胰岛素的制备精选课件.ppt

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1、关于胰岛素的制备关于胰岛素的制备第一页，本课件共有43页必要性必要性l胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。第二页，本课件共有43页第三页，本课件共有43页原理原理l基因工程技术主要内容或步骤可分为目的基因制备和分离，构建DNA重组体；DNA重组体扩增和表达，重组体筛选和鉴定；外源基因表达，产物分离纯化和鉴定以及将目的基因克隆到

2、表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下次进行功能性表达，生产出人类所需要的物质。第四页，本课件共有43页预想预想l把人的胰岛素的基因提取出来，接在一个小的载体上，得到一个重组的载体，再转化到真核细胞，细胞并不认为是人的基因就不管它，会当成自己的基因进行胰岛素的合成，每一个细胞就相当于生产胰岛素的工厂，实际上我们可以通过改变胰岛素基因前面的调控序列，让细胞停止合成其他的蛋白质，只合成胰岛素。第五页，本课件共有43页l但是胰岛素的A链、B链分别表达后如何使其正确连接成了人们关注的问题。第六页，本课件共有43页人胰岛人胰岛细胞生成胰岛素过程细胞生成胰岛素过程主要分为三个阶段：l第一步，机体首

3、先合成由109个氨基酸组成的前胰岛素原。l第二步，前胰岛素原脱去23个氨基酸，转变成含有86个氨基酸的胰岛素原。胰岛素原分子量为9000，是长的单链，含胰岛素的A链和B链及连接链。l第三步，胰岛素原再脱去4个碱基氨基酸，生成含31个氨基酸的C肽及含51个氨基酸的胰岛素分子。第七页，本课件共有43页第八页，本课件共有43页 用用E.coli做表达系统做表达系统 及及A链、链、B链分别表达的问题链分别表达的问题lE.coli是原核生物没有真核生物翻译后加工、修饰。lE.coli中表达的小分子外源蛋白不稳定。lE.coli与人的种属差异较大，有密码子的偏好性。lA链、B链间二硫键正确连接和其空间构象

4、正确形成较难。第九页，本课件共有43页一些解决办法一些解决办法l替换表达系统,换为酵母或动物细胞等真核表达系统。l仍用E.coli作为表达系统，将胰岛素基因与一些较大的蛋白分子的基因适当连接，使表达的蛋白分子量足够大，避免被蛋白水解酶分解，提高其稳定性及表达率。l在A链、B链间加入C链或其功能类似物，使胰岛素能够形成正确的空间构象。第十页，本课件共有43页 一、一、人胰岛素原在人胰岛素原在Pichia pastoris （毕赤酵母）中的表达（毕赤酵母）中的表达l毕赤酵母是一种甲醇营养酵母，l用酵母合成胰岛素的主要优点是可以进行体内加工形成二硫键的正确配对，产物分泌到培养基中，下游纯化比较简单。

5、l甲醇诱导醇氧化酶(Alcohol Oxidase)，AOX的表达是在转录水平上调控的，其启动子(PAoxl)属诱导型启动子，能非常有效的控制外源基因的表达。不仅能克服强启动子在宿主细胞内大剂量表达外源蛋白，会导致宿主细胞受损，甚至死亡的缺点，而且能高水平表达。第十一页，本课件共有43页 材料与方法材料与方法l1 材料l11 菌种和质粒 E.coli 、JMl09、SMDll68，质粒pUCl8、pHILS1l 12 限制性内切酶 EcoR、BamH、Bgl及T4DNA连续酶均购于Promega公司第十二页，本课件共有43页l 13 培养基 LB、YPD、RDB、BMG、BMM其中包括的主要成

6、分YNB(yeastnitrogenbase)购于Difco公司l 14 其它材料DNA回收试剂盒购于原平公司第十三页，本课件共有43页l2 方法l21 克隆步骤 扩增已克隆在质粒pUCl8上的胰岛素原基因，用EcoRI和BamHI双酶切，电泳，琼脂糖凝胶上回收283bp的胰岛素原基因片段，将穿梭质粒同样用EcoRI和BamHI双酶切，65，15min，酶灭活。酚抽提，酒精沉淀。溶于01XTE中。用T4DNA连接酶连接穿梭质粒与胶上回收片段。氯化钙法转化到大肠杆菌JMl09中，挑单菌落扩增鉴定。第十四页，本课件共有43页第十五页，本课件共有43页第十六页，本课件共有43页l22 表达质粒转化酵

7、母SMDl168菌 制备酵母感受态细胞，再将带有外源基因的穿梭质粒线性化，(可用Bgl酶切)。可用电激法，也可用invitrogen公司提供的转化试剂盒进行转化。然后在RDB选择培养基上筛选。般酵母转化菌需在2830长24天。第十七页，本课件共有43页l231 酵母生长期 将转化菌在BMG培养基中生长至OD600=46时，4离心3000g，5min，弃上清。l232 诱导表达期 弃上清，菌体重新培养于l5原体积的BMM培养基中进行诱导。每隔24小时，加0.5体积的诱导剂甲醇，诱导时间在100h以上。l233 SDS-PAGE凝胶电泳分析 4离心7000g，5min，留上清，电泳分析。l234

8、超滤浓缩与分子筛分离纯化胰岛素原。第十八页，本课件共有43页第十九页，本课件共有43页二二.人胰岛素原及其类似物人胰岛素原及其类似物 在在E.coli表达系统中的表达表达系统中的表达l为了使表达的胰岛素原稳定采取了下列方法：构建双肽的人胰岛素基因构建融合蛋白基因（其他蛋白基因胰岛素原基因）构建胰岛素原基因串第二十页，本课件共有43页（一）（一）MetLys双肽人胰岛素原基因双肽人胰岛素原基因 的构建表达及分离纯化的构建表达及分离纯化l在研究胰岛素的结构与生物功能的关系中，过去人们一直认为C肽含有 使胰岛素二硫键正确配对足够的结构信息。我国科学家在成功地解决胰岛素 的A、B 链重组问题及随后对交

9、联胰岛素的研究后，人们对“C肽含有使 胰岛素二硫键正确配对的足够的结构信息”这一论点产生了质疑。第二十一页，本课件共有43页l20世纪80年代至90年代，科学家对不同长度的C肽进行了研究，结果表明，C 肽在胰岛素A、B链正确配对时，可能只起柔性连结肽作用，使得双分子反应变为分子内反应。而A、B链包含了足够的使二硫键正确配对的信息，C肽的长短可能对A、B链的重组产生影响。第二十二页，本课件共有43页材料与方法材料与方法l11 材料l111 质粒与菌株质粒pJGl03:含B-C-A人胰岛素原基因 (Met-HP）；质粒pJG111：含BCCA人胰岛素原基因(Met双C肽HP)表达载体；质粒pBV2

10、20：温度诱导质粒。第二十三页，本课件共有43页l112 酶和主要试剂 胰蛋白酶(10900Umg)、人胰岛素(260Umg)、猪胰岛素(260Umg)、羧肽酶B、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、dNTPs、T4 DNA聚合酶、DNA测序试剂盒、T7SequencingTMKit、阴离子交换层析柱ResourceTMQ、SephadexG75、胰岛素放免试剂盒、人胎盘胰岛素受体。第二十四页，本课件共有43页l113 引物 5突变引物 5GGAATTCCGGATGAAGTTTGTC3，起始密码子ATG与Phe之间插入了Lys的密码子AAG 测序引物 5ACGCTTTTGAAGTGAT3，与双C

11、肽人胰岛素原基因294279碱基互补3通用引物 5GTCGACGGATCCTCA3第二十五页，本课件共有43页l12 方法l121 重组质粒pJG112(含MetLys双C肽人胰岛素原基因)的构建第二十六页，本课件共有43页第二十七页，本课件共有43页l以pJG111(含Met双C肽人胰岛素原基因)质粒DNA作为模板，利用5端突变引物和3端通用引物，进行PCR扩增，反应体系总体积50l，95预变性10min后加入1.5U Taq聚合酶，反应参数为93,45s；50，60s；72，90s；35个循环后72延伸10min第二十八页，本课件共有43页 15低熔点琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，然后用E

12、coR 和BamH 双酶切，回收后与pJGl03(含BCA人胰岛素原基因)载体大片段连接(经EcoR 和BamH双酶切后回收)，转化大肠杆菌感受态细胞DH5第二十九页，本课件共有43页l122 质粒pJGll2的筛选和鉴定 酶切筛选：将转化出的单菌落采用常规小量质粒制备方法制备质粒DNA，取1g DNA，用EcoR I和BamH I双酶切后进行15琼脂糖凝胶电泳，凡有约380bp片段出现的重组克隆作序列分析鉴定第三十页，本课件共有43页 温度诱导表达筛选：挑取转化的单菌落，37 培养过夜，次日扩大10倍37培养3 h，42诱导46 h。离心得菌体，适量无菌水悬浮后，取适量菌体悬浮液进行15SD

13、SPAGE，以pBV220和pJGl03转化菌液作为对照 DNA序列测定：采用izardplus Minipreps DNA purification System提取测序模板，采用Sanger双脱氧终止法，测序反应按Pharmacia公司T7SequencingTMKit说明书进行6变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析第三十一页，本课件共有43页l123 MetLys双C肽人胰岛素原基因的摇瓶表达 挑取单菌落于3 ml LB Amp+培养液中，37培养12 h，扩大100倍30培养过夜，次日上午以1：10稀释，30培养4 h，42诱导6 h，6000rmin离心收获菌体第三十二页，本课件共有43页l1

14、24 MetLys双C肽人胰岛素原的分离纯化 20g湿菌体经超声破碎细胞，裂解包含体，还原，重组，超滤浓缩至67 ml的重组液经SephadexG75(17cml00cm)层析分离，收集目的蛋白取少量进行“SDSPAGE分析，其余的调pH2530，加入NaCl使终浓度达12(WV)，离心，收集沉淀，冰冻保存第三十三页，本课件共有43页l125 MetLys双C肽人胰岛素原转化为人胰岛素 取适量上述胰岛素原类似物盐析沉淀溶于0.05molL TrisHCL pH75缓冲液，经紫外吸收法准确测定MetLys双C肽HPI的浓度后，加入适量胰蛋白酶和羧肽酶B，使质量比例分别为50：1和300：1，37

15、反应05 h，立即冷却，终止反应，酶解液用HCl调pH2530，并加入异丙醇使其浓度达40(VV)经ResourceTMQ(1 m1)阴离子交换柱分离，采用NaCl盐浓度梯度为0015 mol/l的上述缓冲液进行洗脱，以猪胰岛素作为对照，收集胰岛素峰，用05mol/l乙酸透析除盐，冻干备用第三十四页，本课件共有43页结结 果果l2l 重组质粒的构建 利用5端起始密码子ATG和胰岛素B1 TTT之间加入Lys密码子AAG的突变引物相3端通用引物，以含双C肽胰岛素原基因的质粒pJG111作模板，进行PCR扩增，获得约380bp的产物，由于胰岛素原基因的5端和3端分别引入了EcoR I和BamH I

16、酶切位点，因此PCR产物和载体质粒pJGl03(含BCA人胰岛素原基因)可分别用这两种酶酶切后产生粘性末端，经回收的PCR产物酶切小片段与载体大片段连接，转化EcoliDH5后获得重组质粒pJG112，采用3种方法进行筛选和鉴定。第三十五页，本课件共有43页l 首先提取pJG112质粒DNA，经EcoR I和BamH I双酶切筛选，产物进行15琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明双酶切的小片段大小与pJG111双酶切小片段相近，约370 bp，比pJGl03双酶切的小片段(约280 bp)大，初步说明已获得突变胰岛素原类似物基因，并重组到pJGl03质粒内。第三十六页，本课件共有43页第三十七页，本课

17、件共有43页l 鉴于所用载体为一个表达型载体，所以可进行表达筛选将初步筛选出的阳性克隆小量进行表达，产物进行SDSPAGE分析，结果表明在电泳条带的前沿有明显表达带，分子大小比pJGl03质粒表达产物Met人胰岛素原大，由于pJG111表达产物为Met双C肽人胰岛素原，与pJG112表达产物MetLys双C肽人胰岛素原仅有一个氨基酸差别，故二者条带位置相近，而对照质粒pBV220(空载体)表达产物中的上述二个相应位置处均无明显条带。第三十八页，本课件共有43页第三十九页，本课件共有43页l 最后进行DNA序列测定分析：在MetLys双C肽人胰岛素原基因序列中有一个Lys密码子AAG插在于起始密

18、码子ATG和B1 Phe密码子TTT之间，测序电泳结果表明突变已正确发生，从而获得重组质粒pJG112。第四十页，本课件共有43页第四十一页，本课件共有43页（二）其他方法（二）其他方法l1、基因工程方法构建小C肽人胰岛素原类似物（B2RA）制备胰岛素。l2、将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白A的基因上，构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体，利用亲核层析从培养液中分离产物，制备胰岛素。l3、选Tac启动子，构建以牛凝乳酶原B前161个氨基酸的多肽基因与人胰岛素原基因的融合基因的表达质粒，转化大肠杆菌，处理包含体得到胰岛素原，制备胰岛素。l4、通过构建含有人胰岛素原类似物（BKRA）基因的基因串载体，将其转入大肠杆菌，获得目的产物人胰岛素原类似物，制备胰岛素。第四十二页，本课件共有43页感谢大家观看第四十三页，本课件共有43页