血红蛋白的提取与分离.ppt

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1、课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离思考思考:蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：分离蛋白分离蛋白质的方法质的方法 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的（内含许多贯穿的通

2、道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）具多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分子质量分离物质的蛋白质相对分子质量的大小的大小，利用具有网状结构的凝胶的分，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。子筛作用，来进行分离。3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（），移动速），移动速度（度（），而（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（在

3、（）移动，路程（）移动，路程（），），移动速度（移动速度（），相对分子质量不同），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。的蛋白质因此得以分离。4、具体过程、具体过程相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快凝胶色谱法凝胶色谱法1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是蛋白质的叙述，正确的是()A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对相对分子质量较小的蛋白

4、质行程小于相对分子质量较大的蛋白质分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较 2、原理、原理：在电场的作用下，这些带电分子：在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）以及分子本身（）、（）、（）的的不同使带电分子产生不同的（不同使带电分子产生不同的（），），从而实现样品中各种分子的分离。从而实现样品中各种分子的分离。所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差

5、异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度二二.电泳电泳(各种分子分离方法各种分子分离方法)1、概念：指带电粒子在电场作用下发生、概念：指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。迁移的过程。琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。3.分类：分类：分子小迁移速度快分子小迁移速度快使用使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量电泳检测结果电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于()A 电荷的多少

6、电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异三三.实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤a.低速短时间离心低速短时间离心b.加入生理盐水加入生理盐水直至上清液中已没直至上清液中已没有（有（），表明），表明洗涤干净洗涤干净黄色黄色(2)血红蛋白的释血红蛋白的释放放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液2000r/min的速度离的速度离

7、心心10 min2.2.粗分离粗分离:透析过程透析过程(透析除去分子较小的杂质透析除去分子较小的杂质)3.3.纯化：通过凝胶色谱法纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的将分子量较大的杂质蛋白质除去杂质蛋白质除去4.4.纯度鉴定：通过纯度鉴定：通过SDSSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定鉴定使用使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量假设白化病基因与相对应的正常基因相比，白化基因缺假设白化病基因与相对应的正常基因相比，白化基因缺失了一失了一个限制酶的切点。图二表示甲、乙、丙个限制酶的切点。图二表示甲、乙、丙3人白化基因人白化基因或相对应正常基因的核酸分子杂交诊断结果示意图。或相对应正常基因的核酸分子杂交诊断结果示意图。(A对对 a为显性为显性)（1 1）由图二可以判断出乙和丙的基因型分别是）由图二可以判断出乙和丙的基因型分别是 。