基因工程及其应用45082说课材料.ppt

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1、基因工程及其应用45082基因工程：基因工程：即即 。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，生物的细胞里，地改造生物的地改造生物的 。原原 理：理：操作水平：操作水平：结结 果：果：基因重组基因重组DNADNA分子水平分子水平定向定向地改造生物的遗传性状，地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。获得人类所需要的品种。基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术定向定向遗传性状遗传性状CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTAC

2、TTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG 练习使用练习使用EcoRI 剪切目的基因剪切目的基因CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG 目的基因目的基因黏性末端黏性末端2.分子针线分子针线DNA连接酶连接酶(DNA linking-enzyme)积极思考DNA连接酶连接的是两个脱氧连接酶连接的是两个脱氧核苷酸核苷酸(deoxyribonucleotide)分子的什么部位？分子的什么部位？基因操作(gene engineering)的工具（2006.2006.台州质检）下列是由限制酶切割形台州质检

3、）下列是由限制酶切割形成的成的DNADNA片段，能用相应片段，能用相应DNADNA连接酶将它们连接酶将它们恢复连接的组合是恢复连接的组合是CTGCA GGCTTAA GACGTC AATTC GA.A.；B.B.；C.C.；D.D.以上都不对以上都不对A使用使用DNA连接酶制作重组连接酶制作重组DNA分子分子甲片段甲片段CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT 乙片段乙片段GGCATCTTAAAATTCCGTAG 重组重组DNA分子分子Recombinant DNAGGCATCTTAAAATTCCGTAG DNADNA连接酶的作用是：连接酶的作用是：A.A.子

4、链和母链之间形成氢键子链和母链之间形成氢键B.B.黏性末端之间形成氢键黏性末端之间形成氢键C.C.两个两个DNADNA末端间的缝隙连接末端间的缝隙连接D.AD.A、B B、C C都对都对 C3、基因的运载体、基因的运载体（2 2）条条件件能够能够在宿主细胞中在宿主细胞中复制复制并并稳定地稳定地保存保存具有具有多个限制酶切点，以便与多个限制酶切点，以便与外源基外源基因因连接连接具有具有标记基因标记基因，便于进行筛选，便于进行筛选如如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。、（3 3）常用）常用的运载体：的运载体：质粒、噬菌体和动、植物病质粒、噬菌体

5、和动、植物病毒等毒等（1 1）运载体的概念）运载体的概念 标记基标记基因，便因，便于进行于进行检测。检测。其中其中质粒质粒存在于存在于许多细菌和酵母菌等许多细菌和酵母菌等生物中生物中,是细胞染色体是细胞染色体外能够自主复制的外能够自主复制的很很小的环状小的环状DNADNA分子分子.（4）它们的共同特点是）它们的共同特点是都有侵染或进入都有侵染或进入宿主细胞的能力宿主细胞的能力从细胞中分从细胞中分离出离出DNA从大肠杆菌从大肠杆菌中提取质粒中提取质粒限制限制 酶酶提取目的基因提取目的基因限制酶限制酶目的基因与运目的基因与运载体结合载体结合DNA连连 接酶接酶目的基因导入目的基因导入受体细胞受体细

6、胞目的基因的表目的基因的表达与检测达与检测三、基因工程操作的基本步骤三、基因工程操作的基本步骤第一步：第一步：获取目的基因获取目的基因1 1、直接分离基因、直接分离基因鸟枪法鸟枪法该法最大的缺点是该法最大的缺点是带有很大带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。原核生物中去。有两种方法：有两种方法：逆转录法逆转录法：以信使：以信使RNARNA为模板，在为模板，在逆转录酶的作用下利用脱氧核苷酸合成逆转录酶的作用下利用脱氧核苷酸合成DNA(DNA(基因基因)。化学合成法化学合成法：根据蛋白质的氨基：根据

7、蛋白质的氨基酸顺序推算出信使酸顺序推算出信使RNARNA核糖核苷酸顺序，核糖核苷酸顺序，再据此推算出基因再据此推算出基因DNADNA的脱氧核苷酸顺序。的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。人工合成基因法人工合成基因法第二步：第二步：目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合注意：要用同一种限制酶切取目的基因注意：要用同一种限制酶切取目的基因和运载体，并用和运载体，并用DNA连接酶连接。连接酶连接。基因的针线：基因的针线：DNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A

8、A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割用同种限制酶切割第三步：第三步：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1、常用的受体细胞：、常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、动植大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、动植物细胞等物细胞等2、常用微生物作受体细胞的原因：、常用微生物作受体细胞的原因：微生物增殖快、代谢快、目的产物多微生物增殖快、代谢快、目的产物多(1)(1)检测的意义：鉴别目的基因是否真正导入检测的意义：鉴别目的基因是否真正导入受体细胞。受体细胞。(2)(2)检测方法：大肠杆菌质粒具有抗青

9、霉素基检测方法：大肠杆菌质粒具有抗青霉素基因（标记基因），只要检测受体细胞具有抗青霉因（标记基因），只要检测受体细胞具有抗青霉素的能力，就说明导入了目的基因。素的能力，就说明导入了目的基因。(3)(3)目的基因的表达：受体细胞表现出特定性目的基因的表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因导入和完成表达过程。状，说明目的基因导入和完成表达过程。目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达第四步第四步:要使目的基因与对应的运载体重组，所需的两种酶是要使目的基因与对应的运载体重组，所需的两种酶是()()限制酶限制酶连接酶连接酶解旋酶解旋酶还原酶还原酶 2.2.基因工程的正确操作步骤是（）基因工程的正确

10、操作步骤是（）使目的基因与运载体结合使目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞检测目的基因的表达是否符合特定性状要求检测目的基因的表达是否符合特定性状要求提取目的基因提取目的基因 积极思维积极思维:1 1、基因工程与作物育种、基因工程与作物育种苏云金杆菌苏云金杆菌转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基转鱼抗寒基因的番茄因的番茄转基因耐贮藏番茄（左）和普通番茄（右）转基因耐贮藏番茄（左）和普通番茄（右）不会引起过敏的转基因大豆不会引起过敏的转基因大豆生长快、肉质好的转基因生长快、肉质好的转基因鱼鱼(中国中国)乳汁中含有人生长激素的乳汁中含有人生长激素的

11、转基因牛转基因牛(阿根廷阿根廷)中国农业大学获得中国农业大学获得的转基因克隆奶牛的转基因克隆奶牛导入人基因具特殊导入人基因具特殊用途的猪和小鼠用途的猪和小鼠2 2、基因工程与药物研制、基因工程与药物研制我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程疫苗和药物工程疫苗和药物许多药品的生产许多药品的生产是从是从生物组织生物组织中提取中提取的。受材料来源限制的。受材料来源限制产量有限，其价格往产量有限，其价格往往十分昂贵。往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若化生产。若将生物合成相应药物成分的基因将生物合成相应药物成分的基因导入微导入微生物细

12、胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。产量问题，还能大大降低生产成本。胰岛素从猪、牛等动物的胰胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，腺中提取，100Kg100Kg胰腺只能提取胰腺只能提取4-5g4-5g的胰岛素，其产量之低和价的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。格之高可想而知。将合成的胰岛素基将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每因导入大肠杆菌，每2000L2000L培养液就能产生培养液就能产生100g100g胰岛素！使其价格胰岛素！使其价格降低了降低了30%-50%!30%-50%!干扰素治疗病毒感染简直是干扰素治疗病毒

13、感染简直是“万能灵药万能灵药”！过去从人血中提取，！过去从人血中提取，300L300L血才提取血才提取1mg1mg！其！其“珍贵珍贵”程程度自不用多说。度自不用多说。人造血液、白细胞介人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重人类的健康水平发挥了重大的作用。大的作用。人造血液及其生产人造血液及其生产乙肝疫苗乙肝疫苗我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程药物和疫苗工程药物和疫苗我国生产的部分胰岛素产品我国生产的部分胰岛素产品拓展题：拓展题：1.1.人与细菌是差异非常

14、大的两种生物，为人与细菌是差异非常大的两种生物，为什么通过基因重组后，细菌能够合成人体什么通过基因重组后，细菌能够合成人体的某些蛋白质呢？的某些蛋白质呢？这是因为基因水平上，人和细菌的遗传机这是因为基因水平上，人和细菌的遗传机制一致：制一致：1.1.遗传物质都是遗传物质都是DNA DNA 2.2.共同使用一套密码子共同使用一套密码子 3.3.都遵循中心法则都遵循中心法则四、四、基因工程基因工程的应用的应用1、基因工程与作物育种、基因工程与作物育种2、基因工程与药物研制、基因工程与药物研制3、环境保护：、环境保护：实例：实例：抗虫植物、耐盐碱棉花、转基因奶抗虫植物、耐盐碱棉花、转基因奶牛、超级绵

15、羊等。牛、超级绵羊等。培养抗虫植物的意义：培养抗虫植物的意义：成本低、污染少成本低、污染少胰岛素、干扰素、白细胞介素等胰岛素、干扰素、白细胞介素等净化石油的超级细菌净化石油的超级细菌从细胞中分从细胞中分离出离出DNA从大肠杆菌从大肠杆菌中提取质粒中提取质粒限制限制 酶酶提取目的基因提取目的基因限制酶限制酶目的基因与运目的基因与运载体结合载体结合DNA连连 接酶接酶目的基因导入目的基因导入受体细胞受体细胞目的基因的表目的基因的表达与检测达与检测三、基因工程操作的基本步骤三、基因工程操作的基本步骤3 3质质粒是基因工程中最常用的粒是基因工程中最常用的载载体，它存在于体，它存在于许许多多细细菌体菌体

16、内。某内。某细细菌菌质质粒上的粒上的标记标记基因如右基因如右图图所示，通所示，通过过标记标记基因可基因可以推知外源基因以推知外源基因(目的基因目的基因)是否是否转转移成功移成功。外源基因插入的。外源基因插入的位置不同，位置不同，细细菌在培养基上生菌在培养基上生长长情况也不同，右情况也不同，右图图示示外源基外源基因在因在质质粒中可插入的位置有粒中可插入的位置有a a、b b、c c点点。某同学根据。某同学根据实验现实验现象象对对其插入的位点其插入的位点进进行分析，其中分析正确的是行分析，其中分析正确的是实验现实验现象象实验实验推推论论在含青霉在含青霉素培养基素培养基上生上生长长情情况况在含四在含

17、四环环素素培养基上生培养基上生长长情况情况目的基因目的基因插入的位插入的位置置A A能生能生长长能生能生长长a aB B不能生不能生长长能生能生长长b bC C能生能生长长不能生不能生长长C CD D不能生不能生长长不能生不能生长长C CB 2(2010江苏生物，江苏生物，27)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图图1、图、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制限制酶酶BamHHindEcoRSma识别识别序列及序列及切割位点切割位点GGATC CC CTAGGAAGCT T

18、T TCGAAGAATT CC TTAAGCCCGGGGGGCCC(1)(1)一个图一个图1 1所示的质粒分子经所示的质粒分子经SmaSma切割前后，分切割前后，分别含有别含有_个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。(3)(3)用图中的质粒和外源用图中的质粒和外源DNADNA构建重组质粒，不能构建重组质粒，不能使用使用Sma Sma 切割，原因是切割，原因是_ _ 。(4)(4)与只使用与只使用EcoREcoR相比较，使用相比较，使用BmaHBmaH和和HindHind两种限制酶同时处理质粒、外源两种限制酶同时处理质粒、外源DNADNA的优点在于可的优点在于可以防止以防止_ _ 0、2Sma会破

19、坏质粒的抗性基因和外源会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因中的目的基因 质粒和含目的基因的外源质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化片段自身环化(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入的基因片段混合，并加入_酶。酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_ 。(7)为了从为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在肠杆菌突变体，然后在_的培养基中培养，以完成目的基因

20、表达的初步的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。检测。DNA连接连接鉴别和筛选含有目的基因鉴别和筛选含有目的基因的细胞的细胞 蔗糖为唯一含碳营养物质蔗糖为唯一含碳营养物质 解析：本题综合考查基因工程的过程及应用。解析：本题综合考查基因工程的过程及应用。(1)(1)质粒是双链环状质粒是双链环状DNADNA分分子，在子，在SmaSma切割前没有游离的磷酸基团，切割前没有游离的磷酸基团，SmaSma作用于两个核苷酸之作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键，切割产生的间的磷酸二酯键，切割产生的DNADNA片段末端是平末端，因而质粒经切割片段末端是平末端，因而质粒经切割后含有后含有2 2个游离的磷酸基

21、团。个游离的磷酸基团。(3)(3)据图据图1 1可知，可知，SmaSma切割的位点在抗生切割的位点在抗生素抗性基因之中，抗生素抗性基因是标记基因，应尽量避免破坏，据图素抗性基因之中，抗生素抗性基因是标记基因，应尽量避免破坏，据图2 2可知可知SmaSma切割的位点在目的基因之中，破坏了目的基因，所以不能使用切割的位点在目的基因之中，破坏了目的基因，所以不能使用SmaSma切割。切割。(4)(4)用同种限制酶切割后的质粒和目的基因，在基因表用同种限制酶切割后的质粒和目的基因，在基因表达载体构建时，常形成三种连接方式，达载体构建时，常形成三种连接方式，其中目的基因与目的基因的连接、其中目的基因与目

22、的基因的连接、质粒与质粒的连接是无效的连接，用两种限制酶可避免此类现象。质粒与质粒的连接是无效的连接，用两种限制酶可避免此类现象。(5)(5)基因表达载体的构建过程中需加基因表达载体的构建过程中需加DNADNA连接酶，连接脱氧核糖和磷酸。连接酶，连接脱氧核糖和磷酸。(6)(6)抗生素抗性基因属于标记基因，供重组抗生素抗性基因属于标记基因，供重组DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。(7)(7)目的基因是蔗糖转运蛋白基因，将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆目的基因是蔗糖转运蛋白基因，将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，应进行目的基因的检测与鉴定，可根据受体细胞是否含有菌突变体后，应进行目的基因的检测与鉴定，可根据受体细胞是否含有蔗糖转运蛋白，即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功，因蔗糖转运蛋白，即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功，因而可在含有蔗糖而可在含有蔗糖(唯一碳源唯一碳源)的培养基中培养。的培养基中培养。