单克隆抗体制备26441说课材料.ppt

《单克隆抗体制备26441说课材料.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《单克隆抗体制备26441说课材料.ppt（31页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、单克隆抗体制备26441免疫血清和单克隆抗体的制备免疫血清和单克隆抗体的制备佐佐佐佐 剂剂剂剂1.1.概念概念概念概念 佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答的类型。的类型。的类型。的类型。2.2.种类种类种类种类 1 1）卡介苗（）卡介苗（）卡介苗（）卡介苗（BCGBCG）、

2、短小棒状杆菌（）、短小棒状杆菌（）、短小棒状杆菌（）、短小棒状杆菌（CPCP）、脂）、脂）、脂）、脂 多糖（多糖（多糖（多糖（LPSLPS）、细胞因子；）、细胞因子；）、细胞因子；）、细胞因子；2 2）氢氧化铝、明矾；）氢氧化铝、明矾；）氢氧化铝、明矾；）氢氧化铝、明矾；3 3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly Ipoly I：C C）和双）和双）和双）和双 链多聚腺苷酸：鸟苷酸（链多聚腺苷酸：鸟苷酸（链多聚腺苷酸：鸟苷酸（链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly Apoly A：U U）；）；）；）；4 4）矿物油、脂质体、

3、免疫刺激复合物）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物 （ISCOMsISCOMs）、）、）、）、CPGCPG寡核苷酸。寡核苷酸。寡核苷酸。寡核苷酸。3.弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂 1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。2）配方：羊毛脂：液体石蜡）配方：羊毛脂：液体石蜡 为为1：2，也可，也可1：1。灭活卡介苗灭活卡介苗（2 2 20mg/ml20mg/ml）。）。4.弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 剂。剂。5.用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳

4、化。用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。动动 物物 选选 择择对免疫动物的主要要求有：对免疫动物的主要要求有：对免疫动物的主要要求有：对免疫动物的主要要求有：1.1.应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制 备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源 生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力越生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫

5、应答能力越生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力越生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力越 强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。2.2.动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家 兔初始免疫体重通常在兔初始免疫体重通常在兔初始免疫体重通常在兔初始免疫体重通常在2 22.5kg2.5kg。3.3.性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌

6、性非妊性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊 娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或 应用免疫抑制剂的动物。应用免疫抑制剂的动物。应用免疫抑制剂的动物。应用免疫抑制剂的动物。免疫方法免疫方法免疫方法免疫方法1.1.免疫途径免疫途径免疫途径免疫途径 1 1）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、

7、皮下、皮内和）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和 淋巴结等。淋巴结等。淋巴结等。淋巴结等。2 2）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。3 3）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小 鼠腹腔注射。鼠腹腔注射。鼠腹腔注射。鼠腹腔注射。4 4）可溶性抗原（如）可溶性抗原（如）可溶性抗原（如）可溶性抗原（如IgGIgG）采用弗氏完全佐剂的乳）采用弗氏完全佐剂

8、的乳）采用弗氏完全佐剂的乳）采用弗氏完全佐剂的乳 剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。2.可溶性抗原免疫可溶性抗原免疫 1）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行 加强免疫，以后每隔加强免疫，以后每隔2周加强免疫一次。周加强免疫一次。2）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验 测定血清效价测定血

9、清效价1：32或或ELISA法测定抗体效价法测定抗体效价 1：10 000，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉 或心脏全部血液，分离血清。或心脏全部血液，分离血清。4）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需45 次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免 疫。疫。3.颗粒性抗原免疫颗粒性抗原免疫 第一周注射第一周注射2次，随后每周加强免疫次，随后每周加强免疫1次，次，45天天 试血。试血。3.操作程序操作程序 1）健康雄性家兔体重）健康雄性家兔体重2.5 3 kg，背部皮下多点注射。，背部

10、皮下多点注射。2）基础免疫：抗原完全佐剂）基础免疫：抗原完全佐剂(抗原剂量抗原剂量4mg/只只)2ml (1:1V/V)吸入两支注射器内，三通连接，吸入两支注射器内，三通连接，反复推拉混合至乳化悬液。反复推拉混合至乳化悬液。3）加强免疫：抗原不完全佐剂）加强免疫：抗原不完全佐剂(抗原剂量抗原剂量2.5mg/只只)，间隔间隔710天加强一次。约天加强一次。约23次。次。4）试）试 血：末次注射后第血：末次注射后第7天取少量静脉血，免疫双天取少量静脉血，免疫双 扩试验血清检测，抗血清效价扩试验血清检测，抗血清效价 1：32（或（或 ELISA法检测抗体效价法检测抗体效价1：10，000）时颈）时颈

11、 动脉放血，分离血清，分装，保存。动脉放血，分离血清，分装，保存。二二 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 1975年年 Kohler和和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。的研究进入了一个高度准确的新纪元。1.1.原理原理原理原理 根据致敏的单一根据致敏的单一根据致

12、敏的单一根据致敏的单一B B细胞克隆具有分泌特异性抗体和细胞克隆具有分泌特异性抗体和细胞克隆具有分泌特异性抗体和细胞克隆具有分泌特异性抗体和骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术在体外可将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤在体外可将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤在体外可将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤在体外可将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞因具备了细胞因具备了细胞因具备了细胞因具备了B B细胞和骨髓瘤细胞的双重

13、特性，即可分细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分泌抗体，又能在泌抗体，又能在泌抗体，又能在泌抗体，又能在HATHAT培养基中长期存活。因此，可通过培养基中长期存活。因此，可通过培养基中长期存活。因此，可通过培养基中长期存活。因此，可通过HATHAT选择性培养，筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株，再选择性培养，筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株，再选择性培养，筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株，再选择性培养，筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株，再利用杂交瘤细胞培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生的利用杂交瘤细胞培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生的利用杂交瘤细胞

14、培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生的利用杂交瘤细胞培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生的腹水，获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体腹水，获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体腹水，获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体腹水，获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体（monoclonal antibody,mAbmonoclonal antibody,mAb）。）。）。）。2.试剂与器材试剂与器材（1）细胞融合剂：聚乙二醇（）细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）（2）0.2mol/L L-谷氨酰胺贮存液谷氨酰胺贮存液（3）200 双抗（青、链霉素）溶液双抗（青、链霉素）溶液（4）RPMI-1

15、640培养液培养液（5）15%胎牛血清胎牛血清RPMI-1640培养液培养液（6）100 氨基蝶呤（氨基蝶呤（A）贮存液）贮存液（7）100 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（8）1 HAT培养液培养液（9）1 HT培养液培养液（10）100 8-杂氮鸟嘌呤贮存液杂氮鸟嘌呤贮存液（11）细胞冻存液：）细胞冻存液：90ml含含30%FCS的的RPMI-1640培养培养 液液+10ml DMSO（12）0.2M pH 7.4 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（13）主要仪器设备：）主要仪器设备：CO2培养箱、超净工作台、倒置培养箱、超净工作台、倒置 显微镜、精密天平、低温和普通冰箱

16、、液氮罐、显微镜、精密天平、低温和普通冰箱、液氮罐、离心机、高压灭菌器、烤箱、水浴锅、除菌滤离心机、高压灭菌器、烤箱、水浴锅、除菌滤 器、酶联免疫测定仪等。器、酶联免疫测定仪等。（14）常规实验器材：血细胞记数板、各种吸管、离心）常规实验器材：血细胞记数板、各种吸管、离心 管、细胞培养瓶、培养皿、管、细胞培养瓶、培养皿、24孔和孔和96孔培养板、孔培养板、细胞冻存管、注射器、微量移液器等。细胞冻存管、注射器、微量移液器等。（15）抗体纯化器材与试剂。）抗体纯化器材与试剂。（16）小鼠实验器材：手术剪刀、镊子等解剖器材。）小鼠实验器材：手术剪刀、镊子等解剖器材。（17）骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞

17、系）骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0或或NS-1。3.实验流程实验流程（1）实验动物免疫：）实验动物免疫：BALB/c小鼠，雌性，小鼠，雌性，68W。常规免疫方案：常规免疫方案：0、15、30天，天，72 h后制备脾细后制备脾细 胞悬液。胞悬液。基础免疫：基础免疫：10100 g抗原抗原(可溶性抗原可溶性抗原)完全佐剂完全佐剂 0.2ml(1:1V/V)，背部皮下多点注射。，背部皮下多点注射。加强免疫：同量抗原不完全佐剂，间隔加强免疫：同量抗原不完全佐剂，间隔710天一天一 次。约次。约23次，皮下或腹腔注射。次，皮下或腹腔注射。试试 血：取静脉血，血：取静脉血，ELISA法检测血清中抗

18、体滴度，法检测血清中抗体滴度，当效价达到当效价达到 1：400以上时，进行加强免疫。以上时，进行加强免疫。弱免疫原免疫方案：弱免疫原免疫方案：0天、天、30天、天、45天、天、60天、天、75天。天。（2）免疫动物脾细胞悬液的制备）免疫动物脾细胞悬液的制备：将末次免疫后将末次免疫后3天天BALB/c小鼠处死，消毒，无菌小鼠处死，消毒，无菌取出脾脏，置入无菌取出脾脏，置入无菌PBS或培养液中。在或培养液中。在100目的钢网目的钢网上研磨脾脏。收集细胞于上研磨脾脏。收集细胞于50ml离心管中，离心管中，1500rpm离心离心5分，去上清。加入分，去上清。加入10ml PBS用吸管轻微混匀，用吸管轻

19、微混匀，1500rpm离心离心5分，去上清，用分，去上清，用10ml RPMI培养液悬浮。培养液悬浮。细胞计数（细胞数细胞计数（细胞数/ml=N/4 104 稀释倍数）稀释倍数）用用1640培养液调整细胞浓度至培养液调整细胞浓度至1 108/ml（3 3）饲养细胞制备）饲养细胞制备 在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。常用的是小鼠腹腔巨噬细胞加入的细胞称饲养细胞。常用的是小鼠腹腔巨噬细胞。将正常将正常BALB/cBALB/c小

20、鼠腹部消毒后，注射预冷的无血清小鼠腹部消毒后，注射预冷的无血清培养液培养液5ml5ml，轻揉腹部数次，于腹部左下处剪开腹膜，轻揉腹部数次，于腹部左下处剪开腹膜，吸取细胞悬液，反复吸取细胞悬液，反复2 23 3次，用培养液离心洗涤次，用培养液离心洗涤2 2次。次。用用15%FCS-RPMI-164015%FCS-RPMI-1640调细胞浓度为调细胞浓度为2 2 10105 5/ml/ml，将细胞，将细胞接种于接种于9696孔培养板，孔培养板，100100 l/l/孔。孔。（4 4）骨髓瘤细胞的准备）骨髓瘤细胞的准备 复苏骨髓瘤细胞用复苏骨髓瘤细胞用1010FCS-RPMI-1640FCS-RPM

21、I-1640培养液培培养液培养养1 1周，周，2 23 3天换液一次，依细胞生长情况天换液一次，依细胞生长情况3 34 4天传代天传代一次，适宜密度一次，适宜密度3103105 5/ml/ml。融合之前。融合之前3 3天，每天换一天，每天换一半培养液，使细胞保持在对数生长期。取对数生长骨半培养液，使细胞保持在对数生长期。取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2 2次，次，调细胞浓度调细胞浓度为为12 107/ml备用。备用。（5 5 5 5）细胞融合）细胞融合）细胞融合）细胞融合1 1 1 1）将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按）将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按）将骨髓瘤细胞与

22、脾脏细胞按）将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按1 1 1 1：10101010或或或或1 1 1 1：5 5 5 5的比例混的比例混的比例混的比例混 合，在合，在合，在合，在50ml50ml50ml50ml离心管中用无血清培养液洗离心管中用无血清培养液洗离心管中用无血清培养液洗离心管中用无血清培养液洗1 1 1 1次，离心次，离心次，离心次，离心 弃上清；弃上清；弃上清；弃上清；2 2 2 2）1min1min1min1min内加入内加入内加入内加入37373737预温的预温的预温的预温的1ml 501ml 501ml 501ml 50PEGPEGPEGPEG溶液，边加边溶液，边加边溶液，边加边溶液，边

23、加边 摇摇摇摇37373737水浴水浴水浴水浴1min1min1min1min；3 3 3 3）加）加）加）加37373737预温的不完全培养液以终止预温的不完全培养液以终止预温的不完全培养液以终止预温的不完全培养液以终止PEGPEGPEGPEG作用，每隔作用，每隔作用，每隔作用，每隔 2min 2min 2min 2min分别加入分别加入分别加入分别加入1ml1ml1ml1ml、2ml2ml2ml2ml、3ml3ml3ml3ml、4ml4ml4ml4ml、5ml5ml5ml5ml和和和和6ml6ml6ml6ml；4 4 4 4）离心，弃上清，用含）离心，弃上清，用含）离心，弃上清，用含）离心

24、，弃上清，用含20202020小牛血清小牛血清小牛血清小牛血清HATHATHATHAT选择培养液选择培养液选择培养液选择培养液 重悬；重悬；重悬；重悬；5 5 5 5）将上述细胞加入已有饲养细胞的）将上述细胞加入已有饲养细胞的）将上述细胞加入已有饲养细胞的）将上述细胞加入已有饲养细胞的96969696孔培养板内，孔培养板内，孔培养板内，孔培养板内，每孔每孔每孔每孔100100100100 l l l l，放入放入放入放入37 537 537 537 5COCOCOCO2 2 2 2培养箱培养。培养箱培养。培养箱培养。培养箱培养。（6）融合细胞观察、换液及杂交瘤抗体检测）融合细胞观察、换液及杂交

25、瘤抗体检测 细胞培养细胞培养3天后，使用天后，使用HAT培养液换液；培养液换液；3天后，再天后，再次使用次使用HAT培养液换液。培养液换液。当细胞克隆集落大于当细胞克隆集落大于3mm时，利用间接时，利用间接ELISA法筛法筛选分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。选分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。（7）杂交瘤细胞克隆化）杂交瘤细胞克隆化 将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限稀将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限稀释法稀释细胞（用释法稀释细胞（用HAT培养液稀释细胞），于培养液稀释细胞），于96孔培孔培养板中加入养板中加入0.1ml/孔，培养孔，培养2周，利用间接周，利用间接ELI

26、SA法挑法挑选单个阳性杂交瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，直至选单个阳性杂交瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，直至亚克隆时全部克隆孔细胞培养上清中抗体检出阳性率为亚克隆时全部克隆孔细胞培养上清中抗体检出阳性率为100%为止。为止。（8）杂交瘤细胞冻存与复苏）杂交瘤细胞冻存与复苏 将阳性细胞克隆在培养板或培养瓶中扩大培养，将阳性细胞克隆在培养板或培养瓶中扩大培养，收集细胞，离心收集细胞，离心1000转、转、5分，弃上清，加入细胞冻存分，弃上清，加入细胞冻存液，移至冻存管，液，移至冻存管，-70冰箱过夜，然后液氮长期保存。冰箱过夜，然后液氮长期保存。将冻存管从液氮中取出，立即放入将冻存管从液氮中取出，立

27、即放入37水浴中，水浴中，使之迅速融化。用培养液洗涤使之迅速融化。用培养液洗涤1次后，加入培养液继续次后，加入培养液继续培养。培养。（9）单克隆抗体的大量制备）单克隆抗体的大量制备 BALB/c雌性小鼠接种杂交瘤细胞前雌性小鼠接种杂交瘤细胞前12周，腹腔注周，腹腔注射降植烷预处理。用无血清培养液洗涤杂交瘤细胞射降植烷预处理。用无血清培养液洗涤杂交瘤细胞23次，次，调细胞浓度调细胞浓度12 106/ml，每只小鼠腹腔注射，每只小鼠腹腔注射0.51ml细细胞悬液。待小鼠腹部明显膨大时，收集腹水，离心，收集胞悬液。待小鼠腹部明显膨大时，收集腹水，离心，收集上清，分装，上清，分装，-80保存。保存。（

28、10）单克隆抗体纯化）单克隆抗体纯化盐析法盐析法 腹水腹水10ml等量生理盐水混匀，在电磁搅拌下逐等量生理盐水混匀，在电磁搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸胺滴缓慢加入饱和硫酸胺20ml，4放置放置0.5h以上或过夜。以上或过夜。离心（离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加生理盐水，弃上清。沉淀加生理盐水20ml溶解后，再次加入饱和硫酸胺溶解后，再次加入饱和硫酸胺10 ml，4放置放置0.5h或过夜。离心（或过夜。离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加尽，弃上清。沉淀加尽量少生理盐水溶解，装入透析袋中，用流动自来水透析量少生理盐水溶解，装入透析袋中，用流动自来水透析40min，再用

29、生理盐水透析，再用生理盐水透析24h，中间换液，中间换液34次，检测次，检测无无NH4离子存在即可。离子存在即可。-20备用。备用。凝胶柱层析凝胶柱层析 实验原理：实验原理：凝胶本身是多孔的分子筛，在交联剂作用下形成凝胶本身是多孔的分子筛，在交联剂作用下形成三维空间网状结构，蛋白质溶液流经凝胶柱时，根据三维空间网状结构，蛋白质溶液流经凝胶柱时，根据蛋白质分子量的大小不同，由大到小洗脱而进行分离。蛋白质分子量的大小不同，由大到小洗脱而进行分离。（大分子蛋白质不能进入凝胶粒内部，在胶粒间隙随（大分子蛋白质不能进入凝胶粒内部，在胶粒间隙随洗脱液最先流出。而小分子蛋白质进入胶粒内部洗脱洗脱液最先流出。

30、而小分子蛋白质进入胶粒内部洗脱较慢。）较慢。）关键点：关键点：1.装柱切忌有气泡和断层，有断层要重装柱；装柱切忌有气泡和断层，有断层要重装柱；2.加样时缓冲液面恰好在滤纸片上，及时加样避免柱加样时缓冲液面恰好在滤纸片上，及时加样避免柱 干涸，干涸凝胶不能继续使用；干涸，干涸凝胶不能继续使用；3.因操作时间长，宜在因操作时间长，宜在4操作，防止影响免疫球蛋白操作，防止影响免疫球蛋白 活性。活性。（1111）单克隆抗体免疫学性质检定）单克隆抗体免疫学性质检定 1 1）单克隆抗体特异性测定；）单克隆抗体特异性测定；2 2）单克隆抗体亚类测定；）单克隆抗体亚类测定；3 3）单克隆抗体效价测定；）单克隆

31、抗体效价测定；4 4）亲和力测定；）亲和力测定；5 5）识别抗原表位的识别抗原表位的测定。测定。4.单克隆抗体制备的几处要点：单克隆抗体制备的几处要点：1）相对分子量为）相对分子量为4000的的PEG融合效率最高。融合效率最高。2）免疫原性较强的抗原可不用佐剂，但一般可溶性蛋白）免疫原性较强的抗原可不用佐剂，但一般可溶性蛋白 抗原免疫时需要佐剂，并且乳化要充分。一般多采用抗原免疫时需要佐剂，并且乳化要充分。一般多采用 背部多点注射法免疫小鼠背部多点注射法免疫小鼠35只。只。3）选用高质量血清，细胞融合时可不用饲养细胞，但亚）选用高质量血清，细胞融合时可不用饲养细胞，但亚 克隆时应加入饲养细胞。

32、克隆时应加入饲养细胞。4）为防止骨髓瘤细胞发生次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转）为防止骨髓瘤细胞发生次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转 化酶的逆转，应定期用化酶的逆转，应定期用8-杂氮鸟嘌呤处理骨髓瘤细杂氮鸟嘌呤处理骨髓瘤细 胞。胞。5）应选用对数生长期的骨髓瘤细胞进行融合。胎牛血）应选用对数生长期的骨髓瘤细胞进行融合。胎牛血 清的质量直接影响细胞融合，应选用高质量的血清的质量直接影响细胞融合，应选用高质量的血 清。清。6）在克隆化过程中，应逐渐用普通的）在克隆化过程中，应逐渐用普通的RPMI-1640培养培养 液以液以1/2的速度替代的速度替代HAT培养液；用生长良好的阳培养液；用生长良好的阳 性杂交瘤细胞进行扩大培养。性杂交瘤细胞进行扩大培养。7）通过有限化稀释，使每孔含）通过有限化稀释，使每孔含0.51个杂交瘤细胞，个杂交瘤细胞，这样有利于挑选单一的细胞克隆。这样有利于挑选单一的细胞克隆。