土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（用）.ppt

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1、1 1、思考：、思考：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。热泉，热泉，因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝淘汰了绝大多数微生物只有大多数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。科学家要提取耐高温科学家要提取耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶聚合酶应去哪里找？应去哪里找？15.0g琼脂琼脂1.0g尿素尿素10.0g葡萄糖葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO42 2 2 2、土壤中分解尿素的细菌的分离与计

2、数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：氮源：氮源：尿素尿素尿素尿素这种培养基对微生物的培养有什么作用？这种培养基

3、对微生物的培养有什么作用？选择作用选择作用,只有能分解尿素，以其作为氮源的只有能分解尿素，以其作为氮源的的微生物才能生长。的微生物才能生长。这种培养基叫做这种培养基叫做选择培养基。选择培养基。15.0g琼脂琼脂1.0g尿素尿素10.0g葡萄糖葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，乏氮源而不能生长发育繁殖，而

4、受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。微生物。5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血细胞计数板血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。里样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.2.稀释涂布平板法稀释涂

5、布平板法原理原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。单细胞。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌

6、落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低。低。设设置对照的主要目的置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验

7、时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基倍稀释的培养基中筛选出大约中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约的稀释度下只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原原因因：土土样样不不同同，培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误(或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土

8、样进行实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取

9、样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行进行进行进行分离不同的微生物采用不同的稀分离不同的微生物采用不同的稀释度释度原因：不原因：不同微生

10、物在土壤中含量同微生物在土壤中含量不同不同目的：保目的：保证获得菌落数在证获得菌落数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的数的平板平板 三三三三 样品的稀释样品的稀释样品的稀释样品的稀释为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好

11、氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。.取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上

12、菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30303030300300300300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要

13、重新实验。3自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生 物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下 面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。实验步骤：实验步骤：(1)制备稀释倍数为制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。的系列稀释液。(2)为了得到更加准确的结果，你选用为了得到更加准确的结果，你选用_法接种样品。法接种样品。(3)适宜温度下培养。适宜温度下培养。稀释涂布平板稀释涂布平板结果分析：结果分析

14、：(1)测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为106的培养基中，的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是得到以下几种统计结果，正确可信的是_，其理，其理 由是由是_。A一个平板，统计的菌落数是一个平板，统计的菌落数是230 B两个平板，统计的菌落数是两个平板，统计的菌落数是220和和260，取平均值，取平均值240 C三个平板，统计的菌落数分别是三个平板，统计的菌落数分别是210、50和和520，取平，取平 均值均值260 D四个平板，统计的菌落数分别是四个平板，统计的菌落数分别是210、300、240和和 250，取平均值，取平均值250 一定要涂布至

15、少三个平板作为重复组，要一定要涂布至少三个平板作为重复组，要考虑所设置的重复组的结果是否相当考虑所设置的重复组的结果是否相当D(2)一同学在稀释倍数为一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的的培养基中测得平板上菌落数的 平均值为平均值为234，那么每毫升样品中的菌落数是，那么每毫升样品中的菌落数是_(涂布平板时所用稀释液的体积为涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)。(3)用这种方法测定的大肠杆菌密度，实际活菌数量要比测用这种方法测定的大肠杆菌密度，实际活菌数量要比测 得的数量得的数量_，因为，因为_。2.34108当两个或多个细胞连在一起时，平板上观当两个或多个细胞连在一起时

16、，平板上观察到的是一个菌落察到的是一个菌落多多微微生生物物的的培培养与观察养与观察五五.课外延伸课外延伸 在在以尿素为唯一氮源的培养基中加入以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂酚红指示剂。培养某种细菌后，如果。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放用细菌过滤器过滤后，将滤膜放用细菌过滤器过滤后，将滤膜放用细菌过滤

17、器过滤后，将滤膜放到到到到伊红伊红伊红伊红美蓝美蓝美蓝美蓝 培养基培养基培养基培养基上培养，大肠杆菌上培养，大肠杆菌上培养，大肠杆菌上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出水，通过记述得出水，通过记述得出水，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。样中大肠杆菌的数量。样中大肠杆菌的数量。样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 计数法计数法显微镜直接计数（抽样检测法）显微镜直接计数（抽样检测法）稀释涂布平板法稀释涂布平板法滤膜法滤

18、膜法1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性表现某微生物的特定性状与状与其他微生物加以区别其他微生物加以区别2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练C CD D3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从

19、科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。

20、B BC C4分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是求是()加尿素加尿素 不加尿素不加尿素加琼脂糖加琼脂糖不加琼脂糖不加琼脂糖 加葡萄糖加葡萄糖不加葡萄糖不加葡萄糖加硝酸盐加硝酸盐 不加硝酸盐不加硝酸盐ABC DC 5(2012西城模拟西城模拟)下列关于微生物培养和利用下列关于微生物培养和利用的叙述不正确的是的叙述不正确的是()A利用稀释涂布平板法只能分离微生物不能对利用稀释涂布平板法只能分离微生物不能对微生物进行计数微生物进行计数B接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单菌落稀释获得单菌落C以尿素为唯一氮

21、源且含酚红的培养基可选择以尿素为唯一氮源且含酚红的培养基可选择和鉴别尿素分解菌和鉴别尿素分解菌D用大白菜腌制泡菜的过程中亚硝酸盐含量变用大白菜腌制泡菜的过程中亚硝酸盐含量变化是先增加后减少化是先增加后减少A 6(2012赤峰质检赤峰质检)下表下表为为某培养基的配方，有关某培养基的配方，有关叙述正确的是叙述正确的是()成成分分牛肉牛肉膏膏葡萄葡萄糖糖K2HPO4伊伊红红美美蓝蓝青霉青霉素素琼琼脂脂蒸蒸馏馏水水含含量量10 g10 g2 g0.4 g0.065 g1万万单单位位适适量量1000 mLA能在此培养基上生能在此培养基上生长长的大的大肠肠杆菌，杆菌，拟拟核上有核上有抗青霉素的基因抗青霉素

22、的基因B此培养基是天然此培养基是天然鉴别鉴别培养基培养基C此培养基可以用来此培养基可以用来检测检测自来水中自来水中细细菌含量是菌含量是否符合否符合饮饮用水用水标标准准D此培养基可以用于此培养基可以用于选选育育转转基因大基因大肠肠杆菌菌种杆菌菌种的基因工程的操作的基因工程的操作过过程中程中D 7(双选双选)下列是关于下列是关于“检测土壤中细菌总数检测土壤中细菌总数”实实验操作的叙述，其中错误的是验操作的叙述，其中错误的是()A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板高压灭菌后倒平板D取取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，将实验组和对照组平板倒置，27恒温培养恒温培养2448小时小时D确定对照组无菌后，选择菌落数在确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的以上的实验组平板进行计数实验组平板进行计数CD