基因探针-分子杂交技术电子教案.ppt

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1、基因探针-分子杂交技术基因探针v基因探基因探针针，即核酸探，即核酸探针针，是一段，是一段带带有有检测标记检测标记，且且序列序列已知的，与目的基因互已知的，与目的基因互补补的核酸序列的核酸序列(DNA或或RNA)。检测样品DNA的处理v提取检测样品的基因组提取检测样品的基因组DNAv用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段片段电泳分离及变性处理v琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段片段v变性处理变性处理v通常通常DNA变性的方法：变性的方法：热变热变性性、酸酸碱碱变变性性、化学化学试剂变试剂变性性在在0.4MNaOH碱性条件下变性碱性条

2、件下变性凝胶凝胶0.4MNaOH转移并固定到滤膜上v通过毛细管虹吸法，将凝胶上的通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射将将DNA固定在滤膜上固定在滤膜上。转移的方法v毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法探针的制备v一、探针的合成vPCR、化学合成等方法v二、探针的标记v同位素：3H、3535S、3232P等v非同位素：地高辛、生物素、荧光素等地高辛地高辛：可以与可以与可以与可以与dCTPdCTPdCTPdCTP连接成连接成连接成连接成地高辛地高辛地高辛地高辛-dCTP-d

3、CTP-dCTP-dCTP 原理：原理：地高辛地高辛+抗地高辛抗体抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记）（带有荧光素或酶的标记）杂交v预杂交：预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。v杂交：杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸在滤膜上。洗膜：洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。安装杂交管安装杂交管杂交炉杂交炉检测与分析v1 1、放射自显

4、影：适用于放、放射自显影：适用于放射性射性同位素标记的探针同位素标记的探针v2 2、比色或、比色或化学发光化学发光检测：检测：适于非适于非同位素标记的探针同位素标记的探针v通过放射自显影或生化检通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的存在与探针同源的DNADNA分子分子及其分子量。及其分子量。Northern杂交v1 1、检测、检测对象为对象为RNARNA。v2 2、与、与SouthernSouthern杂交不同的是：杂交不同的是：1 1）不需）不需要限制性核酸酶切；要限制性核酸酶切；2 2）变性方法不是碱）变性方法不是碱变性，而是采用化学试剂变性法。

5、变性，而是采用化学试剂变性法。v3 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知、主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异的特异mRNAmRNA的表达水平，或比较不同组的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。织或细胞的同一基因的表达情况。Western杂交v1、基本原理和基本、基本原理和基本过过程与程与Southern杂交杂交基本相同基本相同v2、检测对象为蛋白质（或酶）检测对象为蛋白质（或酶）v3、SDS-PAGE电泳分离电泳分离v4、用用“抗体抗体-抗原抗原”免疫反应或免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。LOGO结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！19