中国南海海绵中提取的异臭椿萜类的作用靶标确认与微管蛋白抑制剂的 抗肿瘤活性的定量构效关系研究资料讲解.ppt

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1、中国南海海绵中提取的异中国南海海绵中提取的异臭椿萜类的作用靶标确认臭椿萜类的作用靶标确认与微管蛋白抑制剂的与微管蛋白抑制剂的 抗抗肿瘤活性的定量构效关系肿瘤活性的定量构效关系研究研究计算机辅助药物设计简介二十世纪八十年代初期计算机辅助分子造型术该技术与合理药物设计（RationalDrugDesign）发展成现总称为计算机辅助药物设计的一大类方法新药研究的工具合理药物设计药物的活性是因一个药物的小分子（配体，Ligand）和另一个较大的分子受体（Receptor）或酶（Enzyme），相结合产生。分子进入酶的特殊空穴（活性点），与酶结合可干扰酶的催化作用，影响代谢，使疾病得到治疗合理药物设计，

2、是依据生物化学、酶学、分子生物学、遗传学、信息学以及计算化学等学科的研究成果，针对这些基础研究中所揭示的包括酶、受体、离子通道以及核酸等潜在的药物设计靶点，并参考其它类源性配体或天然产物底物的化学结构特征设计出合理的药物分子，以发现选择性作用于各种靶点的新药。计算机辅助药物设计的分类基于小分子的药物设计方法基于受体结构的药物设计方法定量构效关系方法药效团模型方法分子对接方法分子动力学方法从头设计方法计算机辅助药物设计的优越性在显示器屏幕上建立三维化学分子结构模型利用多年来计算化学（Computer Chemistry）的成果在模型基础上来计算各种分子的特性和分子间的相互作用 使用Chem-X分

3、子造型软件，根据X射线衍射解析分子结晶确定的 原子的位置 得到蛋白质分子的三维结构的模型在屏幕上随心所欲地移动分子 围绕假定的轴旋转 翻转并移向某个部位 可使特定的键转动可以计算分子的性质 两原子间的距离和角度，分子体积、表面积及分子形状 分子的电子特性、氢键、供体/受体或带电基团的性质研究分子间的相互作用，基团之间的结合等等近十多年来已取得实质性的进展，在许多药物的研究中取得成功，比如：HIV蛋白酶抑制剂Indinavir（已上市）HIV蛋白酶环脲类抑制剂的设计（曾经进入一期临床）唾液酸酶抑制剂的设计（已上市）老年痴呆症药物E2020（donepezil）（已上市）研究成果第一部分中国南海海

4、绵中提取的异臭椿萜类的中国南海海绵中提取的异臭椿萜类的作用靶标确认作用靶标确认课题的意义和背景：“受体学说”结合受体-配体复合物生物化学功能生物化学功能为什么要寻找药物作用的靶标？1.疾病治疗Nature 396，15（1998）2.毒副作用预测 Annu.Rev.Pharmacol Toxicol 2000,40:353388 1997,37:269296绝大多数无法上市Clin Pharmacol Ther.1991:50:471重要性：绝大多数药物无法上市（99%）毒副作用是重要原因之一（3040）大部分资金（每个药物约 三亿五千万美元）和时间（每个药物612年）浪费 在失败的药物上。D

5、rug Discovery Today 1997;2:72对未知功能的生物大分子特别是蛋白质分子进行功能预测，寻找和人类正常生理功能以及疾病发生和治疗过程密切相关的蛋白质并进行优先研究，是药物新靶标发现的重要方法和途径。3.蛋白质功能预测受体:45%酶:28%激素与因子:11%DNA:2%核受体:2%离子通道:5%未知:7%总共:4831.a.生物体是一个动态的平衡体系，蛋白质-配基相互作用处于中心地位，2.是药物发现的基础；3.b.蛋白质和活性分子之间的功能互译和注释。生物靶标结构药物内源性配基P1P14P13P12P11P10P9P8P7P6P5P4P3P2P15P27P26P25P24P

6、23P22P21P20P19P18P17P161261210391314212425284.天然产物深入研究作用模式作用模式构效关系构效关系合成改造合成改造先导成药先导成药国内外研究现状 来鲁华等，建立了人类疾病相关蛋白质结构数据库；来鲁华等，建立了人类疾病相关蛋白质结构数据库；陈宇综等建立了药物靶点数据库陈宇综等建立了药物靶点数据库 TTD TTD、药物副作用靶、药物副作用靶点数据点数据DARTDART、药物、药物 ADME ADME相关蛋白数据库等数据库，并相关蛋白数据库等数据库，并且开发了且开发了INVDOCK INVDOCK 应用软件用于靶标搜寻应用软件用于靶标搜寻 ；徐筱杰等初步研制

7、了一个用于中药复方研究的基于分徐筱杰等初步研制了一个用于中药复方研究的基于分子间相互作用的计算机系统子间相互作用的计算机系统北大九源药物分子设计系北大九源药物分子设计系统统(PU JYDDS)(PU JYDDS)；蒋华良建立了一个可以提供网上服务的预测工具蒋华良建立了一个可以提供网上服务的预测工具TarFisDockTarFisDock与与PDTDPDTD库（库（potential drug target databasepotential drug target database），预测），预测小分子化合物可能作用靶标。小分子化合物可能作用靶标。Didier Rognan Didier Ro

8、gnan等建立了等建立了sc-PDBsc-PDB库，并改编库，并改编GOLDGOLD分子对分子对接程序。接程序。蒋华良课题组利用反向对接的方法发现去甲酰酶是抗幽蒋华良课题组利用反向对接的方法发现去甲酰酶是抗幽门杆菌药物的作用靶标之一；门杆菌药物的作用靶标之一；William M.Rockey William M.Rockey等用计算方法快速寻找到蛋白激酶抑等用计算方法快速寻找到蛋白激酶抑制剂的作用靶标；制剂的作用靶标；Nicodeme Paul Nicodeme Paul等利用虚拟筛选等利用虚拟筛选PDBPDB库的方法，成功找库的方法，成功找到四个特异性结合配体的受体。到四个特异性结合配体的受

9、体。研究对象本课题研究所用的异臭椿萜类化合物均为从中国南海海域的海绵中提取分离所得。异臭椿异臭椿萜类萜类化合物化合物化合物二化合物二维结维结构的构建构的构建化合物三化合物三维结维结构的构建构的构建PASS软软件件Dock 4.0软软件件靶靶标标三三维结维结构及其构及其活性位点数据活性位点数据库库基于小分子化合物结构基于小分子化合物结构的生物活性预测的生物活性预测基于分子对接的基于分子对接的反向虚拟筛选反向虚拟筛选预测预测准确性准确性验证验证选选取准确性大于取准确性大于0.7的部分作的部分作为为化合物可能具有的生物活性化合物可能具有的生物活性能量打分能量打分评评价价选选取能量打分低于取能量打分低

10、于-25kalmol-1且在此范且在此范围围内出内出现过现过两次或以上的靶两次或以上的靶标标作作为为化合物化合物的候的候选选靶靶标标酶酶水平的生物水平的生物活性活性验证验证确定的靶确定的靶标标Autodock 3.05软软件件异臭椿异臭椿萜类萜类与其确定靶与其确定靶标标的的结结合模式分析合模式分析结结果相互果相互验证验证并并猜测靶标猜测靶标可能的生物功能可能的生物功能化合物化合物SAR训练训练集数据集数据库库计算流程图详细计算过程和计算方法1.1.基于小分子化合物结构的生物活性预测基于小分子化合物结构的生物活性预测 MNA/1MNA/2HCC(C(CC-H-H)C(CN-H-H)-H(C)-H

11、(C)CHHHCC(C(CC-H-H)N(CCC)-H(C)-H(C)CHHCCC(C(CC-H)C(CC-H)-H(C)CHHCNC(C(CCN-H)C(CC-H)C(CC-H-H)-C(C-H-H-C)CHHCOC(C(CC-H)N(CCC)-C(C-O-O)化合物化合物SAR训训练集数据库练集数据库打分及准确性评价打分及准确性评价分解为分解为描述符描述符45 Substructure descriptors;1 new.Pa Pi for Activity:0.954 0.005 Myocardial ischemia treatment 0.844 0.007 Antineoplast

12、ic 0.740 0.012 Carminative 0.731 0.016 Apoptosis agonist 0.734 0.030 Cholesterol synthesis inhibitor 0.756 0.063 Phosphatase inhibitor 0.707 0.043 Cardiovascular analeptic 0.656 0.034 Nerve growth factor agonist 0.643 0.027 Neurotrophic factor enhancer 0.634 0.032 CYP2B5 substrate 0.638 0.044 GABA A

13、 receptor antagonist 0.603 0.020 Dermatologic 0.573 0.015 Antiviral(Influenza)活性预测结果活性预测结果2 2基于分子对接的反向虚拟筛选基于分子对接的反向虚拟筛选 （基于蛋白质三维结构的靶标搜寻）（基于蛋白质三维结构的靶标搜寻）活性化合物活性化合物+受体结构数据库受体结构数据库柔性搜索柔性搜索打分评价打分评价备选靶标备选靶标反向对接方法简介蛋白质结构蛋白质结构数据库数据库蛋白质蛋白质 1 1蛋白质蛋白质 2 2蛋白质蛋白质 3 3蛋白质蛋白质 4 4蛋白质蛋白质 5 5 小分子化合物小分子化合物计算结合能量计算结合能量

14、能量能量 1 1能量能量 2 2能量能量 3 3能量能量 4 4能量能量 5 5 排名排名低低-高高能量能量 3 3能量能量 1 1能量能量 4 4能量能量 2 2能量能量 5 5 蛋白质蛋白质 3 3蛋白质蛋白质 1 1蛋白质蛋白质 4 4蛋白质蛋白质 2 2蛋白质蛋白质 5 5 对对 接接筛选所得靶标传统的基于分子对接的虚拟筛选方法与传统虚拟筛选方法的比较传统方法已知一个蛋白靶标结构，已知一个蛋白靶标结构，从化合物数据库中搜寻出从化合物数据库中搜寻出可能与之结合的配体可能与之结合的配体化合物数据库化合物数据库化合物化合物1 1 化合物化合物n n蛋白靶标蛋白靶标与蛋白靶标对接结与蛋白靶标对

15、接结果较好的化合物果较好的化合物新方法Science 1992;257:1078已知一个化合物结构，从已知一个化合物结构，从蛋白靶标数据库中搜寻出蛋白靶标数据库中搜寻出可能与之结合的受体可能与之结合的受体蛋白靶标数据库蛋白靶标数据库蛋白质蛋白质1 1 蛋白质蛋白质n n化合物化合物与化合物对接结与化合物对接结果较好的蛋白质果较好的蛋白质Proteins 2001;43:217传统方法新方法分子对接工具DOCK的工作原理基于分子力场的打分函数基于分子力场的打分函数范德华作用静电作用基于化学性质匹配的打分函数基于化学性质匹配的打分函数基于几何形状匹配的打分函数基于几何形状匹配的打分函数DOCKDO

16、CK的匹配算法的匹配算法DOCKDOCK的主要打分方法的主要打分方法靶标结构数据库 我们选用的是北京大学来鲁华课题组开发的人类疾病相关的蛋白结构数据库(Human Diseases Related Protein Database,HDRPD)作为异臭椿同类化合物的靶标数据库筛选对象,来实现反向虚拟筛选策略。人类疾病相关蛋白质结构数据库人类疾病相关蛋白质结构数据库 收录蛋白2266套，其中药物靶点600多套，和疾病过程相关的蛋白 1700套；与二十大类疾病相关；3 3细胞水平的抗肿瘤活性测定细胞水平的抗肿瘤活性测定1)1)四氮唑盐还原法四氮唑盐还原法(MTT)(MTT)肿瘤细胞株：HL-60人

17、白血病细胞作用时间：72小时2)2)磺酰罗丹明蛋白染色法磺酰罗丹明蛋白染色法(sulforhodamine B,SRB)(sulforhodamine B,SRB)肿瘤细胞株：A-549人肺癌细胞 Bel-7402人肝癌细胞 Hela人宫颈癌细胞作用时间：72小时4 4酶抑制试验酶抑制试验 由于实验条件及化合物样品量的限制，仅测定了四个异臭椿萜类化合物对部分靶标酶抑制活性。所有蛋白激酶的活性均通过测定转移到激酶底物上的-33P-ATP的33P放射活度来检测，以所测放射性计数率来反映激酶活性。5 5结合模式分析结合模式分析+关键氨基关键氨基酸残基酸残基重要活性基重要活性基团或片断团或片断实验结果

18、与讨论 在结果中，若Pa0.7则表示此化合物极有可能具有此生物活性，但其与已知的药物制剂为同类化合物的可能性也较大；若0.5Pa0.7，则表示此化合物可能具有此生物活性，但可能性相对较小，而且此化合与已知药物制剂不相像；若Pa0.7部分的结果进行进一步分析。结果：结果：aAntineoplastic 所有化合物bMyocardial ischemia treatment含有内酯环的化合物1.1.基于小分子化合物结构的生物活性预测基于小分子化合物结构的生物活性预测 0.988 0.002Myocardialischemia treatment0.7140.064Myocardialischemi

19、a treatment推测：与心肌缺血治疗作用相关的关键官能团是：心肌缺血治疗作用用以下结构搜索用以下结构搜索MDLMDL数据库：数据库：得到结果：得到结果：抗心绞痛抗心绞痛Targetsofmyocardialischemiatreatment:AdenosineA3receptor腺苷受体腺苷受体A3Peripheral-typebenzodiazepinereceptor边缘型苯二氮卓类受体边缘型苯二氮卓类受体Placentagrowthfactor胎盘生长因子胎盘生长因子Plateletactivatingfactor血小板活化因子血小板活化因子STAT-1transcriptionf

20、actorSTAT-1转录因子转录因子Sodium/hydrogenexchanger1钠钠/氢交换器氢交换器1Sorbitoldehydrogenase山梨醇脱氢酶山梨醇脱氢酶PDBID：1FZV，1RV6PDBID：1F9QPDBID：1BF5PDBID：1K2W，1PL6，1PL7，1PL8，1E3J2 2基于分子对接的反向虚拟筛选基于分子对接的反向虚拟筛选 （基于蛋白质三维结构的靶标搜寻）（基于蛋白质三维结构的靶标搜寻）反向虚拟筛选后，我们选用能够反映小分子化合物与靶标结合能力的能量打分进行排名，能量越低，证明结合能力越强，排名越靠前。我们选用的DOCK 4.0程序在进行分子对接时只考

21、虑小分子化合物的柔性，而将靶标作为不动的刚性结构，因此鉴于在小分子与靶标结合过程中还存在一诱导契合效应，我们设定-25 kcal/mol为能量界限，首先保留能量打分低于此界限的靶标作为初步结果。但初步的结果数量多而且较为混乱，每个化合物的预测结果中含有超过一百个的靶标，它们之中有些功能已明确，与多种疾病相关，有些功能至今还是未知的。另外，在分子对接过程中会存在假阳性的情况，为尽量降低假阳性情况的发生概率，我们从初步结果中再选出结果中出现频率在两次以上的靶标作为最终结果。CompoundsPutative protein target7beta-Glucosidase7Carbonic Anhy

22、drase,type IV,II3Serine Proteinase alpha-thrombin3Dihydrofolate Reductase3Neuraminidase8beta-Glucosidase8Fab Fragment Of Monoclonal Antibody Db38Human Neutrophil Collagenase8Tyrosine-protein Kinase Transforming Protein SRC12Insulin Receptor12Peroxidase12Atrial Natriuretic Peptide Receptor A3,7 Aldeh

23、yde Reductase7,8Human Fibroblast Collagenase7,12Memapsin 2(Beta-Secretase)3,8D-Xylose Isomerase3,8Alcohol Dehydrogenase3,12HIV Protease3,12Thymidylate Synthase8,12Nitric Oxide Synthase8,12Thiamin Pyrophosphokinase3,7,8,12Penicillopepsin3,7,8,12Epidermal Growth Factor Receptor3,7,8,12Casein Kinase II

24、(Protein Kinase Ck2)3,7,8,12Vascular endothelial growth factor receptor 23,7,8,12Endothiapepsin3,7,8,12Thermolysin3,7,8,12Focal Adhesion Kinase 13,7,8,12Insulin-like growth factor I receptor3 3细胞水平的抗肿瘤活性测定细胞水平的抗肿瘤活性测定 结果显示异臭椿萜类化合物可以抑制这四种肿瘤细胞的生长存活。IC50范围为10-7-10-4mol/L。4 4酶抑制试验酶抑制试验0.610.951.53.21.71

25、20.410.680.723.32.080.420.721.22.61.572.42.64.39.84.63SRCIGF-1RVEGFR-2FAKEGFRIC505 5结合模式分析结合模式分析a.EGFR由于EGFR在多种类型的实体瘤中呈高表达，并与对治疗的低反应率、疾病进展和低生存率相关，EGFR抑制是一种合理的抗肿瘤策略。其作用机制包括抑制配体结合和细胞内信号转导。多种抗EGFR药物的实验研究显示从多途径抑制EGFR信号转导是可行的，而且对EGFR的抑制使癌细胞增殖、血管生成和转移减少。PDB ID：1XKKb.FAKPDB ID：2ETMFAK在肿瘤向恶性侵袭表型演进的过程中起着重要的作

26、用，其与肿瘤侵袭转移的高度相关性已在一些研究中得到证实，因此以FAK为线索探讨信号转导通路阻断与肝癌侵袭转移间的关系将为进一步阐明肝癌侵袭转移的分子机制，探索提高肝癌防治效果的方法及途径提供有价值的理论指导。c.VEGFR-2PDB ID：1Y6B血管内皮生长因子对血管生长具有强诱导作用，是目前所知唯一特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，并直接参与诱导肿瘤血管生成。VEGF及其受体的过度表达与肿瘤生长、侵袭及转移关系密切。以VEGF及其受体作为相对特异性肿瘤血管生成标志物，抑制其表达或阻断其效应是目前国外抗血管生成治疗肿瘤的热点，将为肿瘤的临床治疗探索一条新途径。由于VEGFR-2参与血管生成

27、的多个进程，包括血管的渗透，内皮细胞的增殖、迁移和存活等，引起科学家们浓厚的兴趣。VEGFR-2已成为小分子激酶抑制剂的重要靶点。d.IGF1-RPDB ID：2OJ9IGF-R调控的信号是许多肿瘤维持生长、存活和产生所必需的。IGF-Rs首先激活多种肿瘤相关的MAPK和P13-K/Akt途径。IGF-Rs通过其受体酪氨酸激酶激活这些途径，可促进细胞的增殖、存活、血管生成和扩散。因此我们想到，抑制了IGF1-R则可能减少人类肿瘤细胞的增殖、存活、血管生成和扩散转移。选择性IGF1-R激酶抑制剂在临床前研究中已经显示出其前景趋势，并且可能促进在临床中进行研究。e.SRCPDB ID：1NZL19

28、10年PeytonRous在鸡中发现Rous肉瘤逆转录病毒(Roussarcomavirus，RSV)具有致癌性。以后的实验又发现诱导细胞转化的是由RSV基因组中的病毒癌基因v-src编码的蛋白。原癌基因c-src存在于细胞中，与v-src 基因同源。c-src基因是人或动物细胞中固有的正常基因，在调控细胞的生长、发育、分化和其他生物学功能方面具有重要的作用。另一方面，其蛋白产物在多种肿瘤细胞中高度活化和/或过量表达，且由癌细胞分离出来的c-src基因具有较强的转化细胞的能力。因此，v-Src蛋白和c-Src蛋白受到广泛关注，并在结构、调控、胞内定位和功能等方面得到了不断的深入研究小结 总而言

29、之，四个化合物均深埋于这些激酶的结合口袋中，大多数可以与激酶形成氢键。所有化合物以相似的结合模式与激酶相互作用，但由于C13/C14间双键的构象不同，相同构象的化合物在激酶口袋中采取相同的延伸方向。我们还可以发现，研究的所有蛋白质都为激酶，它们活性口袋的形状都是正适合于我们所研究化合物的狭长的孔道。由于我们的化合物仅含有少量的极性基团，疏水接触在于激酶的相互作用中起关键作用。创新点异臭椿萜类化合物是从中国南海海绵中提取出来的，是海洋天然产物。众所周知，海洋天然产物具有新颖的化学结构和特殊的生物活性，成为近年来寻找新的先导化合物的重要资源。但是其作用机制不明确，作用靶标不清，严重限制了它的发展。

30、本课题采用一种较新的反向虚拟筛选方法，不但找出并确定了异臭椿萜类化合物的五个作用靶标，而且验证了此方法可以应用于海洋天然产物的靶标预测。选用两种不同的方法，分别基于小分子化合物的二维结构和靶标的三维结构，两种方法相互参照，相互验证，提高了准确性。采用计算机辅助的方法，缩小范围，目标确定，省时省力，资源耗费小，浪费少。反向虚拟筛选方法与通常所用的虚拟筛选方法不同，方法的提出较新颖。采用分子对接方法进一步研究异臭椿萜类化合物与确定靶标的相互作用模式，指出可能的关键氨基酸残基和活性片段或基团，为该类化合物的进一步研究和修饰改造，使之成为先导化合物甚至成药，提供理论参考和依据。实验工作中所面临的问题及

31、拟解决措施实验工作中所面临的问题及拟解决措施天然产物的靶标预测，目前还没有成熟的方法，这方面也是本课题的难点。我们采用从化合物及靶标结构共同出发，多种方法多方面考虑。实验结果证明此方法可行且具有一定的准确性。1.1.靶标预测的方法靶标预测的方法2.2.对接过程中的假阳性情况对接过程中的假阳性情况由于结果可能存在假阳性情况，所以我们在建立靶标结构数据库时尽量多的选取蛋白质结构；同一种属的同种蛋白质尽量选取不同条件、不同状态、与不同底物和小分子化合物结合的多种构象，以考虑蛋白质的柔性；即使是同一种蛋白质，也尽量收录多个种属的。3.3.药理实验的验证药理实验的验证由于本课题寻找靶标仅是采用计算机辅助

32、方法进行的虚拟筛选，需得药理实验进一步证明，但是由于实验条件与样品量的限制，仅进行了部分的生物活性测定，但这部分结果，证据充足，已能够达到我们的实验目的。总结 为了解决海洋天然产物靶标通常不明确，对其进一步发展成药造成严重障碍的问题，我们探讨了两种生物活性和靶标预测的方法。首先，基于小分子化合物的二维结构，采用PASS程序，我们对从海绵中提取出来的异臭椿萜类化合物进行了生物活性的预测，虽然预测的心肌缺血治疗作用还需进一步证实，但从文献和我们的试验可以证实预测的抗肿瘤活性确实可信。之后我们进一步采用基于分子对接的反向虚拟筛选方法，以人类疾病相关的蛋白结构数据库为基础，识别出其中四个异臭椿萜类可能

33、的作用靶标，并用酶活性试验验证了此四个化合物确实可以抑制其中的表皮生长因子受体（EGF-R），焦点（局部）粘着斑激酶（FAK），胰岛素样生长因子1受体（IGF1-R），SRC激酶（SRC）和血管内皮生长因子受体2（VEGF-R2）的酶活性，而且进一步推测了它们的结合模式。本文不仅证明了以上两种方法应用于海洋天然产物的靶标预测具有一定的可行性和准确性，更为异臭椿萜类的进一步研究提供了重要信息和理论基础。第二部分微管蛋白抑制剂的抗肿瘤活性的微管蛋白抑制剂的抗肿瘤活性的定量构效关系研究定量构效关系研究微管概述课题的意义和背景 微管是细胞骨架的重要组成部分，在有丝分裂中有重要作用，使之成为抗癌药物的有

34、力靶点。各种微管靶点药物在肿瘤临床治疗中的成功应用，说明微管是抗癌药物的有效靶点。随着对其作用机制的不断了解，微管靶点药物的联合用药、减少神经毒性以及克服不断增加的耐药性等问题成为研究热点。1 1微管的结构微管的结构 微管是细胞质中由微管蛋白组装的一种细长而具有一定刚性的圆柱管状结构，在细胞内多呈网状或束状分布，相对分子质量约为110 000。微管长度以微米计算，内径约15nm，外径约24-26nm，壁厚约5nm，广泛存在于各种真核细胞中，且在各种细胞中的形态和结构基本相同。在几种螺旋体菌中亦发现有微管。构成微管的主要成分为微管蛋白，约占微管蛋白含量的80%-95%。微管家族的重要成员是和型微

35、管蛋白，相对分子质量均为55 000，分别含有450和445个氨基酸残基，序列上它们具有42%的同源性。异二聚体是构成微管的基本单位，异二聚体首尾相连形成原丝，1214根原丝平行连接而形成微管。i韩贻仁.分子细胞生物学(第二版)M.北京:科学出版社,2001.244-245.2 2微管的功能微管的功能p构成细胞支架，支持和维持细胞的形态p维持胞膜内膜性细胞器的空间分布及其迁移p参与物质的运输和细胞器的转运色素颗粒的运输神经轴突运输细胞器的转运参与细胞内信号转导参与染色体的运动、调节细胞分裂3 3微管蛋白抑制剂的治疗作用微管蛋白抑制剂的治疗作用神经疾病，如阿尔茨海默氏症。神经疾病，如阿尔茨海默氏

36、症。眼科疾病，如青光眼。眼科疾病，如青光眼。肿瘤肿瘤4 4微管蛋白抑制剂的分类微管蛋白抑制剂的分类按照作用位点紫杉烷结合位点紫杉烷结合位点秋水仙碱结合位点秋水仙碱结合位点长春碱结合位点长春碱结合位点促进微管聚合促进微管聚合 抑制微管解聚抑制微管解聚 抑制微管聚合抑制微管聚合按照功能脉管靶向剂脉管靶向剂考布他汀是从南非的一种灌木中分离出来的一系列活性组分，结构简单，具有很高活性而且能抑制微管聚合和细胞有丝分裂，CA-4是针对肿瘤血管而发展的新一代抗癌药，它的活性已经显示出它具有很好的发展潜力。为了提高此类化合物的活性和降低毒副作用，研究者们以它作为母体结构进行修饰，产生了很多的衍生物.但由于此类

37、抑制剂作用于微管蛋白的具体机制还不是很明确，其改造和修饰还缺乏充足的依据。本课题建立了定量构效关系模型，并与考虑到受体结合位点情况的分子对接结果相互解释、相互验证,为进一步的Combretastatins衍生物的结构优化和改造提供了一定的理论依据。课题的研究意义研究对象Compd.BRingXEorZRR2Compd.BRingXEorZRR2CA-4A-ZH-1BSZHH2BSEHH3BOZHH4BOEHH5BSZH2-CH36*BSEH2-CH37BOZH2-CH38BOEH2-CH39BSZH2-phenyl10BSEH2-phenyl11BSZCH3H12BSECH3H13*BOZCH

38、3H14BOECH3H15*CSZ-16CSE-17COZ-18*COE-19D-ZH-20D-EH-21D-ZCH3-22D-ECH3-23E-Z-24E-E-25F-Z-26F-E-构效关系（structureactivity relationships，SAR）,一直是药物化学和药理学研究的一个中心问题，也是药物设计学的基础。它的分析目的是采用数理统计方法研究和揭示化合物活性与其分子结构或物理化学特征之间的定量变化规律。它可以在不明确化合物作用靶标时给出什么特征对其生物活性有贡献，分析其重要官能团，为其进一步的改造修饰提供理论依据，也为天然产物的靶标预测提供参考。详细计算过程和计算方法1

39、.1.遗传函数分析方法的二维定量构效关系遗传函数分析方法的二维定量构效关系研究研究 GFA是从Holland的遗传算法和Freedman的多元适应回归样条算法（Multivariate Adaptive Regression Splines，MARS）派生出来的。GFA方法采用了LOF（Lack OF Fit，拟合缺乏）可抵制过度拟合，允许用户控制拟合的光滑度，允许一大批基函数用于构造模型。在建立QSAR模型过程中，采用LOF作为判别所建立方程优劣的标准。这样对样本数较少的训练集仍可生成拟合性能好、预测能力强的方程。GFA法二维定量构效关系研究的分子叠合及分析是在Cerius2 4.10版商业

40、软件包的Drug Discovery和QSAR模块中进行的。以CA-4为模板进行Flexible Align（柔性叠合）。叠合母核叠合母核 在Cerius2的QSAR模块中，选取默认的13个描述符，包括电性、空间、结构和热力学等四大类。采用默认设置计算各个化合物的这些描述符，并采用GFA方法分析抑制剂的活性与各类物理化学描述符之间的定量线性关系。描述符名称描述符名称类类型型含含义义1Charge电电性性总电总电荷数荷数2Apol电电性性分子极化率分子极化率3Dipole-mag电电性性偶极距偶极距4RadOfGyration空空间间分子旋分子旋转转半径半径5Area空空间间分子表面分子表面积积

41、6Vm空空间间分子体分子体积积7Density空空间间分子密度分子密度8PMI-mag空空间间主主惯惯性矩性矩9MW结结构构分子量分子量10Rotbonds结结构构可旋可旋转键转键数目数目11Hbond acceptor结结构构氢键氢键受体数目受体数目12Hbond donor结结构构氢键氢键供体数目供体数目13AlogP热热力学力学脂水分配系数脂水分配系数2 2 CoMFA CoMFA和和CoMSIACoMSIA分析方法的分析方法的 三维定量构效关系三维定量构效关系研究研究 要求所研究的化合物具有相同的母核结构，具体要求所研究的化合物具有相同的母核结构，具体操作包括：操作包括：（a a）活性

42、构象确定活性构象确定 （b b）分子叠合分子叠合 （c c）CoMFA CoMFA和和CoMSIACoMSIA分析分析三个重要步骤，不但可以建立化合物三维结构及各属三个重要步骤，不但可以建立化合物三维结构及各属性参数与生物活性之间的关系，还可以预测含有同类性参数与生物活性之间的关系，还可以预测含有同类母核其他化合物的生物活性。母核其他化合物的生物活性。这里我们以这里我们以CA-4CA-4为模板。为模板。a.活性构象秋水仙碱秋水仙碱CA-4b.分子叠合叠合母核叠合母核c.CoMFA模型的建立考察：u静电场-立体场能最适宜的阈值组合设置了3组组合方式：83.68 kJ/mol-83.68 kJ/m

43、ol，104.60 kJ/mol-104.60 kJ/mol，125.52 kJ/mol-125.52 kJ/mol。u最小过滤值设置分别为2.092、4.184、6.276和8.368 kJ/mol。d.CoMSIA模型的建立考察：u静电场、立体场、疏水场、氢键受体场和氢键供体场的最佳场组合设置了5组组合方式：S-E、S-E-H、S-E-H-D、S-E-H-A和S-E-H-D-Au衰减因子（0.20.4）u最小过滤值设置分别为2.092、4.184、6.276和8.368 kJ/mol。3 3 结合模式研究结合模式研究对接采用计算最为准确的Lamarckian遗传算法（LGA），每个化合物产

44、生100个对接构象，其余计算参数采用程序默认值。根据每个构象的结合方式和结合能量选择合适的构象进行研究。实验结果与讨论1.1.遗传函数分析方法的二维定量构效关系遗传函数分析方法的二维定量构效关系研究研究Activity=3.8053+0.99175Hbond donor+0.002421（13422.6-Apol）+0.003699 （1326.93-PMI-mag）Activity=3.80096+0.003721-(1326.93-PMI-mag)+1.00586Hbond donor+0.00259 (13374.4-Apol)Activity=3.7794+0.861847Hbond

45、donor+0.000958(14181.7-Apol)+0.003661 (1326.93-PMI-mag)Activity=3.78318+0.003774(1326.93-PMI-mag)+0.667744(Dipole-mag-3.86132)+0.003478(1342.26-Apol)Activity=3.76654+3.32606(4.34874-RadOfGyration)+0.696031(Dipole-mag -3.86132)+0.004052(13374.4-Apol)Hbond donor 氢键供体Apol 分子极化率Dipole-mag 分子偶极距PMI-mag 主

46、惯性矩RadOfGyration 分子旋转半径结构参数电性参数空间参数2 2 CoMFA CoMFA和和CoMSIACoMSIA分析方法的分析方法的 三维定量构效关系三维定量构效关系研究研究偏最小二乘分析法中一般认为：交叉验证的q2 0.5时,所得的模型具有可信的预报能力；非交叉验证的R2 0.9时,表明模型具有很好的自身一致性.a.CoMFA模型得到交叉验证相关系数q2=0.630,最佳组分数为4,由最佳组分数建立的CoMFA模型的常规相关系数R2=0.975,F=175.937,标准方差SEE=0.244,立体场和静电场的贡献值分别为0.576和0.424.立体场：绿色大体积基团有利于提高

47、化合物的活性黄色大体积基团不利于提高化合物的活性静电场：红色引入带负电荷的基团有利于提高化合物的活性蓝色引入带正电荷的基团有利于提高化合物的活性b.CoMSIA模型研究发现S-E-H-D-A的组合所得结果最佳.衰减因子对所得模型影响很大,最小滤值的设定对模型也有一定影响,当衰减因子为0.3、最小滤值为4.184kJ/mol时,所得模型较好.其统计学参数如下：交叉验证相关系数q2=0.634,最佳组分数为3,由最佳组分数建立的CoMSIA模型的常规相关系数R2=0.932,F=87.089,标准方差SEE=0.391,各种场的贡献值分别为S=0.117、E=0.192、H=0.143、D=0.3

48、43、A=0.205.疏水场：黄色在该区域引入疏水基团有利于提高化合物的活性氢键供体场：蓝色引入氢键供体有利于提高化合物的活性氢键受体场：紫色引入氢键受体有利于提高化合物的活性红色引入氢键受体不利于提高化合物的活性3 3 结合模式研究结合模式研究4 4 综合分析综合分析Thr179Lys1352创新点 采用多种定量构效关系分析方，不但采用GFA法得到了抑制剂化合物活性与一些描述符的定量关系,建立了定量构效关系的方程,而且采用CoMFA和CoMSIA法建立了直观的三维定量构效关系模型,清楚地反映出B环各因素对其抗肿瘤活性的影响。进一步研究了此类化合物与其靶标的结合模式，引入考虑受体活性区域三维特

49、点，对模型进行了评价和验证。构效关系所得模型可以与分子对接所得的结果相互解释、相互验证,为进一步的Combretastatins衍生物的结构优化和改造提供了一定的理论依据。总结 血管靶向剂已经成为抗肿瘤药物研究的一个新方向。微管系统在脉管细胞的有丝分裂过程中担当重要的角色。作用于微管蛋白的Combretastatin类化合物CA-4对肿瘤细胞的抑制活性很好，是第一个正在开发的破坏肿瘤脉管系统的抗癌药，因此针对CA-4的结构进行改造修饰成为目前研究的热点之一。本文以Combretastatins的B环改造化合物为研究对象,首先采用遗传函数分析方法进行了二维定量构效关系研究,结果表明Apol、PM

50、I-mag、Dipole-mag、Hbond donor、RadOfGyration等描述符对该系列抑制剂活性的贡献最大.采用比较分子场分析方法（CoMFA）和比较分子相似因子分析方法（CoMSIA）进行了三维定量构效关系研究,建立的CoMFA和CoMSIA模型的交叉验证相关系数q2分别为0.630和0.634,具有较强的预测能力.利用CoMFA和CoMSIA模型的三维等势图解析了Combretastatins类化合物的构效关系,阐明了B环上各取代基对抑制微管蛋白聚合活性的影响,同时应用分子对接方法分析并验证了定量构效关系模型.研究结果为进一步设计合成微管蛋白抑制剂和结构优化提供了理论依据.自