核酸的重要理化性质.ppt

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1、一、核酸的一般物理性质一、核酸的一般物理性质nDNADNA为白色纤维状固体，为白色纤维状固体，RNARNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂机溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀核酸）（用乙醇从溶液中沉淀核酸）nDNADNA和和RNARNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。的溶解度不同。DNADNA核蛋白核蛋白 RNARNA核蛋白核蛋白 0.14 0.14mol/mol/LNaCl

2、LNaCl -+-+1-2mol/1-2mol/LNaCl LNaCl +-+-DNADNA溶液的粘度很大，而溶液的粘度很大，而RNARNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。降解后其粘度降低。核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。度与核酸的大小和密度有关。第四节第四节 核酸的重要理化性质核酸的重要理化性质二、二、核酸的两性性质及等电点核酸的两性性质及等电点n与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸

3、基）也含有弱碱性基团碱基，因而核酸也具有两性性质。也含有弱碱性基团碱基，因而核酸也具有两性性质。n由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。（当核酸分子内（当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸溶液的荷相等时，此时核酸溶液的pHpH值即为核酸的等电点值即为核酸的等电点pIpI）如如DNADNA的等电点为的等电点为4 44.54.5，RNARNA的等电点为的等电点为2 22.52.5。核酸

4、。核酸在其等电点时溶解度最小。在其等电点时溶解度最小。nRNARNA的等电点比的等电点比DNADNA低的原因，是低的原因，是RNARNA分子中核糖基分子中核糖基2-2-OHOH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNADNA没有这种没有这种作用。作用。三、核酸的水解三、核酸的水解1.1.核酸的酸解和碱解核酸的酸解和碱解 n核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断（降解降解）。）。n酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间不同而不酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间不同而不同。嘌呤碱基比嘧啶碱基易被水解下

5、来。同。嘌呤碱基比嘧啶碱基易被水解下来。nDNADNA和和RNARNA对碱的耐受程度有很大差别。例如，在对碱的耐受程度有很大差别。例如，在0.3-1 0.3-1 mol/L mol/L NaOHNaOH溶液中，在室温至溶液中，在室温至37370 0C C条件下条件下RNARNA几乎可以几乎可以完全水解，生成完全水解，生成2-2-或或3-3-磷酸核苷；磷酸核苷；DNADNA在同样条件在同样条件下则不受影响，若加温至下则不受影响，若加温至1001000 0C C，4 4个小时也可得到小分个小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。这种水解性能上的差别，与子的寡聚脱氧核苷酸。这种水解性能上的差别，与RNA

6、RNA核糖基上核糖基上2-2-OHOH的羟基参与作用有很大的关系。在的羟基参与作用有很大的关系。在RNARNA水解时，水解时，2-2-OHOH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。2 2、核酸的酶解、核酸的酶解n生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。链中的磷酸二酯键。n以以DNADNA为底物的为底物的DNADNA水解酶（水解酶（DNasesDNases）和以和以RNARNA为底物的为底物

7、的RNARNA水解酶水解酶（RNasesRNases）。）。n根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。n核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3-3-端或端或5-5-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。（小球菌核酸酶即可外切又可内切）二酯键。（小球菌核酸酶即可外切又可内切）n在在分分子子生生物物学

8、学研研究究中中最最有有应应用用价价值值的的是是限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶。这这种种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。四、核酸的紫外吸收四、核酸的紫外吸收n在核酸分子中，由于嘌在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，特的紫外线吸收光谱，一般在一般在260260nmnm左右有最左右有最大吸收峰，可以作为核大吸收峰，可以作为核酸及其组分定性和定量酸及其组分定性和定量测定的依据。测定的依据。五核酸的变性、复性与杂交五核酸的变性、复性与杂交1.1.核酸的变性（核

9、酸的变性（denaturationdenaturation）与变性因素与变性因素n核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构断裂，所以它的一级结构(碱基顺序碱基顺序)保持不变。保持不变。n能能够够引引起起核核酸酸变变性性的的因因素素很很多多。温温度度升升高高、酸酸碱碱度度改改变变、甲甲醛醛和和尿尿素素等等的的存存在在均均可可引引起起核核酸酸的的变变性。性。nRNAR

10、NA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有所引起的性质变化没有DNADNA那样明显。那样明显。n利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。情况。因为天然状态的因为天然状态的DNADNA在完全变性后，紫外吸收在完全变性后，紫外吸收(260(260 nm)nm)值增加值增加252540%.40%.而而RNARNA变性后，约增变性后，约增加加1.1%1.1%。n增色效应增色效应：变性后：变性后DNADNA对对260260nmnm紫外光的吸收紫外光的吸收率（率（A A260260）比变性前明显增加，这种现象称

11、为比变性前明显增加，这种现象称为增色效应增色效应.nA260值增加n粘度下降n浮力密度增大n分子量不变2.2.DNADNA变性后的表现变性后的表现3.3.DNADNA的热的热变性和解链温度（变性和解链温度（TmTm）n用加热的方法使用加热的方法使DNADNA变性叫做变性叫做热变性热变性nDNADNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，间内完成。因此，通常将通常将DNADNA的变性达到的变性达到50%50%时，时，即增色效应达到一半时的温度称为即增色效应达到一半时的温度称为DNADNA的解链温的解链温度（度（melting temperat

12、ure,Tmmelting temperature,Tm）,Tm,Tm也称熔解温也称熔解温度或度或DNADNA的熔点。的熔点。一般一般DNADNA的的T Tm m值在值在70-8570-85 C C之间之间RNA的T m值tRNA的T m值G G和和C C的含量高，的含量高，T Tm m值高值高。因而测定。因而测定TmTm值，可反映值，可反映DNADNA分子中分子中G G、C C含量，可通过经验公式计算：含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44G+C)%=(Tm-69.3)X2.44TmTm大小可反映出大小可反映出DNADNA的均一性的均一性：均质：均质DNADNA

13、的熔解过程发生在一个较的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质小的温度范围内；异质DNADNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。围内。TmTm与介质中离子强度有关：与介质中离子强度有关：DNADNA的保存应在含盐的缓冲液中的保存应在含盐的缓冲液中温度温度/0 0C CA A2602600.020.10.11.01.0mol/LKClDNADNA变性（变性（加热或极端加热或极端pHpH）n当当DNADNA的稀盐溶的稀盐溶液加热到液加热到80-80-100100时，双螺时，双螺旋结构即发生解旋结构即发生解体，两条链彼此体，两条链彼此分开，形成无规分开，形成无规

14、线团。线团。nDNADNA变性后，它变性后，它的一系列性质也的一系列性质也随之发生变化，随之发生变化，如紫外吸收如紫外吸收(260(260 nm)nm)值升高值升高,粘粘度降低等。度降低等。4 4、核酸的复性、核酸的复性n变性变性DNADNA在适当的条件下在适当的条件下，两条彼此分开的单链，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复复性性。DNADNA复性后，一系列物理、化学性质将得到复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。恢复。DNADNA复性的程度、速率与复性过程的条件复性的程度、速率与复性过程的条件有关。有关。n将将热热变变性性的

15、的DNADNA骤骤然然冷冷却却至至低低温温时时，DNADNA不不可可能能复复性性。但但是是将将变变性性的的DNADNA缓缓慢慢冷冷却却时时，可可以以复复性性，这这一一过过程程也也叫叫退退火火（annealing)annealing)。分分子子量量越越大大复复性性越越难难。浓浓度度越越大大，复复性性越越容容易易。此此外外，DNADNA的的复性也与它本身的组成和结构有关。复性也与它本身的组成和结构有关。n复复性性反反应应的的速速度度用用CotCot1/21/2表表示示。CoCo为为变变性性DNADNA复复性性时的浓度，时的浓度，t t为时间，以秒表示。（为时间，以秒表示。（P352P352）DNA

16、DNA复性复性5 5、核酸的杂交、核酸的杂交（hybridizationhybridization）n热变性的热变性的DNADNA单链，在复性时并不一定与同源单链，在复性时并不一定与同源DNADNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源有互补序列的异源DNADNA单链形成双螺旋结构。单链形成双螺旋结构。n这样形成的新分子称为杂交这样形成的新分子称为杂交DNADNA分子。分子。DNADNA单链与单链与互补的互补的RNARNA链之间也可以发生杂交。链之间也可以发生杂交。n核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。重要意义。核核酸酸的的杂杂交交核酸杂交的应用核酸杂交的应用nSouthern blotting(Southern Southern blotting(Southern 印迹印迹)nNorthern blotting(Northern Northern blotting(Northern 印迹印迹)nWestern blotting(Western Western blotting(Western 印迹印迹)