用荧光显微镜结构及观察口腔上皮细胞的dna.ppt

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1、实验实验 荧光显微镜结荧光显微镜结构及口腔粘膜上皮细构及口腔粘膜上皮细胞胞DNA的观察的观察w实验目的实验目的w实验原理实验原理w仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂w实验步骤实验步骤w实验报告及思考题实验报告及思考题 实实 验验 目目 的的了解荧光显微镜的基本构造和基本光路了解荧光显微镜的基本构造和基本光路了解荧光探针了解荧光探针Hoechst33258或或33342与细与细胞成分的结合特性和光谱特性胞成分的结合特性和光谱特性荧荧光光显显微微镜镜什么是荧光什么是荧光?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。变为高能状态，再

2、回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。一种光化荧光一种光化荧光 荧光的种类荧光的种类自发荧光自发荧光 次生荧光次生荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光荧光的性质荧光的性质w吸收光吸收光w保持固有的荧光特性保持固有的荧光特性w荧光波长激发波长（荧光波长激发波长（

3、STOKES STOKES 法则）法则）w荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度w有不同程度的衰减有不同程度的衰减w荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光效率落射荧光显微镜的构造落射荧光显微镜的构造吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜分色镜分色镜汞灯汞灯汞灯汞灯紫外线保护罩紫外线保护罩紫外线保护罩紫外线保护罩孔径光栏孔径光栏孔径光栏孔径光栏（FSFSFSFS）视场光栏视场光栏视场光栏视场光栏（ASASASAS）落射荧光显微镜各部件特性和作用落射荧光显微镜各部件特性和作用 汞灯

4、光源汞灯光源汞灯光源汞灯光源:提供激发光提供激发光提供激发光提供激发光(UV(UV(UV(UV、B B B B、G)G)G)G)激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜:波长选择波长选择波长选择波长选择nmT%BAND PASSBAND PASS落射荧光显微镜原理落射荧光显微镜原理汞汞汞汞 灯灯灯灯激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜分色镜分色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜物物物物 镜镜镜镜 标标标标 本本本本滤色镜的选择滤色镜的选择荧光素的特性荧光素的特性荧光素的特性荧光素的特性滤色镜的特性滤色镜的特性滤色镜的特性滤色镜的特性激发激发激发激发分色分色分色分色吸收吸

5、收吸收吸收根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜实实 验验 原原 理理 荧荧荧荧光光光光显显显显微微微微镜镜镜镜技技技技术术术术是是是是利利利利用用用用一一一一定定定定波波波波长长长长的的的的光光光光（通通通通常常常常是是是是波波波波长长长长短短短短的的的的紫紫紫紫外外外外光光光光和和和和蓝蓝蓝蓝紫紫紫紫光光光光）照照照照射射射射被被被被检检检检样样样样品品品品，样样样样品品品品获获获获得得得得能能能能量量量量，产产产产生生生生能能能能量量量量跃跃跃跃迁迁迁迁，从从从从基基基基态态态态到到到到汽汽

6、汽汽激激激激发发发发态态态态，再再再再从从从从激激激激发发发发态态态态回回回回到到到到原原原原态态态态，放放放放出出出出光光光光和和和和热热热热能能能能，产产产产生生生生的的的的光光光光为为为为波波波波长长长长较较较较长长长长的的的的光光光光（相相相相对对对对于于于于激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长），此此此此可可可可见见见见光光光光称称称称为为为为荧荧荧荧光光光光。通通通通过过过过物物物物镜镜镜镜、目目目目镜镜镜镜的的的的成像、放大，以供观察、检测和拍摄。成像、放大，以供观察、检测和拍摄。成像、放大，以供观察、检测和拍摄。成像、放大，以供观察、检测和拍摄。w w 荧光显微镜要求有特殊

7、的光源提供足够强度和荧光显微镜要求有特殊的光源提供足够强度和荧光显微镜要求有特殊的光源提供足够强度和荧光显微镜要求有特殊的光源提供足够强度和较短波长的激发光，诱发荧光物质发出较长波长的较短波长的激发光，诱发荧光物质发出较长波长的较短波长的激发光，诱发荧光物质发出较长波长的较短波长的激发光，诱发荧光物质发出较长波长的荧光。视野中所看到的像，主要是样品的荧光映像。荧光。视野中所看到的像，主要是样品的荧光映像。荧光。视野中所看到的像，主要是样品的荧光映像。荧光。视野中所看到的像，主要是样品的荧光映像。荧光显微镜技术是在光学显微镜水平上对蛋白质和荧光显微镜技术是在光学显微镜水平上对蛋白质和荧光显微镜技

8、术是在光学显微镜水平上对蛋白质和荧光显微镜技术是在光学显微镜水平上对蛋白质和亚细胞组分进行定位的最常用的方法之一。非免疫亚细胞组分进行定位的最常用的方法之一。非免疫亚细胞组分进行定位的最常用的方法之一。非免疫亚细胞组分进行定位的最常用的方法之一。非免疫荧光探针可用来直接标记许多特殊的亚细胞组分及荧光探针可用来直接标记许多特殊的亚细胞组分及荧光探针可用来直接标记许多特殊的亚细胞组分及荧光探针可用来直接标记许多特殊的亚细胞组分及生物大分子。这些探针大多数能被活细胞直接摄取生物大分子。这些探针大多数能被活细胞直接摄取生物大分子。这些探针大多数能被活细胞直接摄取生物大分子。这些探针大多数能被活细胞直接

9、摄取并掺入和聚集在特定的细胞器中，因此我们就可以并掺入和聚集在特定的细胞器中，因此我们就可以并掺入和聚集在特定的细胞器中，因此我们就可以并掺入和聚集在特定的细胞器中，因此我们就可以通过荧光显微镜对这些细胞器进行观察。通过荧光显微镜对这些细胞器进行观察。通过荧光显微镜对这些细胞器进行观察。通过荧光显微镜对这些细胞器进行观察。w Hoechst33258是一种亲脂性物质，可跨是一种亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，与膜进入活细胞，与DNA特异性结合，它主要特异性结合，它主要结合在富含结合在富含AT区域的区域的DNA小沟部分。结合小沟部分。结合DNA后荧光大大增强，最大激发光波长约为后荧光大大增强，最大

10、激发光波长约为350nm,最大发射光波长约为最大发射光波长约为461nm。可用。可用于活细胞观察，不需要对细胞作固定及透化于活细胞观察，不需要对细胞作固定及透化处理。处理。仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂仪器：荧光显微镜，仪器：荧光显微镜，材料：口腔粘膜上皮细胞，载玻片，牙签材料：口腔粘膜上皮细胞，载玻片，牙签试剂：试剂：PBS(pH 7.4)Ho.33258 or H.33342（10g/mL，溶于，溶于PBS)实实 验验 步步 骤骤w在在1张载玻片上分别滴加一滴张载玻片上分别滴加一滴PBS溶液溶液w用牙签刮取口腔上皮细胞，分别涂于载玻片上（牙签用牙签刮取口腔上皮细胞，分别涂于载玻片上（牙签在液滴中搅匀）在液滴中搅匀）w在涂细胞处分别滴加在涂细胞处分别滴加10g/mL的的Hoechst.33342盖片盖片室温暗处孵育室温暗处孵育2-3分钟分钟w用紫外光激发，观看细胞用紫外光激发，观看细胞DNA荧光荧光注 意 事 项w盖片时防止产生气泡盖片时防止产生气泡w滴加的染料不宜太多，否则背景太深，影响观察滴加的染料不宜太多，否则背景太深，影响观察w 注意避光，包括制片、荧光观察和探针保存注意避光，包括制片、荧光观察和探针保存w操作时防止污染皮肤和环境操作时防止污染皮肤和环境口腔粘膜上皮口腔粘膜上皮.jpg