8 第八讲(3) 植物单细胞培养技术.ppt

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1、 植物单细胞培养技术植物单细胞培养技术 周口师范学院生命科学系周口师范学院生命科学系 1 植物单细胞培养的意义1.1 有利于观察细胞个体的分裂、分化、生长和繁殖情况；1.2 有利于获得纯细胞系；1.3 有利于进行细胞特性、细胞生长规律、细胞代谢过程及其调节控制规律等方面的研究；1.4 有利于生物转化和天然化合物的生产。2 植物单细胞的分离技术2.1 从外植体直接分离单细胞2.2 从愈伤组织分离单细胞2.3 通过原生质体再生法获得单细胞2.1 从外植体直接分离单细胞 外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。悬浮液中所含的完整细胞数量较少，但分散性好。2.2

2、从愈伤组织分离单细胞 将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。为了增强分散效果，必要时可添加适量的果胶酶，使由果胶粘连在一起的细胞分开。2.3 通过原生质体再生法获得单细胞 外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁而获得原生质体。原生质体再生细胞壁 外植体愈伤组织单细胞悬浮液 愈伤组织 再生植株酶解3 植物单细胞的培养方法3.1 平板培养法（1960年，Bergman）3.2 看护培养法（1954年，Muir）3.3 微室培养法（1960年，Jones）1 单细胞悬浮

3、液的制备2 单细胞悬浮液的密度调整 3 固体培养基的配制4 单细胞悬浮液与固体培养基等量混合5 暗培养6 继代培养3.1 平板培养法 程 序：1 单细胞悬浮液的制备单细胞来源：3.1 平板培养法 程 序：外植体(叶肉细胞)愈伤组织原生质体 2 单细胞悬浮液的密度调整要求：调整后的密度为植板细胞密度的2倍调整方法：如果密度过大，加入液体培养基进行 稀释；如果密度小，通过低速离心使细胞沉降后，再加入适量液体培养基。3.1 平板培养法 程 序：3 固体培养基的配制 当细胞植板密度过高(104或105个/ml)，使用和在悬浮培养中或愈伤组织培养中成分相似的纯合成培养基 当细胞植板密度过小，细胞对培养基

4、的要求就变得越加复杂 注意：要选择适合单细胞培养的培养基3.1 平板培养法 程 序：4 单细胞悬浮液与固体培养基等量混合当培养基凝固后，细胞能均匀的分布并固定在很薄一层(1mm)培养基中在培养皿外对单细胞做标记，便于观察。3.1 平板培养法 程 序：5 暗培养注意：培养期间对细胞频繁的镜检会对细胞的生 长产生有害作用，应尽量减少镜检次数。3.1 平板培养法 程 序：6 继代培养 选取生长良好的由单细胞形成的细胞团，可以获得由单细胞形成的细胞系。3.1 平板培养法 程 序：初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响 用平板法培养单细胞或原生质体时，常以植板效率来表示。植板效率植板效率=每个平板上形成的细

5、胞团数每个平板上形成的细胞团数/每个平板上接种的细胞总每个平板上接种的细胞总数数100%如果在琼脂培养基或液体培养基中，植板细胞的初始密度为1 104或1 105个/ml，植板后由相邻细胞形成的细胞群落常混在一起。如果降低植板密度或完全孤立地培养单细胞，则可避免这个问题。但是当低于临界密度时，细胞就不能分裂。原因是什么？原因是什么？初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响原因：植物细胞的生长繁殖需要一定浓度的某些内源化合物。初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响 如何培养完全孤立的单细胞？1将生长活跃的愈伤组织接2种在固体培养基上 3.2 看护培养法 程 序：2 在愈伤组织块上方放置一片面积为1cm2的

6、无菌滤纸，滤纸下方紧贴愈伤组织3 借助于微型移液管从细胞悬浮液中提取适量单细胞悬浮液，然后接种在无菌滤纸上面。3.2 看护培养法 程 序：4 将在滤纸上由单细胞形成的细胞团转移到新鲜的固体培养基中进行继代培养，获得由单细胞形成的细胞系。可能的原因是：1 愈伤组织的存在给单细胞传递了某些生物信息 2 愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件为什么有愈伤组织的看护就能进行单细胞培养？1 借助于微型移液管从细胞悬浮液中提取适量单细胞悬浮液，置于一张无菌载片上。在这滴培养液四周与之隔一定距离加上一圈石蜡油，构成微室的”围墙”，在围墙左右两侧再各加一滴石蜡油，每滴之上置一张盖片作为微室的“支柱”。3.

7、3 微室培养法 程 序：2 将第三张盖片架在两个“支柱”之间，构成微室的“屋顶”3.3 微室培养法 程 序：3单细胞悬浮液在微室中4 当细胞团长到一定大小时揭掉盖片，把细胞团转移到新鲜培养基上培养微室培养图示：1滴含单细胞培养液滴含单细胞培养液周围加石蜡油周围加石蜡油凹穴载凹穴载玻片玻片旁边加石蜡油旁边加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片盖盖玻片盖盖玻片平视图置培养皿中2628 恒温培养微室培养的优点：有利于对细胞特性的研究 有利于对单个细胞的生长、分裂、分化等情况进行全程跟踪研究。小 结：通过这一节课 的学习，我们要掌握的知识点：1 植物单细胞的获得方法 2 植物单细胞的培养技术思考：1 简述植物单细胞平板培养操作过程2 在进行植物单细胞培养时，细胞密度过大或过小会对培养结果产生什么影响？