微生物研究进展chapter5分子生态学方法在环境微生物研究领域的应用教学文案.ppt
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1、第五章第五章 分子生态学方法在环境分子生态学方法在环境(hunjng)(hunjng)微生物研究领域的应用微生物研究领域的应用农农学学系生物系生物(sh(sh ngw)ngw)技技术专业课术专业课程微生物程微生物(sh(sh ngw)ngw)学研学研究究进进展展第一页,共38页。一、微生物分子生态学的理论一、微生物分子生态学的理论(lln)二、微生物分子生态学的研究方法二、微生物分子生态学的研究方法三、展望三、展望第二页,共38页。墨西哥湾墨西哥湾“深海地平线深海地平线”钻油台钻油台2010年年4月月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油石
2、油(shyu)公司近日宣布又发现一处泄漏点,令漏油量多达每日公司近日宣布又发现一处泄漏点,令漏油量多达每日5000桶,是原先估计的桶,是原先估计的5倍,倍,并正逼近美南部并正逼近美南部4个州的海岸。个州的海岸。第三页,共38页。第四页,共38页。1、传统培养、传统培养(piyng)法的瓶颈法的瓶颈 微生物多样性被用于监视和预测环境变化微生物多样性被用于监视和预测环境变化,也是也是新基因资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经新基因资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经帮助人们认识了很多微生物,创造了巨大的财富,帮助人们认识了很多微生物,创造了巨大的财富,但是由于但是由于 什么原因?什么原因?各种
3、环境中能纯培养的微生物种类非常有限,各种环境中能纯培养的微生物种类非常有限,远远不能反映出自然界微生物多样性的丰度远远不能反映出自然界微生物多样性的丰度(fn(fn d)d)和范围。和范围。一、微生物分子一、微生物分子(fnz)生态学的理论生态学的理论第五页,共38页。2、微生物分子、微生物分子(fnz)生态学的产生生态学的产生 为了突破传统纯培养方法(fngf)的限制,必须要有一种能绕过纯培养这一步的新技术,来推动微生物多样性的研究。第六页,共38页。微生物分子生态学的产生使得微生物群落的研究微生物分子生态学的产生使得微生物群落的研究由细胞水平深入到分子机制由细胞水平深入到分子机制(jzh)
4、(jzh)研究水平研究水平,提提出了微生物分子进化和分子适应等全新概念出了微生物分子进化和分子适应等全新概念,使使微生物生态学理论更加接近自然本质。微生物生态学理论更加接近自然本质。第七页,共38页。3、微生物分子、微生物分子(fnz)生态学的概念生态学的概念 利用分子生物学技术手段研究自然界微生物与生物及利用分子生物学技术手段研究自然界微生物与生物及非生物环境之间相互关系及其相互作用规律的科学。非生物环境之间相互关系及其相互作用规律的科学。主要研究微生物区系组成、结构、功能、适应性发展主要研究微生物区系组成、结构、功能、适应性发展(fzhn)及其分子机制等微生物生态学基础理论问题。及其分子机
5、制等微生物生态学基础理论问题。第八页,共38页。墨西哥湾墨西哥湾“深海深海(shn hi)地平线地平线”钻油台钻油台2010年年4月月20日爆炸起火沉没后不断漏油。日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点,令漏油量多达每日钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点,令漏油量多达每日5000桶,桶,是原先估计的是原先估计的5倍,并正逼近美南部倍,并正逼近美南部4个州的海岸。个州的海岸。第九页,共38页。环境微环境微生物群生物群落落微生物代谢微生物代谢生理学方法生理学方法生物化学生物化学方法方法分子生物分子生物学方法学方法呼吸醌指纹法呼吸醌指纹法 脂肪酸指纹
6、法脂肪酸指纹法PLFABIOLOG法法杂交法杂交法基于基于16SrDNA方法方法宏基因组宏基因组核酸探针杂交核酸探针杂交荧光原位杂交荧光原位杂交FISH16S rDNA克隆文库克隆文库DGGE/TGGESSCPT-RFLP、ARDRA RFLP、RISARADP、ERIC等等基因芯片技术基因芯片技术二、微生物分子二、微生物分子(fnz)生态学的研究方法生态学的研究方法第十页,共38页。1、研究、研究(ynji)路线路线第十一页,共38页。分析分析方法方法方法方法类别类别原理原理优点优点缺点缺点分子分子杂交杂交核酸核酸探针探针杂交杂交DNADNA的变性、复性及其的变性、复性及其在复性过程中的碱基
7、在复性过程中的碱基配对原则、探针与配对原则、探针与靶分子的特异性结合靶分子的特异性结合过程简单过程简单避免避免PCRPCR偏差偏差影响杂交分析结果的影响杂交分析结果的因素复杂,因素复杂,只能用来只能用来检测事先已知其目标检测事先已知其目标基因序列的微生物基因序列的微生物FISHFISH人工合成的荧光或放射人工合成的荧光或放射性标记探针与微生性标记探针与微生物基因组杂交物基因组杂交操作简单,操作简单,可原位检测可原位检测,检测灵敏度高检测灵敏度高只能对特定类群的只能对特定类群的微生物进行研究微生物进行研究其它其它分子分子生物生物学学方法方法RFLPRFLP序列差异引起限制性内序列差异引起限制性内
8、切酶切酶 酶切位点酶切位点的差异的差异信息量大信息量大重复性高重复性高周期长,过程繁琐周期长,过程繁琐RAPDRAPD利用随意设计的利用随意设计的非特异引物非特异引物简单、迅速简单、迅速重复性低重复性低ERICERIC肠杆菌基因间重复共有肠杆菌基因间重复共有序列在不同种属或序列在不同种属或者同属的不同种微生物者同属的不同种微生物之间的拷贝数和定之间的拷贝数和定位的差异引起两个位的差异引起两个ERICERIC之间序列的多态性之间序列的多态性结果稳定结果稳定重复性好重复性好灵敏度高灵敏度高PCRPCR反应本身的扩增和反应本身的扩增和偏差可能会产生假偏差可能会产生假阳性,阳性,不能对群落中不能对群落
9、中感兴趣的菌进一步研究感兴趣的菌进一步研究第十二页,共38页。分析分析方法方法方法方法类别类别原理原理优点优点缺点缺点基于基于16S16SrDNArDNA的的方法方法16S16SrDNArDNA克隆克隆文库文库可以用来揭示可以用来揭示不同物种的不同物种的系统进化关系系统进化关系反映各种微反映各种微生物种类构成生物种类构成和亲缘关系和亲缘关系工作量大,成本高,不工作量大,成本高,不能对目标种群进行能对目标种群进行原位和实时的检测原位和实时的检测DGGEDGGE不同的不同的变性剂变性剂浓浓度,解链之后电泳速度度,解链之后电泳速度将会急剧下降将会急剧下降DNADNA片段纯化片段纯化后可以直接后可以直
10、接用于测序用于测序分辨率低,分辨率低,被分析的片被分析的片段不能大于段不能大于400bp400bpTGGETGGE温度梯度温度梯度,利用不同序,利用不同序列结构的列结构的DNADNA,双链,双链具有不同的熔点温度具有不同的熔点温度TmTm同上同上同上同上SSCPSSCP长度相同但长度相同但序列不同的序列不同的单链单链DNADNA具有空间构具有空间构象上的差异象上的差异操作比较简便操作比较简便价格低廉价格低廉灵敏度和重现度差,灵敏度和重现度差,150150400bp400bp最佳最佳的分离效果的分离效果ARDRAARDRA16S rDNA16S rDNA序列的差异,序列的差异,限制性核酸内切酶酶
11、切限制性核酸内切酶酶切后将得到长度与数量后将得到长度与数量不同的不同的DNADNA片段片段分辨率高分辨率高对图谱进行定量化解析对图谱进行定量化解析和进行群落和进行群落间的比较都十分困难间的比较都十分困难T-T-RFLPRFLPPCRPCR扩增中所用引物的一扩增中所用引物的一端或两端带有端或两端带有荧光荧光标记标记方便快捷方便快捷分辨率高分辨率高灵敏度高灵敏度高复杂群落多样性的低估、复杂群落多样性的低估、影响因素多、影响因素多、无法对微生物定性分析无法对微生物定性分析RISARISA核糖体区间序列多态性核糖体区间序列多态性操作简单、序操作简单、序列多态性丰富列多态性丰富核糖体的拷贝数的不同核糖体
12、的拷贝数的不同会产生假阳性会产生假阳性第十三页,共38页。2 2、荧光、荧光(ynggung)(ynggung)原位杂交(原位杂交(FISH FISH)利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针,并通利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针,并通过荧光直接标记或者过荧光直接标记或者(huzh)(huzh)荧光素偶联的抗原荧光素偶联的抗原-抗抗体检测系统,对体检测系统,对DNADNA或或RNARNA进行定性或定位分析。进行定性或定位分析。第十四页,共38页。2 2、基于、基于(jy)16S rDNA(jy)16S rDNA的指纹图谱法的指纹图谱法为什么选择为什么选择(xunz)16S rRNA(x
13、unz)16S rRNA基因作为微基因作为微生物进化的遗传标记生物进化的遗传标记?第十五页,共38页。方法方法(fngf):16S rDNA 16S rDNA克隆克隆(k ln)(k ln)文库文库 /ARDRA/ARDRA DGGE/TGGE DGGE/TGGE RFLP/T-RFLP RFLP/T-RFLP RISA RISA(ITSITS)SSCP SSCP第十六页,共38页。构建构建(u jin)16S rDNA克隆文库克隆文库环境样品环境样品 提基因组提基因组扩增混合基因扩增混合基因组组16SrDNA与载体连接,转与载体连接,转入感受态细胞入感受态细胞微生物群落微生物群落 结构信息结
14、构信息 挑取单克隆鉴定挑取单克隆鉴定是否为阳性克隆是否为阳性克隆酶切、酶切、PCR方法方法鉴定鉴定全部阳性克隆测序全部阳性克隆测序与数据库与数据库序列比对序列比对系统发系统发育分析育分析阳性克隆鉴定阳性克隆鉴定PCR扩增所有扩增所有16SrDNA片段片段两种或两种以上四碱两种或两种以上四碱基限制性内切酶酶切基限制性内切酶酶切内切酶图谱分型内切酶图谱分型每种类型挑选每种类型挑选1-31-3个个 克隆测序克隆测序 序列比对及分析序列比对及分析由于由于载体与载体与DNADNA片段一一对应片段一一对应,可得到单个可得到单个DNADNA片段重组质粒,片段重组质粒,转化时过程中绝大多数感受态转化时过程中绝
15、大多数感受态细胞只能接受一个外源细胞只能接受一个外源DNADNA分子,分子,由此便可达到把混合片段分开由此便可达到把混合片段分开的目的的目的ARDRA第十七页,共38页。优点优点得到的序列信息比较完整得到的序列信息比较完整片段携带的信息量大,结果可靠片段携带的信息量大,结果可靠 适合对环境中微生物群落的整体结构进行分析适合对环境中微生物群落的整体结构进行分析 缺点缺点工作量大工作量大不能对目标种群不能对目标种群(zhn qn)进行原位和实时进行原位和实时监测监测第十八页,共38页。Vinh D.Pham等人用等人用16S rDNA文库结合文库结合fosmid方法研究方法研究了阿拉斯加某中温油藏
16、采出水中细菌和古细菌的多样性,结了阿拉斯加某中温油藏采出水中细菌和古细菌的多样性,结果表明古细菌和细菌数量均等,未培养微生物约占检出总量果表明古细菌和细菌数量均等,未培养微生物约占检出总量的的30%左右,检测到的古细菌主要是乙酸型产甲烷古菌。左右,检测到的古细菌主要是乙酸型产甲烷古菌。佘跃惠等人也用佘跃惠等人也用16S rDNA文库结合文库结合TGGE方法研究了大港方法研究了大港孔店油田注水油藏微生物群落的多样性,结果表明注水井中孔店油田注水油藏微生物群落的多样性,结果表明注水井中的微生物多样性比采油井中丰富,注水井样品中的细菌主要的微生物多样性比采油井中丰富,注水井样品中的细菌主要属于变形菌
17、门和放线菌纲属于变形菌门和放线菌纲,尤其是红细菌亚纲尤其是红细菌亚纲(47%)。采油井。采油井样品的细菌主要属于变形菌门样品的细菌主要属于变形菌门,尤其是假单胞菌属尤其是假单胞菌属(62%)。通常采用通常采用(ciyng)构建构建16SrDNA文库方法与其它分子生物文库方法与其它分子生物学方法联合,对环境微生物群落结构进行分析。学方法联合,对环境微生物群落结构进行分析。第十九页,共38页。16S rDNA16S rDNA克隆克隆(k ln)(k ln)文库数据分析文库数据分析 根据不同的酶切图谱分型后,可以得到该环境样品中的微生物组成信息。同根据不同的酶切图谱分型后,可以得到该环境样品中的微生
18、物组成信息。同时,根据每一个时,根据每一个(y)OTU(y)OTU所含的克隆数目,也可以推测出该环境中的优势菌群。所含的克隆数目,也可以推测出该环境中的优势菌群。OTUsMatch_NameclonenumbertheratioofallclonesgenusOTU1Methanosaeta thermophila PT3427.42%甲烷鬃菌属甲烷鬃菌属OTU2Methanolinea tarda43.23%甲烷绳菌属甲烷绳菌属OTU3Unculturedarchaeon10.81%未培养古菌未培养古菌OTU4Unculturedarchaeon10.81%未培养古菌未培养古菌OTU5Unc
- 配套讲稿:
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