把全新设计的复杂性简化为几个涉及天然蛋白稳定性的关键特征，然后优化这些特征。内堆积因素“负设计负设计”：设计一个互补的不稳定的竞争结构第六十九页，本课件共有154页基于组合库的全新设计基于组合库的全新设计“二元模式”通过合成基因在细菌中表达制备，同时通过基因编码实现组合多样性。疏水核堆积优化、二级结构单元间界面优化计算机辅助设计方法第七十页，本课件共有154页抗体人源化体现的蛋白质工程的思想抗体人源化体现的蛋白质工程的思想 蛋白质工程是蛋白质工程是以以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系

48、蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行物学的手段进行基因修饰或基因合成基因修饰或基因合成，对，对现有现有蛋白质进行定向蛋白质进行定向改造改造，设计、构建并最终生产，设计、构建并最终生产出性能比自然存在的蛋白质更加优良、更加符合出性能比自然存在的蛋白质更加优良、更加符合人类对生产和生活的需要的新型蛋白质人类对生产和生活的需要的新型蛋白质鼠源性抗体有以下缺点：应用于人体可产生人抗小鼠抗体；其次鼠源性抗体通常不能有鼠源性抗体有以下缺点：应用于人体可产生人抗小鼠抗体；其次鼠源性抗体通常不能有效地激活人体的生物效应功能；此外其

49、次鼠源性抗体在人体内的半衰期也短效地激活人体的生物效应功能；此外其次鼠源性抗体在人体内的半衰期也短为了克服以上缺点，对鼠源性抗体为了克服以上缺点，对鼠源性抗体进行了从进行了从人人人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 到到到到 改形抗体改形抗体 到到 表面重塑抗体表面重塑抗体 到到 抗体库技术优化人改形抗体抗体库技术优化人改形抗体 的不断改良与优化的人源化过程的不断改良与优化的人源化过程第七十一页，本课件共有154页(1)人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 人人人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定是将鼠源单抗的可变区

50、与人抗体的恒定是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中表达而得到的抗体。区连接起来并在合适的宿主细胞中表达而得到的抗体。区连接起来并在合适的宿主细胞中表达而得到的抗体。区连接起来并在合适的宿主细胞中表达而得到的抗体。人人-鼠嵌合抗体的特点鼠嵌合抗体的特点鼠嵌合抗体的特点鼠嵌合抗体的特点含含7580%人抗体，人抗体，20%鼠抗体。鼠抗体。恒定区是人源性的，大大降低了恒定区是人源性的，大大降低了HAMA。可有效激活可有效激活CDC和和ADCC。可变区为鼠源，保留了亲本单抗的亲和力和特异性。可变区为鼠源，保留了亲本单抗的亲和力和特异性。在人体内的半衰期明显延长。在人体内的半衰