植物细胞培养.ppt

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1、植物细胞培养植物细胞培养主要内容主要内容n定义定义n植物细胞培养的方法植物细胞培养的方法n植物细胞培养的培养基植物细胞培养的培养基n植物单细胞培养植物单细胞培养n植物细胞培养的意义与应用举例植物细胞培养的意义与应用举例n植物细胞的生物反应器大规模培养植物细胞的生物反应器大规模培养n植物细胞的两相培养技术植物细胞的两相培养技术n植物细胞的生物反应器固定化培养植物细胞的生物反应器固定化培养n植物细胞培养存在的问题与发展趋势植物细胞培养存在的问题与发展趋势一、定义一、定义n在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行震荡培养，得到分散成置于液体

2、培养基中进行震荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。从而获得大量细胞群体的一种技术。n小规模的悬浮培养可在培养瓶小规模的悬浮培养可在培养瓶n大规模在生物反应器大规模在生物反应器二、植物细胞培养的方法二、植物细胞培养的方法根据培养的对象：根据培养的对象：n单细胞培养单细胞培养n单倍体培养：花药培养单倍体培养：花药培养n原生质体培养原生质体培养根据培养系统：根据培养系统：n悬浮培养悬浮培养n液体培养液体培养n固体培养固体培养n固定化培养固定化培养n植物细胞培养系统分类植物细胞培养系统分类细胞培养固体培养液体

3、培养琼脂糖培养固定化培养摇瓶悬浮培养反应器大规模培养分批培养半连续培养连续培养恒化培养恒浊培养能保持细胞活性的固定能保持细胞活性的固定化将细胞包埋于海藻酸化将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中盐或卡拉胶中培养基培养基n（1 1）固体培养基：）固体培养基：一般加有琼脂的培养基，一般加有琼脂的培养基，琼脂浓度按需要而定，通常为琼脂浓度按需要而定，通常为0.61.0%0.61.0%n（2 2）固体化培养基，）固体化培养基，让培养基形成固体不是让培养基形成固体不是琼脂而是琼脂而是海藻酸盐海藻酸盐或或卡拉胶卡拉胶，细胞被包于其中。，细胞被包于其中。n（3 3）液体培养基：不加琼脂或海藻酸盐的培）液体培养基：不

4、加琼脂或海藻酸盐的培养基。养基。培养方法：培养方法：n接种：接种：将一定密度的细胞接种到细胞培将一定密度的细胞接种到细胞培养基上进行培养。养基上进行培养。n几种主要的方法（以培养基来分）几种主要的方法（以培养基来分）固体培养固体培养n平板培养平板培养，将一定浓度细胞的液体培养基涂抹在固，将一定浓度细胞的液体培养基涂抹在固体培养基表面（动物、植物、微生物适用）体培养基表面（动物、植物、微生物适用）n划线培养基划线培养基：将沾有一定浓度细胞的液体培养基在：将沾有一定浓度细胞的液体培养基在固体培养基上划成工形的线，培养基可以是平面或固体培养基上划成工形的线，培养基可以是平面或斜面。多用于微生物。斜面

5、。多用于微生物。n混合培养混合培养：将一定体积含有一定浓度细胞的少量液：将一定体积含有一定浓度细胞的少量液体培养基与快要凝固的固体培养基混合让细胞嵌入体培养基与快要凝固的固体培养基混合让细胞嵌入其中。其中。n饲养场培养：饲养场培养：用用X X射线等处理细胞，让其无活性，分射线等处理细胞，让其无活性，分裂很慢，以此作为饲养细胞，再与所以培养的细胞裂很慢，以此作为饲养细胞，再与所以培养的细胞（靶细胞）混合于固体培养中，饲养细胞提供合适（靶细胞）混合于固体培养中，饲养细胞提供合适的环境又不与靶细胞争夺营养。的环境又不与靶细胞争夺营养。液体培养液体培养A.A.按量多少来分：按量多少来分：na.a.微量

6、培养：微滴培养微量培养：微滴培养 培养板培养培养板培养n b.b.一般量培养（培养皿、三角瓶、培养管等）一般量培养（培养皿、三角瓶、培养管等）n c.c.大量培养：（悬浮培养，有连续和半连续大量培养：（悬浮培养，有连续和半连续培养，半连续纸到一定时间放去培养液再加培养，半连续纸到一定时间放去培养液再加等体积的培养液；连续培养至不断加入培养等体积的培养液；连续培养至不断加入培养液不断放出培养细胞。固定细胞）液不断放出培养细胞。固定细胞）微室培养微室培养n目前可使用特制的凹穴载玻片与盖玻片做成的单细目前可使用特制的凹穴载玻片与盖玻片做成的单细胞培养的小室进行培养。胞培养的小室进行培养。“双层盖玻片

7、法双层盖玻片法”B B按震荡与否分为按震荡与否分为n a a静置培养；静置培养；b b震荡培养（摇床、震荡培养（摇床、转床悬浮培养）转床悬浮培养）C C是否加其他细胞培养：是否加其他细胞培养：n a a饲养层培养：将饲养细胞与靶细饲养层培养：将饲养细胞与靶细胞混合于液体培养基中胞混合于液体培养基中.n b b看护培养：将一块生长活跃的愈看护培养：将一块生长活跃的愈伤组织（或组织）放入培养基中，再在伤组织（或组织）放入培养基中，再在上放置一层滤纸，滤纸上加上靶细胞进上放置一层滤纸，滤纸上加上靶细胞进行培养。行培养。饲养层培养法饲养层培养法看护培养看护培养 用一块活跃生长的愈伤组用一块活跃生长的愈

8、伤组织来看护单细胞使之持续织来看护单细胞使之持续分裂生长和增殖的培养方分裂生长和增殖的培养方法。法。这个愈伤组织块称为看护这个愈伤组织块称为看护愈伤组织，方法简便易行愈伤组织，方法简便易行且效果好，有且效果好，有 些用平板培些用平板培养不能成功的细胞用此方养不能成功的细胞用此方法可取得成功，可能提供法可取得成功，可能提供了了促进细胞分裂促进细胞分裂的活性物的活性物质质植物细胞多采用悬浮培养：植物细胞多采用悬浮培养：n可增加培养细胞与培养液的接触面，促进可增加培养细胞与培养液的接触面，促进营养的吸收。营养的吸收。n可带走培养物产生的有害代谢物，避免高可带走培养物产生的有害代谢物，避免高浓度聚集对

9、细胞的伤害浓度聚集对细胞的伤害n保证良好的混合状态，从而获得良好的气保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果。体传递效果。n容易放大实现规模化；容易放大实现规模化；三、植物细胞的培养基三、植物细胞的培养基培养基组成培养基组成n无机盐无机盐n碳源碳源n植物生长激素植物生长激素n有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基酸混合物，对初级培养的早期生长阶段有利。酸混合物，对初级培养的早期生长阶段有利。n有机酸：丙酮酸等有机酸：丙酮酸等n复合物质复合物质:椰子汁椰子汁nMS、B5、N6四、植物单细胞培养四、植物单细胞培养n单细胞制备方法单细胞制备方法n单细胞

10、培养方法单细胞培养方法n悬浮细胞的同步化方法悬浮细胞的同步化方法n细胞保存细胞保存n植物细胞培养的意义与应用举例植物细胞培养的意义与应用举例（一）单细胞的制备方法（一）单细胞的制备方法n1.1.直接方法直接方法n2.2.间接方法间接方法1.1.直接法：直接法：（1 1）机械制备：）机械制备：通过机械研磨，通过机械研磨，切割植物切割植物组织，然后离心收集，可获得植物单细胞（早组织，然后离心收集，可获得植物单细胞（早期）期）n优点：对细胞无化学毒害优点：对细胞无化学毒害，n缺点：效率低，数量少。缺点：效率低，数量少。（2 2）酶法）酶法：是目前最有效的方法，对植物多用：是目前最有效的方法，对植物多

11、用果胶酶除去中间层。果胶酶除去中间层。优点：效率高，量大；优点：效率高，量大；缺点：但细胞常受到酶影响（原生质体中介绍）缺点：但细胞常受到酶影响（原生质体中介绍）2.2.间接法：愈伤组织法间接法：愈伤组织法n通过植物组织培养先让其产生愈伤组织，通过植物组织培养先让其产生愈伤组织，再通过高频振荡，将松散的愈伤组织分再通过高频振荡，将松散的愈伤组织分散成单个细胞，也可在震荡的同时加入散成单个细胞，也可在震荡的同时加入一定的酶，效果好。一定的酶，效果好。n此法在植物中较适用：但必须先诱导愈此法在植物中较适用：但必须先诱导愈伤组织；伤组织；n优点：产量高优点：产量高（二）单细胞培养的方法（二）单细胞培

12、养的方法n平板培养法：平板培养法：n看护培养与饲养层培养看护培养与饲养层培养n液体浅层静置培养液体浅层静置培养n细胞悬浮培养法细胞悬浮培养法平板培养平板培养n将悬浮培养的细胞接将悬浮培养的细胞接种到未固化的薄层培种到未固化的薄层培养基中，使其与培养养基中，使其与培养基充分混合，再倒入基充分混合，再倒入培养皿中进行培养的培养皿中进行培养的方法，是常用的单细方法，是常用的单细胞培养法。胞培养法。n单细胞悬液制备单细胞悬液制备n调节细胞密度调节细胞密度n培养基选择与凝固剂选择培养基选择与凝固剂选择n接种培养接种培养看护培养与饲养层培养看护培养与饲养层培养是否加其他细胞培养：是否加其他细胞培养：n饲养

13、层培养：将处理过的（用饲养层培养：将处理过的（用X X射线）无活性或射线）无活性或分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所培养的细胞使其分裂和生长；培养的细胞使其分裂和生长；n将饲养细胞与靶细胞混合于液体培养基中将饲养细胞与靶细胞混合于液体培养基中.有四种：有四种：n共同混合与琼脂糖培养基中共同混合与琼脂糖培养基中n饲养层位于下层，靶细胞位于上层饲养层位于下层，靶细胞位于上层n一起培养与液体培养基中一起培养与液体培养基中n双层滤纸植板培养：双层滤纸植板培养：看护培养：看护培养：nMuirMuir于于19531953年创立年创立n用一块活跃生长的愈伤用

14、一块活跃生长的愈伤组织来看护单细胞使之组织来看护单细胞使之持续分裂生长和增殖的持续分裂生长和增殖的培养方法。这个愈伤组培养方法。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织织块称为看护愈伤组织n简便、成功率高简便、成功率高n不能在显微镜下直接观不能在显微镜下直接观察察细胞生长的测定细胞生长的测定n（一）细胞计数：（一）细胞计数：以细胞数以细胞数/ml/ml表示，一般用表示，一般用血球计数器来测定，血球计数器来测定，n（二）细胞体积：（二）细胞体积：也可用一定体积培养液离心，也可用一定体积培养液离心，测其细胞总体积，再除去每个细胞的大小，再测其细胞总体积，再除去每个细胞的大小，再除以培养基体积就可得到每除以培

15、养基体积就可得到每mlml中有多少细胞。中有多少细胞。n（三）细胞鲜重和干重的测定（三）细胞鲜重和干重的测定 离心后称量为鲜重，除细胞数为每个细胞的鲜离心后称量为鲜重，除细胞数为每个细胞的鲜重，将其烘干呈恒重为干重。重，将其烘干呈恒重为干重。（三）悬浮细胞培养的同步化方法（三）悬浮细胞培养的同步化方法A.A.物理法：物理法：n体积筛选法：体积筛选法：对同种大小的细胞而言，体积大对同种大小的细胞而言，体积大小一样其发育程度一样。用不同大小的铜网过小一样其发育程度一样。用不同大小的铜网过滤，选取不同孔径过滤的细胞培养，一般视为滤，选取不同孔径过滤的细胞培养，一般视为相同大小的细胞。相同大小的细胞。

16、n冷冻处理法：冷冻处理法：在在4C4C下处理数天并添加新鲜培下处理数天并添加新鲜培养基，由于低温细胞分裂完成后几乎都不再分养基，由于低温细胞分裂完成后几乎都不再分裂（代谢减低），从而达到同一发育程度。裂（代谢减低），从而达到同一发育程度。n B B化学法：化学法：n饥饿法：饥饿法：控制营养液营养，使细胞处于饥饿状控制营养液营养，使细胞处于饥饿状态，不再分裂，达到同步。态，不再分裂，达到同步。n抑制法：抑制法：在培养基中加入尿苷（在培养基中加入尿苷（1ug/ml1ug/ml），），5-5-脱氧尿苷（脱氧尿苷（2ug/ml2ug/ml）等抑制细胞使细胞都达到）等抑制细胞使细胞都达到不分裂的状态。不

17、分裂的状态。n加入尿苷加入尿苷停止分裂停止分裂吸去尿苷吸去尿苷加新加新鲜培养基鲜培养基开始分裂开始分裂n秋水仙素法：秋水仙素法：加入一定浓度的秋水仙素，处理加入一定浓度的秋水仙素，处理一定时间（一定时间（46h46h）抑制有丝分裂（抑制细胞质）抑制有丝分裂（抑制细胞质分裂）分裂）（四）细胞的保存（四）细胞的保存1.1.继代保存继代保存n常温常温，每，每1212周换一次液体，植物和海藻多用此法周换一次液体，植物和海藻多用此法n低温保存低温保存：510C510C下培养，下培养，1010天换一次培养液，对于天换一次培养液，对于微生物可保存几个月，使用时要活化，防止水分蒸发微生物可保存几个月，使用时要

18、活化，防止水分蒸发（用石蜡封口，或加液体石蜡。）（用石蜡封口，或加液体石蜡。）n冰冻保存冰冻保存：-20C-20C保存，可保存一到两年，仍有活力。保存，可保存一到两年，仍有活力。如优良的植物细胞系、动物细胞也可保存在液氮或如优良的植物细胞系、动物细胞也可保存在液氮或-70C70C的冰箱中，一般用的冰箱中，一般用5%5%、10%10%或或15%15%的甘油及的甘油及10%10%的的二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSODMSO）冻存或传代细胞。细胞数量为）冻存或传代细胞。细胞数量为26x1026x106 6，用，用90%90%培养液培养液+10%DMSO+10%DMSO冻存在冻存在2ml2ml的安培瓶

19、中。的安培瓶中。（五）植物细胞培养的意义与应（五）植物细胞培养的意义与应用举例用举例与整株植物栽培相比，细胞培养技术的优点包括：与整株植物栽培相比，细胞培养技术的优点包括：n代谢产物的生产在控制条件下进行；优化细胞代谢产物的生产在控制条件下进行；优化细胞系和优化细胞条件；系和优化细胞条件；n细胞培养在无菌条件下进行；细胞培养在无菌条件下进行；n可以通过特定的生物转化途径获得均一有效成可以通过特定的生物转化途径获得均一有效成分；分；n可以探索新的合成路线、获得新的有用物质。可以探索新的合成路线、获得新的有用物质。1.药用代谢产物药用代谢产物n野生植物资源日益减少，目前很多用用植物可野生植物资源日

20、益减少，目前很多用用植物可以通过细胞培养技术生产。许多培养细胞中积以通过细胞培养技术生产。许多培养细胞中积累的药物成分含量超过了其亲本植株内的含量：累的药物成分含量超过了其亲本植株内的含量：目前，植物细胞培养的药物成分主要包括：目前，植物细胞培养的药物成分主要包括：n苷类苷类：皂苷，强心苷，甘草甜苷、香豆精苷：皂苷，强心苷，甘草甜苷、香豆精苷n甾醇甾醇：紫杉醇，天然的：紫杉醇，天然的10倍倍n生物碱：生物碱：n醌类：醌类：蒽醌、萘醌、返醌蒽醌、萘醌、返醌n蛋白类：蛋白类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂、植胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂、植物病毒抑制剂、植物抗生素物病毒抑制剂、植物抗生素2.2.天然

21、食品、食品添加剂天然食品、食品添加剂天然食品添加剂受到消费者青睐；天然食品添加剂受到消费者青睐；目前报道过的植物细胞培养的方法生产的：目前报道过的植物细胞培养的方法生产的：n色素有色素有胡萝卜素、叶黄素、丹宁、黄酮体胡萝卜素、叶黄素、丹宁、黄酮体等等n辣椒细胞培养辣椒细胞培养辣椒素辣椒素n咖啡细胞培养咖啡细胞培养可可碱和咖啡碱可可碱和咖啡碱n海藻的愈伤组织中生产海藻的愈伤组织中生产琼脂琼脂n培养甜菊叶细胞可提取甜菊苷的天然甜味剂培养甜菊叶细胞可提取甜菊苷的天然甜味剂3.3.杀虫剂、杀菌剂杀虫剂、杀菌剂n万寿菊的组培中可以收获农药噻吩烷；万寿菊的组培中可以收获农药噻吩烷；n鹰嘴豆和扫帚艾的遇上组

22、织或细胞中可以得到鹰嘴豆和扫帚艾的遇上组织或细胞中可以得到三种鱼藤生物碱、灰叶素、鱼藤酮和除虫菊酯三种鱼藤生物碱、灰叶素、鱼藤酮和除虫菊酯等等n葫芦巴静态培养物中能分离到蓝鱼藤酮、粉红葫芦巴静态培养物中能分离到蓝鱼藤酮、粉红鱼藤酮鱼藤酮洋地黄洋地黄 4.4.饲料、精细化工等产品饲料、精细化工等产品n蚕的饲料生产：桑、蓖麻、榆，受季蚕的饲料生产：桑、蓖麻、榆，受季节限制；节限制；n从银胶菌愈伤组织细胞中橡胶。从银胶菌愈伤组织细胞中橡胶。（六）植物细胞的生物反应器大规模培养（六）植物细胞的生物反应器大规模培养n19591959年（年（TuleckeTulecke）和尼克尔（）和尼克尔（Nickel

23、lNickell）首次）首次将微生物培养用的发酵工艺用在高等植物的悬将微生物培养用的发酵工艺用在高等植物的悬浮培养中；浮培养中；1.1.植物细胞本身的特点：植物细胞本身的特点：n细胞大（细胞大（3010030100倍）倍）n细胞团形式，容易循环不良；细胞团形式，容易循环不良；n纤维素细胞壁容易被剪切力高的搅拌式式微生纤维素细胞壁容易被剪切力高的搅拌式式微生物反应器损伤；物反应器损伤；n生长速度慢，操作周期长，分批培养生长速度慢，操作周期长，分批培养2-32-3周；周；植物细胞培养液的流变特性植物细胞培养液的流变特性n易结团，并且很多培养过程中分泌粘多易结团，并且很多培养过程中分泌粘多糖，是的传

24、氧速度降低；糖，是的传氧速度降低；n粘度变化原因：细胞浓度、年龄、大小、粘度变化原因：细胞浓度、年龄、大小、结团情况等；结团情况等；n可用粘度参数来描述流变特性。可用粘度参数来描述流变特性。植物细胞培养过程中的气体传递与影响植物细胞培养过程中的气体传递与影响n培养过程需要光照；氧与二氧化碳含量与传递对培养培养过程需要光照；氧与二氧化碳含量与传递对培养过程影响较大：过程影响较大：n氧的传递：氧的传递：需连续不断供养，氧从气相到细胞表面的需连续不断供养，氧从气相到细胞表面的传递是植物细胞培养的最基本的问题；传递是植物细胞培养的最基本的问题；n氧的传递：氧的传递：通气速率、培养液混合程度、培养液流变

25、通气速率、培养液混合程度、培养液流变特性、气液界面面积等特性、气液界面面积等n氧的吸收：氧的吸收：反应器类型、细胞生长速率、温度、反应器类型、细胞生长速率、温度、pH、营养组成、细胞浓度等有关。营养组成、细胞浓度等有关。n二氧化碳的影响：二氧化碳的影响：二者浓度达到平衡细胞才生长良好。二者浓度达到平衡细胞才生长良好。可用其来维持一定的可用其来维持一定的pH值。值。泡沫与器壁表面粘附性泡沫与器壁表面粘附性n产生的气泡大产生的气泡大n细胞会黏附于培养容器内，可以在其上细胞会黏附于培养容器内，可以在其上涂抹硅油消除黏附涂抹硅油消除黏附细胞分裂与愈伤组织形成细胞分裂与愈伤组织形成n单个细胞单个细胞3-

26、53-5天内就可以观察到细胞分天内就可以观察到细胞分裂；裂；n一个星期左右可形成小的细胞团；一个星期左右可形成小的细胞团；悬浮细胞生长与增殖悬浮细胞生长与增殖悬浮细胞培养经历：悬浮细胞培养经历：n延迟期：延迟期：细胞由于接种后进入新的环境的适应期，很细胞由于接种后进入新的环境的适应期，很少分裂；少分裂；n对数生长期：对数生长期：细胞开始分裂、数目缓慢增加；细胞开始分裂、数目缓慢增加；n直线生长期：直线生长期：细胞生长旺盛，数目快速增加。细胞生长旺盛，数目快速增加。n减缓期：减缓期：由于营养、细胞老化等因素限制，细胞分裂由于营养、细胞老化等因素限制，细胞分裂速度减慢。速度减慢。n静止期：静止期：

27、死亡的细胞和生成的细胞数量基本达成平衡，死亡的细胞和生成的细胞数量基本达成平衡，总体数量基本不增加；总体数量基本不增加；n衰亡期：衰亡期：细胞死亡速度加快，细胞开始快速自溶、死细胞死亡速度加快，细胞开始快速自溶、死亡。亡。培养过程：培养过程：采用生物反应器技术进行植物细胞大规模培养采用生物反应器技术进行植物细胞大规模培养是目前一项重要的生物工程技术，包括三步：是目前一项重要的生物工程技术，包括三步：n细胞的驯化、筛选与细胞株的建立；细胞的驯化、筛选与细胞株的建立；n扩大培养扩大培养n生物反应器培养生物反应器培养细胞的驯化、筛选与细胞株的建立细胞的驯化、筛选与细胞株的建立n诱导愈伤诱导愈伤摇床或

28、转床培养使细胞分摇床或转床培养使细胞分散，增殖；散，增殖；n反复多次固液替换培养进行驯化；反复多次固液替换培养进行驯化；n适合大规模培养的细胞株具备条件：适合大规模培养的细胞株具备条件：生长速度要快；生长速度要快；目的物质含量高目的物质含量高适合悬浮培养。适合悬浮培养。细胞的驯化、筛选与细胞株的建立细胞的驯化、筛选与细胞株的建立建立和筛选细胞株的方法：建立和筛选细胞株的方法：n愈伤组织的诱导与培养愈伤组织的诱导与培养n单细胞分离；单细胞分离；n细胞无性系的分离：反复多次固液替换培养进行驯化；细胞无性系的分离：反复多次固液替换培养进行驯化；n细胞株的筛选：细胞株的筛选：适合大规模培养的细胞株具备

29、条件：适合大规模培养的细胞株具备条件：生长速度要快；生长速度要快；目的物质含量高目的物质含量高适合悬浮培养。适合悬浮培养。扩大培养扩大培养n采用逐级增加体积的容器将优良的采用逐级增加体积的容器将优良的细胞株经过扩大繁殖得到大量细胞细胞株经过扩大繁殖得到大量细胞作为附、生物反应器培养的种子。作为附、生物反应器培养的种子。生物反应器培养生物反应器培养n利用传统发酵工程技术，优化培养工艺，大利用传统发酵工程技术，优化培养工艺，大量生产出植物细胞用作目的产物的提取分量生产出植物细胞用作目的产物的提取分离。离。n生物反应器类型：生物反应器类型：要求：要求：合适的氧传递、良好的流动性、低合适的氧传递、良好

30、的流动性、低的剪切力。的剪切力。n机械搅拌式（剪切力强）、鼓泡塔式（混合机械搅拌式（剪切力强）、鼓泡塔式（混合效果差）和气升循环式如：效果差）和气升循环式如：气升环流式生物反应器气升环流式生物反应器培养紫草细胞培养紫草细胞 搅拌式生物反应器搅拌式生物反应器悬浮培养水母雪莲细胞悬浮培养水母雪莲细胞植物细胞生物反应器培养存在的问题植物细胞生物反应器培养存在的问题n少量植物细胞细胞培养实现工业化，两步法生产紫草少量植物细胞细胞培养实现工业化，两步法生产紫草宁、迷迭香宁酸、肉桂酰丁二胺宁、迷迭香宁酸、肉桂酰丁二胺n通气和搅拌引起流体压力对细胞损伤，大量泡沫的生通气和搅拌引起流体压力对细胞损伤，大量泡沫

31、的生成；成；n高密度引起培养液年度增加，影响细胞对营养的吸引高密度引起培养液年度增加，影响细胞对营养的吸引及气体传递；及气体传递；n反应器结构缺陷因素：死角反应器结构缺陷因素：死角n对产物相关积累的机制、途径等尚不清楚。对产物相关积累的机制、途径等尚不清楚。（七）植物细胞两相培养技术（七）植物细胞两相培养技术定义：定义：n在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢物质分泌出来后细胞在水相中生长，合成的次生代谢物质分泌出

32、来后转移到有机相中。转移到有机相中。优点：优点：n减少产物的反馈抑制作用，提高产物含量；减少产物的反馈抑制作用，提高产物含量；n可存进细胞内部的产物分泌可存进细胞内部的产物分泌n如紫草细胞悬浮培养是加入十六烷可使含量提高如紫草细胞悬浮培养是加入十六烷可使含量提高7.4倍，倍，并且可原位提取紫草素。并且可原位提取紫草素。建立植物细胞两相培养技术系统建立植物细胞两相培养技术系统必须满足以下条件必须满足以下条件n添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无害；添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无害；n产物能较容易地被有机物吸附或溶解于有机相产物能较容易地被有机物吸附或溶解于有机相中；中；n两相之间的分离容易

33、；两相之间的分离容易；n有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。成分。（八）植物细胞的生物反应器固定化培养（八）植物细胞的生物反应器固定化培养n细胞固定化定义与意义细胞固定化定义与意义n植物细胞固定化方法植物细胞固定化方法n固定化细胞的活力测定固定化细胞的活力测定n植物细胞固定化生物反应器培养植物细胞固定化生物反应器培养1.1.细胞固定化定义与意义细胞固定化定义与意义1970年成功年成功定义：定义：n指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物中制备成的指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物中制备成的网状支持物中、培养液呈流动状态进行无菌培养的一网状支持物中

34、、培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术；门技术；n适合于细胞培养生产活性代谢产物适合于细胞培养生产活性代谢产物优势：优势：n细胞生长缓慢利于次生代谢产物的积累细胞生长缓慢利于次生代谢产物的积累n易于控制化学环境、收获次生代谢产物易于控制化学环境、收获次生代谢产物n细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小n有利于连续培养和生物转化有利于连续培养和生物转化植物细胞固定化方法：植物细胞固定化方法：固定的方法固定的方法n凝胶包埋凝胶包埋n表面吸附表面吸附n网格或泡沫材料固定网格或泡沫材料固定n膜固定膜固定经常采用的固定剂经常采用的固定剂n由带点多聚物的离子交联形成胶体：由

35、带点多聚物的离子交联形成胶体：海藻酸盐海藻酸盐n由热的多聚物冷却形成胶体：琼脂、琼脂糖、由热的多聚物冷却形成胶体：琼脂、琼脂糖、卡拉胶卡拉胶n由发生化学反应形成胶体，聚丙酰胺由发生化学反应形成胶体，聚丙酰胺植物细胞固定化生物反应器培养植物细胞固定化生物反应器培养特点：细胞固定培养液体循环；适合体外分泌产特点：细胞固定培养液体循环；适合体外分泌产物的细胞的培养物的细胞的培养种类：种类：n流化床生物反应器流化床生物反应器n填充床是生物反应器填充床是生物反应器n膜生物反应器膜生物反应器九、植物细胞培养存在的问题九、植物细胞培养存在的问题及发展趋势及发展趋势存在问题：存在问题：n1.1.倍增时间长，倍

36、增时间长，2060h2060h，对无菌要求高；，对无菌要求高；n2.2.细胞易聚集成团；细胞易聚集成团；n3.3.容易变异；容易变异；n植物反应器的放大问题一直是一个限制产业化的问题。植物反应器的放大问题一直是一个限制产业化的问题。发展趋势：发展趋势：n高效细胞系的筛选；高效细胞系的筛选；n发展大规模细胞培养所用的培养基；发展大规模细胞培养所用的培养基；n开发出适合植物细胞大规模培养的生物反应器；开发出适合植物细胞大规模培养的生物反应器；n两相培养、固定化培养技术是极具发展前景的技术两相培养、固定化培养技术是极具发展前景的技术n对细胞分化、此生代谢物和培养条件之间的关系等进行基础研究。对细胞分

37、化、此生代谢物和培养条件之间的关系等进行基础研究。细胞培养的关键问题细胞培养的关键问题n1.1.培养基的选择要合适培养基的选择要合适n2.2.培养材料要正常、损伤要小（机械、酶等）培养材料要正常、损伤要小（机械、酶等）n3.3.细胞密度要合适，太大、太小都不宜保存细胞密度要合适，太大、太小都不宜保存n4.4.及时传代及时传代1）固体培养）固体培养n平板培养平板培养，将一定浓度细胞的液体培养基涂抹在固，将一定浓度细胞的液体培养基涂抹在固体培养基表面（动物、植物、微生物适用）体培养基表面（动物、植物、微生物适用）n划线培养基划线培养基：将沾有一定浓度细胞的液体培养基在：将沾有一定浓度细胞的液体培养

38、基在固体培养基上划成工形的线，培养基可以是平面或固体培养基上划成工形的线，培养基可以是平面或斜面。多用于微生物。斜面。多用于微生物。n混合培养混合培养：将一定体积含有一定浓度细胞的少量液：将一定体积含有一定浓度细胞的少量液体培养基与快要凝固的固体培养基混合让细胞嵌入体培养基与快要凝固的固体培养基混合让细胞嵌入其中。其中。n饲养场培养：饲养场培养：用用X X射线等处理细胞，让其无活性，分射线等处理细胞，让其无活性，分裂很慢，以此作为饲养细胞，再与所以培养的细胞裂很慢，以此作为饲养细胞，再与所以培养的细胞（靶细胞）混合于固体培养中，饲养细胞提供合适（靶细胞）混合于固体培养中，饲养细胞提供合适的环境又不与靶细胞争夺营养。的环境又不与靶细胞争夺营养。