外源基因的表达及其优化策略教程文件.ppt

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1、外源基因的表达及其优化策略生命科学学院生命科学学院第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素基因表达：基因表达：从从DNA分子有序地将其所承载的遗传信息分子有序地将其所承载的遗传信息,通过密码子通过密码子和反密码子系统和反密码子系统,转变由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白转变由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。生命科学学院生命科学学院第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素 影响外源基因表达的因素主要有：影响外源基因表达的因素主要有：阅读框架阅读框架 顺式作用元件顺式作用元件 翻译过程翻译过

2、程 表达体系表达体系生命科学学院生命科学学院第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素 一、阅读框架对转化基因的影响一、阅读框架对转化基因的影响 什么是阅读框架什么是阅读框架(open reading frame,ORF)?二、顺式作用元件对基因表达的影响二、顺式作用元件对基因表达的影响 1.对基因转录起始的调控对基因转录起始的调控 1)启动子启动子 2)增强子增强子 3)沉默子沉默子生命科学学院生命科学学院第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素 二、顺式作用元件对基因表达的影响二、顺式作用元件对基因表达的影响 2.对基因转录终止的调控对基因转录终止的调控 1)

3、终止子终止子 2)衰减子衰减子 3.对对DNA结构的影响结构的影响 1)核基质结合区核基质结合区 2)绝缘子绝缘子 3)基因座控制区基因座控制区生命科学学院生命科学学院第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素 三、翻译过程对表达的影响三、翻译过程对表达的影响 1.翻译起始对基因表达的影响翻译起始对基因表达的影响 2.密码子偏爱性对基因表达的影响密码子偏爱性对基因表达的影响 3.翻译终止对基因表达的影响翻译终止对基因表达的影响 四、表达系统对表达产物的影响四、表达系统对表达产物的影响生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达用原核生

4、物作宿主。用原核生物作宿主。A dividingA dividing E.coli E.coli 原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动子 MCS SD序列序列 终止子终止子 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物细胞表达的特点一、原核生物细胞表达的特点 1.原核生物只有原核生物只有一种一种RNA聚合酶聚合酶识别原核细胞的启动识别原核细胞的启动子，催化所有子，催化所有RNA的合成。的合成。2.原核生物的表达是以原核生物的表达是以操纵子操纵子为单位的。操纵子是数为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的个相关

5、的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。协同单位。Z Z编码编码-半乳糖苷酶；半乳糖苷酶；Y Y编码编码-半乳糖苷透过酶；半乳糖苷透过酶；A A编码编码-半乳糖苷乙酰半乳糖苷乙酰基转移酶。基转移酶。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达乳糖操纵子乳糖操纵子(lac operon)的调控方式的调控方式生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物细胞表达的特点一、原核生物细胞表达的特点

6、3.3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续 进行的。进行的。每个核糖体可独立完成一条多肽链的合成，即这种多核糖每个核糖体可独立完成一条多肽链的合成，即这种多核糖体可以同时在一条体可以同时在一条mRNAmRNA链上合成多条肽链，大大提高了链上合成多条肽链，大大提高了翻译效率。翻译效率。4.4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成mRNAmRNA前体后，其中内含子部分不能被切除。前体后，其中内含子部分不能被切除。生

7、命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达转录和翻译偶联、连续进行转录和翻译偶联、连续进行生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物细胞表达的特点一、原核生物细胞表达的特点 5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物直接控制要慢。对对基因产物直接控制要慢。对RNA合成的控制有合成的控制有2种方式：种方式：一是起始控制一是起始控制(启动子控制启动子控制)，二是终止控制，二是终止控制(衰减子控制衰减子控制)。6.在大肠杆菌在大肠杆

8、菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同翻译起始密码子及同16S RNA 3末端碱基互补的序列，即末端碱基互补的序列，即SD序列序列。Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一个启始密码子含有一个启始密码子和一段同核糖体和一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。）序列。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达二、外源基因在原核细胞中表达具备条件二、外源基因在原核细胞中表达具备条件 1.1.通过表达载体将外源基

9、因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。成外源蛋白。2.2.外源基因不能带有间隔顺序外源基因不能带有间隔顺序(内含子内含子)，因而必须用，因而必须用cDNAcDNA或全化或全化学合成基因，而不能用基因组学合成基因，而不能用基因组DNADNA。3.3.必须利用原核细胞的强启动子和必须利用原核细胞的强启动子和SDSD序列等调控元件控制外源基序列等调控元件控制外源基因的表达。因的表达。4.4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(ORF)(ORF)。ORF(open r

10、eading frame)ORF(open reading frame)：起始于：起始于AUGAUG、止于、止于UAAUAA、UGAUGA、UAGUAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。的连续的密码子区域，是潜在的编码区。5.5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。表达产物对宿主菌的毒害。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 原核生物基因表达载体的组成特征原核生物基因表达载体的组成特征 启动子启动子 核糖体结合位点核糖体结合位点(SD序列序

11、列)终止子终止子 选择标记基因选择标记基因 复制子复制子 原核生物基因表达的受体系统原核生物基因表达的受体系统 大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统、大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统、链霉菌受体系统、链霉菌受体系统、蓝藻受体系统。蓝藻受体系统。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、三、原核生物基因表达的调控原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子 是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成合成的序列。的序列。（1）启动子序列）启动子序列 大大肠肠杆杆菌菌的的所所有有启启动动子子中中都都有有两两段段一一

12、致致顺顺序序（consensus sequence）。）。-35 Box 和和-10 Box 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达不同启动子的consensus sequences 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子（1）启动子序列）启动子序列 -35box：RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点。5-TTGACA-3 -10box（Pribnow Box）：）：5-TATAAT-3 TTGACATTGAC

13、A TATAAT TATAAT 转录起始位点转录起始位点 17bp17bp 5 5 核糖体结合位点核糖体结合位点 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达原核启动子共有序列的功能 三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子（1）启动子序列）启动子序列生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子 （2）翻译的起始位点）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（核糖体结合位点（ribosome binding site,RBS）Shin

14、e-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核上与核糖体糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。S-D序列距离序列距离AUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译 b)起始密码：起始密码：位于位于SD序列下游序列下游 AUG（91%）、）、GUG（8%）、）、UUG（1%）生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录多聚酶转录tRNA，rRNA和和mRNA。（1）结构）结构：全酶是一个：全酶是一个5聚体，

15、含有两个聚体，含有两个小亚基，和小亚基，和2两个大亚基（两个大亚基（和和），一个），一个亚基。亚基。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.3.转录终止子转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子启动子 操纵子操纵子 S-D序列序列 目的基因目的基因 终止子终止子 内终止子（内终止子（intrinsic terminator）：）：E.coli中促使转录终中促使转录终止的止的DNA位置有一段位置有一段反向回文顺序反向

16、回文顺序，其后紧接一串，其后紧接一串A，称，称为内终止子，形成终止信号。为内终止子，形成终止信号。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.3.转录终止子转录终止子 原理：原理：茎环结构茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与与DNA的互作的互作 多聚多聚A/U 由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有的

17、配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。利于转录物脱落而不利于转录延续。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.3.转录终止子转录终止子生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.转录终止子转录终止子生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 4.4.翻译终止密码翻译终止密

18、码 大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上。一般安置上全部的三个终止密全部的三个终止密码码防止核糖体跳跃（防止核糖体跳跃（skipping）。）。5.翻译增强子（翻译增强子（Translation enhancer）能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。的特殊序列。T7噬菌体基因噬菌体基因10前导序列（简称前导序列（简称g10-L序列）序列）;大肠杆菌大肠杆菌atpE基因基因mRNA5-UTR中富含中富含U的区段的区段生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、基因工程常用

19、的原核启动子四、基因工程常用的原核启动子 1.最佳启动子必须具备的条件最佳启动子必须具备的条件 必须是一种强启动子必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。以上。应呈现低水平的基础转录应呈现低水平的基础转录 便于表达毒性蛋白等。便于表达毒性蛋白等。应是可诱导型的应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂诱导。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 2.乳糖启动子乳糖启动子lac 来自大肠杆菌的乳糖操来自大肠杆菌的乳糖操纵子。纵子。用乳糖或其类似物用乳糖或其类

20、似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。合，解除抑制。四、基因工程常用的原核启动子四、基因工程常用的原核启动子P Placlac OO 目的基因目的基因 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、基因工程常用的原核启动子四、基因工程常用的原核启动子 2.乳糖启动子乳糖启动子lac阻遏物与操纵基因结合阻遏物与操纵基因结合 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、基因工程常用的原核启动子四、基因工程常用的原核启动子 2.乳糖启动子乳糖启动子lac四聚体的四聚体

21、的阻遏物阻遏物 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达阻遏物与DNA的结合四、基因工程常用的原核启动子四、基因工程常用的原核启动子 2.2.乳糖启动子乳糖启动子laclac生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、基因工程常用的原核启动子四、基因工程常用的原核启动子 3.色氨酸启动子色氨酸启动子trp 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。trpR P1 O trpE trpD P2 trpC trpB trpA trpR 阻遏蛋白基因；阻遏蛋白基因；P1 P2 启动子；启

22、动子；O 操纵基因；操纵基因；衰减子衰减子 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、基因工程常用的原核启动子四、基因工程常用的原核启动子 3.3.色氨酸启动子色氨酸启动子trptrp色氨酸操纵子 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。成色氨酸所需要的酶。（P1P1是主要启动子，是主要启动子，P2P2的作用只有的作用只有3%3%。）。）四、基因工程常用的原核启动子四、基因

23、工程常用的原核启动子 3.色氨酸启动子色氨酸启动子trp生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、基因工程常用的原核启动子四、基因工程常用的原核启动子 4.PL和和PR启动子启动子 是从是从 噬菌体中得到的一类启动子，比噬菌体中得到的一类启动子，比lac启动子的活启动子的活性高性高8-10倍，比倍，比trp启动子活性高。启动子活性高。cIII N PL/OL cI PM OR/PR Cro PE cII N:抗终止蛋白；抗终止蛋白；Cro:抗阻遏蛋白抗阻遏蛋白(裂解必需的）；裂解必需的）；cI,cII,cIII:阻遏蛋白；阻遏蛋白；P:启动子

24、；启动子；O:操纵子。操纵子。R:右；右；L:左左 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、基因工程常用的原核启动子四、基因工程常用的原核启动子 4.PL和和PR启动子启动子 当当cI合成后，与合成后，与OL和和OR结合阻止结合阻止RNA聚合酶，则左右聚合酶，则左右基因都受到抑制。但促进基因都受到抑制。但促进PM使使cI进一步转录。进入溶原期。进一步转录。进入溶原期。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、基因工程常用的原核启动子四、基因工程常用的原核启动子 4.PL和和PR启动子启动子

25、 表达载体常用的噬菌体启动子是表达载体常用的噬菌体启动子是PL。调节基因调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的突变基因则是选择了一个温度敏感性的突变基因cI857。整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。cI857:cI857:28时阻遏时阻遏PL，外源基因不转录。，外源基因不转录。42 时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录cI857cI857cI857cI857 P PL L 外源基因外源基因 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体

26、1.非融合型表达载体非融合型表达载体载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。质融合在一起。S-D序列序列 ATG-外源基因外源基因-TAG 优点：优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：结构组成：结构组成：1）强启动

27、子）强启动子:tac（trp-lac）2）操纵基因：乳糖操纵子系统。）操纵基因：乳糖操纵子系统。trp的的-35区区 lacUV5的的-10区区 laclac操纵基因操纵基因 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：结构组成：结构组成：3）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如如JM105菌。菌。4）终止子：）终止子：rrnB的强终止子的强终止子 S-D序列和插入位点区：序列和插

28、入位点区：S-DS-D 插入位点区插入位点区 Lac ILac I 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：结构组成：结构组成：6）载体的其余部分：来自）载体的其余部分：来自pBR322质粒。质粒。7）表达诱导物：）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）（乳糖的类似物，不会被降解）tac P Lac O S-D 插入位点区插入位点区 rrnB T 宿主宿主lac I 阻遏物阻遏物 IPTG 生命科学学院生命科学学院第二

29、节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：条件：条件：必须选择一个有必须选择一个有lacI的宿主菌。的宿主菌。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 2.分泌型表达载体分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：如：pIN III

30、系列：系列：pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 2.分泌型表达载体分泌型表达载体 pIN III系列系列 组成结构组成结构 1）强启动子：）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动启动子。子。2）调节基因：）调节基因：lac I 3）S-D序列和起始密码序列和起始密码ATG。4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。5）插入位点区（多克

31、隆位点）。）插入位点区（多克隆位点）。IppIpp lac Plac P lac Olac O S-D/ATGS-D/ATG ompaompa 插入位点插入位点 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达pIN III-comA1 以以pBR322为基础为基础构建的。构建的。调节基调节基因不必借助于宿主的因不必借助于宿主的lacI.四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 2.分泌型表达载体分泌型表达载体生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载

32、体 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。起的。如：如：pGEX系列系列 优点：便于融合蛋白的分离和纯化。优点：便于融合蛋白的分离和纯化。组成结构：组成结构：1）启动子：）启动子：tac 2）操纵基因：）操纵基因：lacP 3）调节基因：）调节基因：lacI 4）S-D序列序列 5）ori：pBR322 ori 6)融合肽：融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶）生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达

33、四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 pGEX pGEX系列系列lacIlacI tac tac lac Olac O S-D/ATGS-D/ATG GSTGST 插入位点插入位点 TGATGA lacPlacP GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱亲和层析柱分离纯化。分离纯化。产物提纯产物提纯:生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 pGEX系

34、列系列 产物分离产物分离:用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从因子可以把外源蛋白从GST上切上切下来。下来。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达pGEX-2XpGEX-2X的插入区的插入区pGEX-1XpGEX-1X的插入区的插入区pGEX-3XpGEX-3X的插入区的插入区四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 pGEX系列插入区系列插入区生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体

35、 4.其他融合蛋白系统其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）（组氨酸标签）在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨酸（个组氨酸（His）。）。His-tag能与能与Ni2+柱结合，但很容易被柱结合，但很容易被EDTA（或咪（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达人胰岛素在大人胰岛素在大肠杆菌中的表肠杆菌中的表达达 Cyanogen bromide：溴化氰溴化氰生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达

36、五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式位于位于细胞质细胞质细胞周质细胞周质细胞外细胞外表达产物表达产物形式形式包涵体蛋白包涵体蛋白融合蛋白融合蛋白寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白整合型外源蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 1.1.包涵体蛋白包涵体蛋白 在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密的聚集在一起形成无膜的裸露结构。并致密的聚集在一

37、起形成无膜的裸露结构。本质：本质：细胞内蛋白质的不断聚集细胞内蛋白质的不断聚集 包括：包括：1.1.折叠状态的蛋白质的聚集作用；折叠状态的蛋白质的聚集作用；2.2.非折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；3.3.蛋白质的中间体结构。蛋白质的中间体结构。优点：优点：易于分离纯化易于分离纯化生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 2.2.融合蛋白融合蛋白 将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个

38、基因的阅读框，这种方式表达的蛋白但不改变两个基因的阅读框，这种方式表达的蛋白.优点：优点：稳定性加强；具有较高的水溶性和一定的生物活性；稳定性加强；具有较高的水溶性和一定的生物活性；能高效表达；易于分离纯化能高效表达；易于分离纯化.生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 3.3.寡居外源蛋白寡居外源蛋白 外源基因在细胞中的表达水平与基因的拷贝数相关，外源基因在细胞中的表达水平与基因的拷贝数相关，当表达载体外源基因的拷贝数增加时，可将外源蛋白的表当表达载体外源基因的拷贝数增加时

39、，可将外源蛋白的表达量提高到更高水平。达量提高到更高水平。外源蛋白的多分子线性重组的方式外源蛋白的多分子线性重组的方式 1)1)多表达单元的重组；多表达单元的重组；2)2)多顺反子重组；多顺反子重组；3)3)多编码序列重组多编码序列重组生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 3.3.整合型外源蛋白整合型外源蛋白 外源蛋白的基因序列在宿主细胞染色体的同源序列的外源蛋白的基因序列在宿主细胞染色体的同源序列的介导下，整合到宿主细胞的染色体上，进行表达的方式介导下，整合到宿主细胞的

40、染色体上，进行表达的方式.4.4.分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白 编码的外源蛋白在某种机制下分泌到细胞外的这类蛋编码的外源蛋白在某种机制下分泌到细胞外的这类蛋白。白。优点：优点：简化纯化处理工艺；减少外源蛋白降解的概率；有利简化纯化处理工艺；减少外源蛋白降解的概率；有利于形成正确地空间构想，获得较好的生物活性或免疫原性于形成正确地空间构想，获得较好的生物活性或免疫原性生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在

41、原核细胞中的表达六、提高外源基因表达效率的方法六、提高外源基因表达效率的方法 1.选择强启动子序列，如选择强启动子序列，如tac 等等 2.调整调整S-D序列与序列与AUG碱的距离碱的距离 一般为一般为5-9bp 距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。启动子选择不同的距离。3.改变起始密码下面的几组密码子改变起始密码下面的几组密码子 能提高翻译的起始效率。能提高翻译的起始效率。4.增加增加mRNA的拷贝数和稳定性的拷贝数和稳定性 在外源基因的下游插入在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列重复性基因外回文序列”能防能

42、防止止mRNA受到受到35外切酶的攻击。外切酶的攻击。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 六、提高外源基因表达效率的方法六、提高外源基因表达效率的方法 5.减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。（1）诱导表达）诱导表达 将宿主生长代谢与外源基因表达分开。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。一般采用温度诱导或药物诱导。一般采用温度诱导或药物诱导。PL启动子是温度诱导型启动子是温度诱导型:32:cI857阻遏物有活性，抑制阻遏物有活性，抑制 PL启动

43、子，外源基启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。因不表达，宿主大量生长。42 :cI857阻遏物失活，阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。高水平表达，宿主生长受到限制。cI857cI857 P PL L 外源基因外源基因 P POO 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达六、提高外源基因表达效率的方法六、提高外源基因表达效率的方法 5.减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）诱导表达）诱导表达 tac启动子是药物诱导型启动子是药物诱导型 调节基因调节基因lac I（位于宿主基因组内

44、或载体上）始终产（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。生阻遏物。无无IPTG 阻遏物与阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。大量生长。有有IPTG 阻遏物与阻遏物与IPTG结合，结合，lac操纵基因解放，外源基因大量操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。转录。宿主生长受抑制。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达AmpR Plasmid pGEX-KGGSTlacIq Ptac PromoterAmpr IPTG生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中

45、的表达外源基因在原核细胞中的表达六、提高外源基因表达效率的方法六、提高外源基因表达效率的方法 5.减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷 （2）表达载体诱导复制）表达载体诱导复制 将宿主的生长与载体的复制分开。将宿主的生长与载体的复制分开。当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。拷贝数。当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 六、提高外源基因表达效率的方法六、提高外源基因表达效率的方法 6.提高表达

46、产物的稳定性提高表达产物的稳定性 防止被宿主的酶降解。防止被宿主的酶降解。（1）设计成融合蛋白）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。这是避免被降解的最好措施。N末端：由原核基因编码一段多肽，末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。末端：是完整的真核外源基因。质粒基因产物质粒基因产物 目的基因产物目的基因产物 NN C C 切割切割 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 六、提高外源基因表达效率的方法六、提高外源基因表达效率的方法 6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性 （2 2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被

47、降解使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。1)使用次黄嘌呤核苷（使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。的蛋白酶合成。2)大肠杆菌的大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。基因突变也减少蛋白酶的降解作用。3)T4噬菌体的噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。增加到载体上。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达六、提高外源基因表达效率的方法六、提高外源基因表达效率的方法

48、6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白）表达分泌蛋白细胞质细胞质 外膜外膜 内膜内膜 周间质周间质 质粒质粒 染色体染色体“外排外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 六、提高外源基因表达效率的方法六、提高外源基因表达效率的方法 6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件：细菌蛋白分泌的条件：有信号肽有

49、信号肽:位于位于N端，一般为端，一般为15-30aa。真核与原核的结。真核与原核的结构相似构相似,功能相似，可以互换。功能相似，可以互换。碱性氨基酸碱性氨基酸 N 疏水氨基酸核心区疏水氨基酸核心区 切割位点切割位点 Arg、Lys Leu、Ile AlaGlySer 信号肽酶信号肽酶 外源蛋白外源蛋白 生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达六、提高外源基因表达效率的方法六、提高外源基因表达效率的方法 6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件：细菌蛋白分泌的条件：蛋白质内有与分泌相关的蛋

50、白质内有与分泌相关的aa 序列序列:为蛋白指明目的地。为蛋白指明目的地。细胞内的转运机制细胞内的转运机制:信号肽酶信号肽酶I、信号肽酶、信号肽酶II等近等近20多种多种蛋白质的参与。蛋白质的参与。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达七、表达产物的检测七、表达产物的检测 1.western blotting 前提是：表达产物前提是：表达产物是已知蛋白是已知蛋白生命科学学院生命科