发酵实验报告.docx

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1、发酵工艺及设备实验报告学院：化学化工学院专业：生物工程班级：1201 学号： 学生姓名：日期2014 年 11 月实验一 摇瓶发酵法制备糖化酶一、实验目的（1） 掌握摇床发酵法制备糖化酶的工艺流程及操作方法（2） 了解利用黑曲霉菌菌种发酵时的生长条件及注意事项（3） 熟练掌握实验过程中的无菌操作和培养条件的选择二、实验仪器及试剂菌种：黑曲霉仪器：锥形瓶（500ml)、移液管、恒温水浴锅、秒表、50mL 比色管、牛皮纸、纱布（8 层）、pH 计。药品：三水乙酸钠、冰醋酸、硫代硫酸钠、碘、氢氧化钠、硫酸、可溶性淀粉、玉米粉、豆饼粉、麸皮三、实验原理摇瓶发酵是实验室常用的通风发酵方法，通过将装有液体

2、发酵培养基的摇瓶放在摇床上振荡培养，以满足微生物生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求。它是实验室筛选好气性菌种，以及摸索种子培养工艺与发酵工艺的常用方法。葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）系统名为淀粉-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗称糖化酶，是国内产量最大的酶品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原末端切开-1,4 键，也能切开-1,3 键和-1,6 键，产生葡萄糖。糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原末端开始，分解-1,4- 葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。四、实验步骤1.培养步骤1.

3、1 种子培养基制备及灭菌将新鲜土豆去皮切块，称取 200300 g 土豆块放入 500 mL 烧杯中，加入一定量水，在电炉上煮沸至土豆块熟透，用 120 目纱布过滤，滤渣反复用一定量水清洗、过滤 2 次，合并各次滤液且定容至 1000 mL 即得土豆汁。取一定体积的土豆汁，在其中加入 5%的蔗糖，溶解摇匀并调 pH 至 5.5，即得种子培养基。将适量种子培养基倒入锥形瓶（250ml），用纱布塞塞住管口，并用牛皮纸包扎，置灭菌锅中，于 121下灭菌 30min。待灭菌完毕，冷却取出。1.2 发酵培养基制备及灭菌取 6 只 500mL 摇瓶，分别按装液量 100、200、300mL 配制培养基（玉

4、米粉6%、豆饼粉 2%、麸皮 1%），加水后稍微摇动，使原料湿润，浸入水中。用8 层纱布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎。置灭菌锅中，于 121下灭菌 30min。1.3 发酵培养基接种：将已生长好的菌种，在无菌条件下，按照 10%的接量（8%-12%）接种到发酵培养基上。1.4 发酵培养基发酵：将摇瓶固定在摇床上，培养温度为 31，转速为120r/min，培养时间96h。显微镜观察菌丝形态，用试纸测发酵液pH，测定酶活力。摇瓶培养时观察各种摇瓶机的结构。2. 糖化酶活力测定2.1 待测酶液的制备：精确吸取液体酶 1.00mL，先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研， 将上清液小心倾入容量瓶中。沉渣

5、部分再加入少量缓冲液，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在 100250u/mL 范围内），摇匀。通过 4层纱布过滤，滤液供测定用。2.2 酶活力测定：于甲、乙两支 50mL 比色管中，分别加入可溶性淀粉溶液 25mL 及缓冲液 5mL， 摇匀后，于 40恒温水浴中预热 5min。在甲管（样品）中加入待测酶液 2mL， 立刻摇匀，在此温度下准确反应 30min，立刻各加入氢氧化钠溶液 0.2mL，摇匀， 将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2mL。吸取上述反应液与空白液各 5mL，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液 10mL，再加氢氧化钠溶液15mL，摇匀塞紧，于

6、暗处反应 15min。取出，加硫酸溶液 2mL，立即用硫代硫酸钠标准液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。2.3 酶活力计算：样品酶活力（u/g 或 u/mL）=579.9(A-B)cn 式中：A 与 B 分别为空白、样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积， mL；c 为硫代硫酸钠标准溶液的浓度， mol/L；n 为稀释倍数。五、数据分析比较不同装液量下的菌体形态特征、酶活力，将结果填入下表：指 标 酶活力pH100420u/mL4.2装液量/mL 200510u/mL4.1300570u/mL3.8菌体特征出现球状的白色的菌丝团，瓶壁上出现黑丝的孢子和菌丝六、 结论1.不同的装液量对酶活力的影响是随着

7、装液量的增加呈现上升的趋势，但是酶活力变化不大，并且酶活力不高，与其他组数据相比接种量跟酶活力关 2.菌体特征在锥形瓶的瓶壁上出现白色的菌丝，在培养基中也出现了丝球3.菌种新陈代谢的旺盛二氧化碳的释放增加，使 pH 值逐渐下降，最终使培养基的 pH 下降至 3.8 左右。实验二 酿酒酵母发酵过程参数的测定及计算一、实验目的1. 测定并绘制生长曲线、底物消耗曲线和产物形成曲线2. 了解发酵过程中葡萄糖的利用、菌体生长和产物生成的相互关系3. 初步学会菌体生长、底物消耗和产物生成有关发酵参数的求解二、实验仪器及试剂菌种：酿酒酵母仪器：锥形瓶（250ml）、移液管、pH 计、生物传感仪、分析天平药品

8、：酵母膏、胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA 钠、氯化钠三、实验原理CO酵母菌是兼性厌氧型真菌，喜欢含糖的环境， 有氧时将葡萄糖分解成和水，无氧时将葡萄糖分解成酒精和二氧化碳，同时都释放出能量生物传感器由生物识别元件和信号转换器组成，能够选择性地对样品中的待测物发出相应，通过生物识别系统和电化学或其他传感器把待测物质的浓度转为电信号，根据电信号的大小定量测出待测物质的浓度。生物传感器是应用生物活性材料（如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理或化学换能器有机结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是物质在分子水平的快速、微

9、量分析方法四、 实验步骤1. 种子培养基（YEPD，g/L）：称取酵母膏 10g、胰蛋白胨 20g、葡萄糖 20g，加蒸馏水溶解，调节 pH 5.0 左右，并定容至 1000ml。2. 发酵培养基（g/L）：称取酵母膏10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖100g 加蒸馏水溶解，调节pH 至 5.0 左右，定容至1000ml，分装10 个锥形瓶（250ml）封口121，30min 灭菌。3. 种子培养：将活化好的种子培养液，用移液管移去10ml 接种于灭菌 YEPD 液体培养基中， 于 30、120 r/min 全温摇瓶柜中培养 24 h 左右，观察种子液的色泽、气味与形态等基本情况。4. 发酵方法：

10、将培养好的种子液按 8-12%的接种比例，接种于发酵培养基中， 置于 30 、120 r/min 全温摇瓶柜中培养 96 h。5. 过程取样：发酵培养基接种发酵后，每隔 8 小时取样，移取 45ml 菌液至离心试管中 3800r/min 离心，上清液取出分析，菌泥放置烘箱烘干，分析菌体生物量、残余葡萄糖浓度与酒精生成量，并以此为基础数据计算参数6. 生物量的测定：取等量的两份发酵液，一份由烘干法测得菌体干重（DCW），另一份稀释成一定的浓度于 630 nm 下测定吸光值（ OD 值），得到标准曲线为 DCW=3.87OD（R=0.996）。再以相同方法测得样品的 OD 值，按标准曲线计算出菌体

11、干重。7. 还原糖的测定与乙醇的测定：使用生物传感仪测定糖类和酒精的含量五、 数据分析发酵参数测定值或计算值发酵参数测定值或计算值表 1 相关参数的计算发酵周期 (h)90平均比酒精生成速率(h-1)3.25初始葡萄糖浓度 (g/L)99.96葡萄糖消耗速率 g/(Lh)1.1残余葡萄糖浓度 (g/L)0.9酒精转化率 (%)7.03%最大菌体干重 (g/L)11.8细胞转化率 (g/g)1.05最大酒精浓度 (g/L)11.6酒精产率 g/(Lh)1.06平均比生长速率 (h-1)1203.细胞产率 g/(Lh)0.117平均比糖消耗速率 (h-1)5.63表 2 残糖量-生物量时间 h09

12、182736455463728190残 糖 量9.965.52.01.10.50.50.200.130.10.080.09g/100ml生 物 量00.760.880.841.021.141.061.141.181.161.18g/100ml图 1葡萄糖-酒精含量随时间变化关系葡萄糖酒精1210lm/g量含86420020406080100时间（h）图 2酒精含量随时间关系曲线酒精含量1.41.2)lm1（ 0.8量含 0.6精 0.4酒0.20020406080100时间（h）六、 结论1. 从酒精的产率上来说理论上是每 100g 葡萄糖所产酒精的含量是 165.6g，但最大酒精含量只有 1

13、2g 左右，产率刚刚达 7.03%，说明大多数的葡萄糖转化成菌种生长所需要的能量物质2. 出现误差的原因：在移取所含菌种的培养液时没有摇匀，导致所接种的每个锥形瓶中的生物量出现偏差，在测量其残糖含量、转化成酒精的含量受到较大的影响。3. 使用分光光度法测定生物量，由于所配置的培养基中含有葡萄糖，经高温杀菌后，转变成焦糖类物质，出现棕红色，对测吸光度时产生了较大影响，对实验造成了较大的误差。实验三 酿酒酵母反复分批发酵制备酒精一、实验目的1. 初步学会酿酒酵母反复分批发酵法生产酒精的工艺操作2. 了解反复分批发酵法工艺的优缺点二、实验仪器及试剂菌种：酿酒酵母仪器：锥形瓶（250ml）、移液管、量

14、筒、pH 计、生物传感仪、分析天平药品：酵母膏、胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA 钠、氯化钠三、实验要求1. 对整个反复分批发酵过程的菌体生长、葡萄糖消耗和酒精生成作图；2. 计算每一个发酵过程的酒精浓度（或产量）、得率（或转化率）和产率（生产强度）四、 实验步骤1. 种子培养基（YEPD，g/L）：称取酵母膏 2.5g，胰蛋白胨 5g，葡萄糖 5g；于烧杯中，加蒸馏水溶解，调节 pH 至 5.0 左右，定容至 250ml。121、30min 灭菌处理。2. 发酵培养基（g/L）：称取酵母膏 5g，胰蛋白胨 10g，葡萄糖 50g 于烧杯中，加蒸馏水溶解，调节pH

15、至 5.0 左右，定容至 500ml，分装入 250ml 的锥形瓶中， 封口，置于灭菌锅 121.30min 灭菌。3. 种子培养：将活化的种子液移取 10ml 接种于灭菌 YEPD 液体培养基中，于30、120 r/min 全温摇瓶柜中培养 20 h 左右，观察种子液的色泽、气味与形态等基本情况。4. 发酵方法：将培养好的种子液按 10%的比例接种于发酵培养基中，置于30 、120 r/min 全温摇瓶柜中培养 24 h。5. 反复分批操作：当第一个分批发酵完成后，在无菌操作条件下，将发酵部分或全部倒入灭过菌的 50mL 离心管中，45ml。量取，旋紧盖子密封后离心，再在无菌操作条件用无菌水

16、洗涤，如此循环 12 次后，倒入少量新鲜培养基将菌株充分悬浮，重新倒回原新鲜培养基三角瓶后扎紧纱布，置全温摇瓶柜中于发酵条件下培养。如此循环操作，直到菌株衰退为止。6. 过程取样：每批发酵培养基接种发酵后，每隔几小时取样分析菌体生物量、残余葡萄糖浓度与酒精生成量，并以此为基础数据进一步完成实验要求的内容五、 数据分析表 1 分批发酵实验数据时间（h）122436pH 值4.704.634.65生物量（g/100ml）0.410.520.52残余葡萄糖(g/100ml)4.74.44.5酒精生成量（g/100ml）0.050.0660.06图 1pH值随时间变化关系5.15值 4.9p 4.8H

17、pH值4.74.605101520时间（h）25303540图 2葡萄糖含量随时间变化关系12） 10lm（ 量含糖萄葡86葡萄糖含量42005101520时间（h）25303540图 3酒精生成量随时间变化关系酒精含量0.070.06）lm0 0.050.041/g（ 0.03量精 0.02酒0.01005101520时间25303540实验心得在本次实验中，我们从拿到实验题目到完成全部的实验，可以说遇到了很多的困难，但最后还是在和同学的商讨中找到了解决的方案。从这次实验中我收获了很多，也加深了对发酵理论知识的一次巩固，下面是我在这次实验中的总结由于时间段，所以我们三个实验同时开始的，所以说

18、工作量有点大，从配制培养基到灭菌接种，然后培养，再到从其中的取样分析的过程。在培养基的配制过程中我们采取了不同装液量，探究不同的装液量对酒精的生成以及其他的含量组成的变化，因为发酵的时间比较长，所以我们计划在实验二的发酵阶段开始完成对实验一的一些数据的测试。实验一我们通过分别做静置培养与摇床的搅拌发酵，从结果中可以看出搅拌对发酵是有利的，生物量，酒精的生成量都高于静置发酵。在实验二中我们在生物量测定的过程中遇到的问题比较多，由于我们所用的葡萄糖在高温下焦糖化，使培养基的颜色变深，这样在后面测定生物量的时候，就会出现吸光度测定不准确，造成实验误差。当我们把发酵液稀释的倍数变得很大，造成发酵液里的

19、生物量变得很少也会造成较大的实验偏差。在实验三中， 每次转移的的时候，都为无菌操作，但是有的组就出现了有其他的杂菌的生长的现象，而且杂菌生长的比较茂盛（定置发酵，容易观察），所以在以后的发酵或者其他无菌实验中一定注意无菌操作的重要性，加强自己在实验中操作的规范 性。同时在本次试验中，我也体会到了团队合作的重要性，我们这组中有四个同学，各司其职，保证了实验的顺利进行。还有遇到问题和其他组的交流的过程， 让我学到了很多的东西。最后，通过这次的发酵实验我不但对理论知识有了更加深的理解，对于实际的操作和也有了质的飞跃。经过这次的实验，我们整体对各个方面都得到了不少的提高。我们在做实验不要一成不变和墨守成规，应该有改良创新的精神。实际上，在弄懂了实验原理的基础上，做实验应该是游刃有余的，如果说创新对于我们来说是件难事，那改良总是有可能的，所以当一些同学问我接种量的时候我都会让他们自己定。还有以后的实验中要多思考，想好实验流程后，再动手避免不必要的浪费时间。同组实验人员：2014 年 11 月 29 日