第九章 抗生素类药物的分析.ppt

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1、第九章第九章 抗生素类药物分抗生素类药物分析与生物检定法析与生物检定法第九章第九章 抗生素类药物分析与生物抗生素类药物分析与生物检定法检定法基本要求：基本要求：了解药物的特点及效价的表示方法，掌握抗生素的鉴了解药物的特点及效价的表示方法，掌握抗生素的鉴别方法，熟悉抗生素含量的理化测定方法，熟悉微生别方法，熟悉抗生素含量的理化测定方法，熟悉微生物检定方法的原理及种类，掌握抗生素效价测定的计物检定方法的原理及种类，掌握抗生素效价测定的计算式，熟悉影响抗生素效价测定的因素，了解管碟法算式，熟悉影响抗生素效价测定的因素，了解管碟法测定的操作步骤，了解管碟法测定所使用的基本设备、测定的操作步骤，了解管碟

2、法测定所使用的基本设备、用具和试验材料，理解总体与样本、概率、自由度、用具和试验材料，理解总体与样本、概率、自由度、标准差、变异系数、标准误、标准差、变异系数、标准误、t t值、可信限、误差项、值、可信限、误差项、回归的统计含义，掌握随机设计和随机区组设计，理回归的统计含义，掌握随机设计和随机区组设计，理解解t t测验、测验、F F测验和测验和X X2 2测验，了解可靠性测验的目的，测验，了解可靠性测验的目的，掌握生物统计法计算抗生素效价的方法。掌握生物统计法计算抗生素效价的方法。第九章第九章 抗生素类药物分析与生物抗生素类药物分析与生物检定法检定法基本内容：基本内容：第一节第一节 抗生素类药

3、物分析抗生素类药物分析一、抗生素药物一、抗生素药物二、抗生素的鉴别与含量测定二、抗生素的鉴别与含量测定第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法一、微生物检定方法一、微生物检定方法二、管碟法测定效价二、管碟法测定效价第三节第三节 生物统计法在抗生素效价检定中的应用生物统计法在抗生素效价检定中的应用一、基本概念一、基本概念二、抗生素效价测定生物统计计算步骤二、抗生素效价测定生物统计计算步骤第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析一、抗生素药物一、抗生素药物1 1、抗生素、抗生素抗生素抗生素是指在是指在低微浓度低微浓度下即可对某些生命活动有下即可对某些生命活动有特异特异抑

4、制作用抑制作用的化学物质。的化学物质。抗生素主要是抗生素主要是细菌、放线菌和真菌细菌、放线菌和真菌等微生物的等微生物的代谢产代谢产物物，对各种病原微生物有强大的，对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭抑制或杀灭作用。作用。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析2 2、抗生素药物的特点及检查项目、抗生素药物的特点及检查项目抗生素药物具有以下特点：抗生素药物具有以下特点：（1 1）结构、组成复杂结构、组成复杂 经过微生物发酵，化学纯化，经过微生物发酵，化学纯化，精致，化学修饰等过程，最后制成制剂。精致，化学修饰等过程，最后制成制剂。（2 2）化学纯度低化学纯度低 同系物多，异构体多，降解物多。

5、同系物多，异构体多，降解物多。发酵过程不易控制。生产工艺复杂易受污染。分子结发酵过程不易控制。生产工艺复杂易受污染。分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用。活性产物易发生变异。用。活性产物易发生变异。（3 3）稳定性差稳定性差 抗生素分子结构中通常含有活泼基团抗生素分子结构中通常含有活泼基团（往往是抗生素的活性中心）。（往往是抗生素的活性中心）。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析抗生素药物的抗生素药物的检查项目检查项目包括包括：鉴别试验鉴别试验异常毒性试验异常毒性试验无菌试验无菌试验热原试验热原试验降压试验降压试验酸碱度

6、试验酸碱度试验水分测定水分测定溶液澄清度检查溶液澄清度检查效价测定效价测定其他检测（抗生素组分、有关物质、比重度、熔点、其他检测（抗生素组分、有关物质、比重度、熔点、晶型、溶媒残留量、重金属、溶出度等）。晶型、溶媒残留量、重金属、溶出度等）。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析3 3、抗生素效价单位、抗生素效价单位抗生素效价的标示量，原则上应按抗生素效价的标示量，原则上应按所含特定的抗菌活所含特定的抗菌活性部分的重量性部分的重量来计算。来计算。在应用中，抗生素类药物有效成分的表示方法，是在应用中，抗生素类药物有效成分的表示方法，是按按照各种抗生素的特点照各种抗生素的特点及及使用经验使

7、用经验，采用符合客观实际，采用符合客观实际的效价单位表示。的效价单位表示。常用的抗生素效价单位有常用的抗生素效价单位有重量单位重量单位、类似重量单位类似重量单位、重量折算单位重量折算单位、特定单位特定单位。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（1 1）重重量量单单位位 以以抗抗生生素素中中所所含含特特定定的的抗抗菌菌活活性性部部分分（纯纯游游离离碱碱或或游游离离酸酸）的的重重量量1g1g作作为为1 1单单位位，即即1mg=10001mg=1000单位。单位。如如链链霉霉素素、红红霉霉素素、卡卡那那霉霉素素、新新霉霉素素、庆庆大大霉霉素素、土土霉霉素素；氯氯霉霉素素、新新生生霉霉素素酸

8、酸、利利福福霉霉素素SVSV等等均均以以重重量单位表示。量单位表示。用用这这种种方方法法表表示示，对对不不同同有有机机酸酸根根的的同同一一抗抗生生素素，只只要要单单位位一一样样或或有有效效部部分分重重量量一一样样，则则这这一一抗抗生生素素的的各各种盐类虽然种盐类虽然称重不同称重不同，但实际有效含量是相同的。，但实际有效含量是相同的。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（2 2）类类似似重重量量单单位位 以以特特定定的的纯纯抗抗生生素素制制品品盐盐的的重重量量1g1g作作为为一一个个单单位位，即即1mg1mg10001000单单位位，其其中中包包括括了了无抗菌活性的酸根在内无抗菌活性的

9、酸根在内。如四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）。如四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）。这这种种类类似似重重量量单单位位，虽虽然然并并不不合合理理，但但在在国国际际上上已已经经习惯沿用习惯沿用。（3 3）重重量量折折算算单单位位 以以特特定定的的纯纯抗抗生生素素制制品品的的某某一一重重量为一个单位量为一个单位而加以而加以折算折算。如如青青霉霉素素国国际际标标准准品品（19521952年年）青青霉霉素素G G钠钠称称重重0.5998g0.5998g为为1 1单单位位，即即1mg=16701mg=1670单单位位，则则8080万万单单位位的的青霉素青霉素G G钠称重应为钠称重应为0.

10、48g0.48g。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（4 4）特定单位特定单位 以一以一特定量特定量的抗生素的抗生素标准品标准品（或对照（或对照品）作为品）作为1 1单位。单位。如第一批杆菌肽国际标准品（如第一批杆菌肽国际标准品（19531953年）杆菌肽年）杆菌肽A A为为1mg=551mg=55单位。单位。制霉菌素（制霉菌素（19631963年）为年）为1mg=30001mg=3000单位等。单位等。这类抗生素的效价单位的这类抗生素的效价单位的精确定义很难确定精确定义很难确定，折算效折算效价也难以计算价也难以计算，只能以，只能以国际标准品国际标准品的效价单位，作为的效价单位，作

11、为比较的基准。比较的基准。目前，抗生素的剂量原则上以目前，抗生素的剂量原则上以纯品的重量表示纯品的重量表示，并，并加加注单位注单位。如土霉素。如土霉素0.25g0.25g（250000250000单位）；但个别品单位）；但个别品种仍以习惯沿用，如青霉素仍用单位表示剂量。种仍以习惯沿用，如青霉素仍用单位表示剂量。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析4 4、抗生素微生物检定用标准品、抗生素微生物检定用标准品标准品标准品是指与商品是指与商品同质同质且且纯度较高纯度较高的抗生素，每的抗生素，每1mg1mg含含有一定的活性单位，用作供试品效价测定时的标准。有一定的活性单位，用作供试品效价测定时

12、的标准。国际标准品国际标准品是经过国际是经过国际有关机构协议认定有关机构协议认定的每的每1mg1mg含有含有一定单位的标准品。其单位称为一定单位的标准品。其单位称为国际单位国际单位。抗生素标准品效价单位的含义，世界各国应一致。抗生素标准品效价单位的含义，世界各国应一致。抗生素的国际标准品是在抗生素的国际标准品是在联合国世界卫生组织生物检联合国世界卫生组织生物检定专家委员会定专家委员会主持下，委托主持下，委托英国（伦敦）国立生物标英国（伦敦）国立生物标准检定所准检定所负责（如标准品原料的挑选、理化分析、分负责（如标准品原料的挑选、理化分析、分装与分发等）。装与分发等）。第一节第一节 抗生素类药物

13、分析抗生素类药物分析国际标准品效价单位的国际标准品效价单位的标定标定由由世界卫生组织世界卫生组织邀请有条邀请有条件的件的国家检定所国家检定所或或药厂实验室药厂实验室，对准备作为国际标准，对准备作为国际标准品的抗生素，进行品的抗生素，进行协作效价标定协作效价标定，然后通过，然后通过统计分析统计分析，观察标定结果的误差和真实性，最后由观察标定结果的误差和真实性，最后由生物检定专家生物检定专家委员会通过决定委员会通过决定。我国自我国自19761976年起参加了部分品种的国际协作标定。年起参加了部分品种的国际协作标定。国际标准品国际标准品主要提供各国在主要提供各国在标定标定本国本国国家标准品国家标准品

14、时作时作对照品。对照品。凡国际上已制备的国际标准品的品种，在制备国家标凡国际上已制备的国际标准品的品种，在制备国家标准品时，准品时，均应与国际标准品比较而确定效价均应与国际标准品比较而确定效价。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析我国抗生素国家标准品就是按上述原则制订的。我国抗生素国家标准品就是按上述原则制订的。但是我国但是我国的特有品种的特有品种则以理论上的则以理论上的纯品一定量定为纯品一定量定为1 1个个单位单位，即为，即为1g1g，以，以某批精制纯品作为原始标准品某批精制纯品作为原始标准品，再去再去标定标定暂行标准品或国家标准品。暂行标准品或国家标准品。我国药典和部颁标准所规定

15、的我国药典和部颁标准所规定的抗生素效价检定用标准抗生素效价检定用标准品品，是由，是由中国人民共和国卫生部中国人民共和国卫生部主持，由主持，由中国药品生中国药品生物制品检定所物制品检定所统一负责，与国内有关的统一负责，与国内有关的药检所药检所或或药厂药厂对原料进行选择，对原料进行选择，理化分析理化分析、协作标定效价单位协作标定效价单位、分分装装、稳定性考查稳定性考查、分发分发等工作。等工作。每批标准品都有每批标准品都有有效期有效期的规定。的规定。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析表表9-1 常用抗生素理论效价和国家规定产品效价常用抗生素理论效价和国家规定产品效价第一节第一节 抗生素类

16、药物分析抗生素类药物分析表表9-1 常用抗生素理论效价和国家规定产品效价常用抗生素理论效价和国家规定产品效价（续）（续）第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析二、抗生素的鉴别与含量测定二、抗生素的鉴别与含量测定1 1、抗生素的鉴别、抗生素的鉴别抗生素包括很多种类，如抗生素包括很多种类，如-内酰胺类、氨基糖苷类、内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类、林可霉素类、其他抗生素类等。类、林可霉素类、其他抗生素类等。这里以这里以-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素为例，讲述抗生素的鉴别方为例，讲述抗生素的鉴别方法。法。该类

17、抗生素包括该类抗生素包括典型典型-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素，如青霉素类，如青霉素类（PenicillinsPenicillins）、头孢菌素类（）、头孢菌素类（CephalosporinsCephalosporins）；）；非典型非典型-内酰胺类内酰胺类如克拉维酸（如克拉维酸（clavulanicacidclavulanicacid）、）、噻纳霉素（噻纳霉素（ThienamycinThienamycin）和）和SulfazecinsSulfazecins等。等。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析它们的分子结构特征是分子中含有它们的分子结构特征是分子中含有-内酰胺环内酰胺环。该类

18、抗生素的鉴别方法分为该类抗生素的鉴别方法分为呈色反应呈色反应、各种盐反应各种盐反应、光谱法光谱法、色谱法色谱法和和酶法酶法。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（1 1）呈色反应呈色反应 羟肟酸铁反应羟肟酸铁反应 在在碱性溶液碱性溶液中与中与羟胺羟胺作用，作用，-内酰胺环破裂生成内酰胺环破裂生成羟肟酸羟肟酸，在稀酸中与，在稀酸中与高铁高铁离子呈色离子呈色。茚三酮反应茚三酮反应 含有含有-氨基的抗生素。氨基的抗生素。双缩脲反应双缩脲反应 含有含有-氨基的抗生素。氨基的抗生素。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析与与H H2 2SOSO4 4-HNO-HNO3 3反应反应 侧链

19、含有苯羟基基团时，能与重氮侧链含有苯羟基基团时，能与重氮苯磺酸试液产生偶合反应而呈色。如：苯磺酸试液产生偶合反应而呈色。如：本类药物还可与变色酸本类药物还可与变色酸-硫酸、硫酸硫酸、硫酸-硝酸、铜盐等试硝酸、铜盐等试剂反应产色。剂反应产色。与变色酸与变色酸-硫酸反应硫酸反应 青霉素、阿莫西林、氨苄西林含青霉素、阿莫西林、氨苄西林含有活泼有活泼“-CH“-CH2 2-”-”。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析与与变色酸变色酸-硫酸反应硫酸反应 青霉素、阿莫西林、氨苄西林含青霉素、阿莫西林、氨苄西林含有活泼有活泼“-CH“-CH2 2-”-”。与与铜盐反应铜盐反应第一节第一节 抗生素类

20、药物分析抗生素类药物分析（2 2）各种盐的反应各种盐的反应 焰色反应及验证焰色反应及验证遇酸生成沉淀遇酸生成沉淀有机胺盐反应有机胺盐反应（芳伯氨基）（芳伯氨基）第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（3 3）光谱法光谱法 IRIR法法 -内酰胺环：内酰胺环：仲酰胺仲酰胺：羧酸羧酸：第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析UVUV法法 样品、分解产物光谱图，样品、分解产物光谱图，maxmax，minmin，A A。头孢氨苄：头孢氨苄：maxmax=262nm=262nm青霉素青霉素V V钠：钠：A A280nm280nm/A/A264nm264nm=1.30=1.301.501.5

21、0第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（4 4）色谱法）色谱法 对照品对照法对照品对照法TLCTLC法法HPLCHPLC法法比较二者主峰的保留时间是否一致。比较二者主峰的保留时间是否一致。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（5 5）酶法酶法 青霉素酶法试验：青霉素酶法试验：第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析2 2、抗生素类药物含量的理化测定法、抗生素类药物含量的理化测定法抗生素类药物含量分析的测定方法分为抗生素类药物含量分析的测定方法分为理化方法理化方法和和生生物学方法物学方法。理化方法以化学、物理化学方法测定主药含量，理化方法以化学、物理化学方法测定主药含量

22、，准确准确度高度高、简单简单、快速快速，但，但不一定代表生物效价不一定代表生物效价，且，且易受易受杂质干扰杂质干扰。生物学方法主要是通过测定抗生素抑菌或杀菌的能力生物学方法主要是通过测定抗生素抑菌或杀菌的能力来表达其效价，来表达其效价，与临床效果一致与临床效果一致，灵敏度高灵敏度高，干扰物干扰物质少质少，但，但操作繁琐操作繁琐、培养、培养时间长时间长、测定、测定误差大误差大。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（1 1）容量法容量法（capacity testcapacity test）容量分析是依据已知浓容量分析是依据已知浓度的标准试剂溶液与被测定的一定量供试品药物度的标准试剂溶液

23、与被测定的一定量供试品药物完全完全作用所消耗的标准试剂的体积作用所消耗的标准试剂的体积，来计算被测定药物中，来计算被测定药物中有效物质含量的方法。有效物质含量的方法。在抗生素类药物分析中，常用的有在抗生素类药物分析中，常用的有酸碱滴定法酸碱滴定法、碘量碘量法法。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析酸碱滴定法酸碱滴定法 用于酸性抗生素类药物的用于酸性抗生素类药物的总酸量总酸量测定。测定。常用的方法有：常用的方法有：直接滴定法直接滴定法，即用已知浓度的碱标准溶液直接滴定抗，即用已知浓度的碱标准溶液直接滴定抗生素供试品溶液；生素供试品溶液；逆滴定法逆滴定法（剩余滴定法），即用一定量的已知浓

24、度的（剩余滴定法），即用一定量的已知浓度的碱标准溶液与抗生素供试品碱标准溶液与抗生素供试品中和后生成盐中和后生成盐，用已知浓，用已知浓度的度的酸标准溶液滴定剩余的碱酸标准溶液滴定剩余的碱。根据酸碱中和反应时的根据酸碱中和反应时的摩尔数关系摩尔数关系计算供试品中抗生计算供试品中抗生素的含量。素的含量。简便快速，简便快速，不适用于有残留酯的产品不适用于有残留酯的产品。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析例例1 1 青霉素含量的测定青霉素含量的测定青霉素在水溶液中经水解后，产生青霉噻唑酸，可用青霉素在水溶液中经水解后，产生青霉噻唑酸，可用酸碱滴定法测定。或用直接滴定法，或用逆滴法进行酸碱滴

25、定法测定。或用直接滴定法，或用逆滴法进行测定，最后均以测定，最后均以碱标准溶液的消耗量碱标准溶液的消耗量来计算青霉素的来计算青霉素的含量。含量。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析终点观察：用目视指示剂或电位滴定均可。终点观察：用目视指示剂或电位滴定均可。温度温度对指示剂的变色范围有影响。对指示剂的变色范围有影响。碱性指示剂碱性指示剂，温度温度升高升高时，对氢离子的时，对氢离子的灵敏度降低灵敏度降低，变色范围偏向较低，变色范围偏向较低的的pHpH值，如甲基橙在室温时为值，如甲基橙在室温时为pH 3.1pH 3.14.44.4，在，在100100时，移到时，移到2.52.53.73.7

26、。酸性指示剂对温度的影响不太敏酸性指示剂对温度的影响不太敏感。感。指示剂的指示剂的用量不宜多用量不宜多，过多时，因指示剂本身也消耗，过多时，因指示剂本身也消耗酸或碱，酸或碱，变色较慢变色较慢。在水溶液中，大部分羧酸在在水溶液中，大部分羧酸在pHpH约约8.48.4时中和，一般可用时中和，一般可用酚酞指示剂酚酞指示剂（无色到红色），也可采用（无色到红色），也可采用百里酚酞百里酚酞（无（无色到蓝色）或色到蓝色）或百里酚蓝百里酚蓝（黄色到蓝色）等。（黄色到蓝色）等。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析滴定剂的选择，一般选用滴定剂的选择，一般选用氢氧化钠氢氧化钠或或氢氧化钾氢氧化钾标准溶标准

27、溶液作滴定剂。液作滴定剂。标准碱液一般采用标准碱液一般采用新沸冷却蒸馏水新沸冷却蒸馏水进行稀释制备。进行稀释制备。贮存贮存标准碱液标准碱液的容器要密封，以免吸收的容器要密封，以免吸收二氧化碳二氧化碳而影而影响碱液质量。响碱液质量。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析例例2 2 青霉素钠的含量测定青霉素钠的含量测定精精密密称称取取本本品品约约0.30.30.4g0.4g，加加新新沸沸过过的的蒸蒸馏馏水水20mL20mL使使其其溶溶解解，加加0.01mol/L0.01mol/L氢氢氧氧化化钠钠液液中中和和后后，精精密密加加0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠液氢氧化钠液25mL25m

28、L，9595左右水浴左右水浴20min20min。冷冷却却后后，加加酚酚酞酞指指示示剂剂2 2滴滴，用用0.1mol/L0.1mol/L盐盐酸酸滴滴定定，从从粉红色至无色。粉红色至无色。不加供试样品作为空白，重复以上操作。不加供试样品作为空白，重复以上操作。两者滴定数的差即为所消耗氢氧化钠的量。两者滴定数的差即为所消耗氢氧化钠的量。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析计算：计算：式中，式中，M MHClHCl表示表示0.1mol/L0.1mol/L盐酸液的准确摩尔数；盐酸液的准确摩尔数；A A表示表示供试品滴定所需供试品滴定所需0.1mol/L0.1mol/L盐酸液体积（盐酸液体积（

29、mLmL），），B B表示空表示空白滴定所需白滴定所需0.1mol/L0.1mol/L盐酸液体积（盐酸液体积（mLmL）。）。讨论讨论：水解前先中和溶剂和样品；空白试验校正（消：水解前先中和溶剂和样品；空白试验校正（消除除COCO2 2干扰）；加热时避免吸收干扰）；加热时避免吸收COCO2 2。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（2 2）光光谱谱学学测测定定法法 旋旋光光法法（whirl whirl ray ray methodmethod）平平面面偏偏振振光光通通过过含含有有某某些些光光学学活活性性的的化化合合物物液液体体或或溶溶液液时时，能能引引起起旋旋光光现现象象，使使偏偏振

30、振光光的的平平面面向向左左或或向向右右旋转。旋转。偏振光平面旋转的度数偏振光平面旋转的度数，称为，称为旋光度旋光度。使使偏偏振振光光向向右右旋旋转转（顺顺时时针针方方向向）为为右右旋旋，以以“”符符号号表表示示；使使偏偏振振光光向向左左旋旋（逆逆时时针针方方向向）为为左左旋旋，以以“”符号表示。符号表示。偏偏振振光光透透过过长长1dm1dm并并每每1mL1mL中中含含有有旋旋光光物物质质1g1g的的溶溶液液，在在一定波长与温度下一定波长与温度下测得的旋光度称为测得的旋光度称为比旋度比旋度。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（2 2）光光谱谱学学测测定定法法 旋旋光光法法（whirl

31、 whirl ray ray methodmethod）平平面面偏偏振振光光通通过过含含有有某某些些光光学学活活性性的的化化合合物物液液体体或或溶溶液液时时，能能引引起起旋旋光光现现象象，使使偏偏振振光光的的平平面面向向左左或或向向右右旋转。旋转。偏振光平面旋转的度数偏振光平面旋转的度数，称为，称为旋光度旋光度。使使偏偏振振光光向向右右旋旋转转（顺顺时时针针方方向向）为为右右旋旋，以以“”符符号号表表示示；使使偏偏振振光光向向左左旋旋（逆逆时时针针方方向向）为为左左旋旋，以以“”符号表示。符号表示。偏偏振振光光透透过过长长1dm1dm并并每每1mL1mL中中含含有有旋旋光光物物质质1g1g的的

32、溶溶液液，在在一定波长与温度下一定波长与温度下测得的旋光度称为测得的旋光度称为比旋度比旋度。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析-内酰胺类抗生素分子中含内酰胺类抗生素分子中含不对称碳原子不对称碳原子，可通过比，可通过比旋度的测定求取供试品的纯度。旋度的测定求取供试品的纯度。旋光法亦用于旋光法亦用于红霉素、螺旋霉素红霉素、螺旋霉素等的效价测定。等的效价测定。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析分光光度法（分光光度法（spectrophotometer methodspectrophotometer method）分光光度分光光度法法是在是在特定波长特定波长或一定波长范围内测定

33、被测物质的光或一定波长范围内测定被测物质的光吸收度，对该物质进行定性或定量的分析方法。吸收度，对该物质进行定性或定量的分析方法。Beer-LambertBeer-Lambert定律定律是光吸收度测量的理论基础。是光吸收度测量的理论基础。单色光束单色光束穿过被测物质溶液时，被该物质穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量吸收的量（光吸收度）与该物质的（光吸收度）与该物质的浓度浓度和和液层厚度液层厚度成成正比正比。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析式式中中，A A表表示示吸吸收收度度；T T表表示示透透光光率率；表表示示百百分分吸吸光光系系数数（比比吸吸光光系系数数），即即溶溶液液浓浓度度

34、为为1 1，液液层层厚厚度度为为1cm1cm时时的的吸吸收收度度；C C表表示示100mL100mL溶溶液液中中所所含含被被测测物物质质的的质质量量，g g；L L表示表示液层厚度液层厚度，cmcm。此外，。此外，还还可可利利用用摩摩尔尔吸吸光光系系数数（LmolLmol-1-1cmcm-1-1）和和吸吸光光系数系数a a（LgLg-1-1cmcm-1-1）进行）进行A A的测定。的测定。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析用于含量测定的方法有下述几种：用于含量测定的方法有下述几种：A A、对对照照品品比比较较法法 按按药药典典规规定定的的方方法法，分分别别配配制制供供试试品品和和对

35、对照照品品溶溶液液，对对照照品品溶溶液液中中所所含含被被测测成成分分的的量量应应为为供试品供试品溶液中被测成分标示量的溶液中被测成分标示量的100100+10+10。所所用用溶溶剂剂完完全全一一样样，在在规规定定的的波波长长处处测测定定供供试试品品溶溶液液和和对对照照品品溶溶液液的的吸吸收收度度后后，按按下下式式计计算算供供试试品品中中被被测测溶液的浓度。溶液的浓度。C Cs s表表示示供供试试品品溶溶液液浓浓度度；A As s表表示示供供试试品品溶溶液液吸吸收收度度；C Cr r表示对照品溶液浓度；表示对照品溶液浓度；A Ar r表示对照品溶液吸收度。表示对照品溶液吸收度。第一节第一节 抗生

36、素类药物分析抗生素类药物分析B B、标标准准曲曲线线法法 取取数数份份梯梯度度量量的的对对照照品品（标标准准品品）溶溶液，用溶剂补充至同一体积，测定每份的吸收度。液，用溶剂补充至同一体积，测定每份的吸收度。以吸收度与浓度关系以吸收度与浓度关系绘制标准曲线绘制标准曲线。将将供供试试品品配配制制成成标标准准曲曲线线范范围围内内的的浓浓度度，在在同同样样条条件件下处理和测量其吸收度，再在标准曲线上求出含量。下处理和测量其吸收度，再在标准曲线上求出含量。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析C C、吸吸收收系系数数法法 若若供供试试品品与与已已知知百百分分吸吸光光系系数数的的纯纯品品为为同同样

37、样物物质质时时，可可按按药药典典规规定定方方法法配配制制供供试试品品溶溶液液，测测定定供供试试品品的的吸吸收收度度A A，求求出出供供试试品品的的百百分分吸吸光光系系数数，再求得供试品中该物质的含量。再求得供试品中该物质的含量。供试品含量（）供试品含量（）=E Et t/E Es s100%100%其其中中，E Es s表表示示纯纯品品的的百百分分吸吸光光系系数数；E Et t表表示示测测得得的的供供试试品的百分吸光系数。品的百分吸光系数。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析紫紫外外分分光光光光度度法法多多用用于于抗抗生生素素制制剂剂中中抗抗生生素素含含量量的的测测定定。如如测测定定

38、奥奥格格门门汀汀（复复合合制制剂剂）中中羟羟氨氨苄苄青青霉霉素素和和克克拉拉维维酸酸的的含含量量；测测定定麦麦迪迪霉霉素素胶胶囊囊中中麦麦迪迪霉霉素素的的含含量量；用用金金属属离离子子络络合合物物测测定定土土霉霉素素制制剂剂中中的的土土霉霉素素含含量量等等等。等。比色法比色法用于多种抗生素的用于多种抗生素的效价测定效价测定。如如青青霉霉素素和和头头孢孢菌菌素素的的羟羟胺胺比比色色法法测测定定抗抗生生素素效效价价；链链霉霉素素的的麦麦芽芽酚酚法法测测定定链链霉霉素素效效价价；三三氯氯化化铁铁比比色色法法测定土霉素效价等。测定土霉素效价等。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（3 3）色

39、谱法测定法色谱法测定法 色谱法在抗生素药物分析中，主要色谱法在抗生素药物分析中，主要用于用于鉴别定性及定量鉴别定性及定量（如杂质、异构体的限度试验和（如杂质、异构体的限度试验和组分分析）。组分分析）。第一节第一节 抗生素类药物分析抗生素类药物分析（4 4）高高效效液液相相测测定定法法 在在每每种种抗抗生生素素进进行行检检测测前前要要求求对对仪仪器器进进行行系系统统适适应应性性试试验验，即即用用规规定定的的对对照照品品对对仪仪器器进进行行试试验验和和调调整整，应应达达到到规规定定的的要要求求；或或规规定定分分析析状状态下色谱柱的态下色谱柱的最小理论板数最小理论板数、分离度分离度和和拖尾因子拖尾因

40、子。高高效效液液相相色色谱谱在在抗抗生生素素类类药药物物的的定定性性、定定量量分分析析中中应应用用的的愈愈来来愈愈多多，如如半半合合成成青青霉霉素素、头头孢孢菌菌素素的的衍衍生生物物的的含含量量测测定定；丝丝裂裂霉霉素素、灰灰黄黄霉霉素素的的效效价价测测定定；一一些些抗生素制剂中抗生素含量的测定等。抗生素制剂中抗生素含量的测定等。第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法抗抗生生素素药药品品的的医医疗疗作作用用主主要要是是它它的的抗抗菌菌活活力力，而而微微生生物物检检定定法法正正是是以以抗抗生生素素的的抗抗菌菌活活力力为为指指标标来来衡衡量量抗抗生生素素效效价价的的一一种种

41、方方法法，其其测测定定原原理理与与临临床床要要求求相相一一致致，能直接反映抗生素的医疗价值。能直接反映抗生素的医疗价值。利利用用抗抗生生素素对对细细菌菌（或或霉霉菌菌）的的杀杀死死或或抑抑制制的的程程度度，设计了抗生素效价的生物检定法。设计了抗生素效价的生物检定法。几十年来微生物检定法仍为各国药典所采用。几十年来微生物检定法仍为各国药典所采用。测测定定抗抗生生素素效效价价的的微微生生物物法法，一一般般可可分分为为稀稀释释法法、比比浊法浊法和和琼脂扩散法琼脂扩散法等方法等方法。第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法一、微生物检定方法一、微生物检定方法1 1、稀释法稀释法稀

42、释法是抗生素效价测定最简单的方法之一。稀释法是抗生素效价测定最简单的方法之一。一一般般是是在在一一系系列列的的试试管管中中用用液液体体培培养养基基逐逐管管将将抗抗生生素素做做2 2倍倍稀稀释释，并并于于各各个个试试管管中中加加入入同同量量的的对对该该抗抗生生素素有有高度敏感性高度敏感性的试验的试验菌液菌液。将将各各个个试试管管放放置置于于3737的的培培养养箱箱中中培培养养24h24h，观观察察能能抑抑制细菌生长的制细菌生长的最低抗生素浓度最低抗生素浓度作为测定终点。作为测定终点。再再与与同同法法测测得得的的抗抗生生素素标标准准品品终终点点做做比比较较，即即可可求求得得被测定抗生素的效价。被测

43、定抗生素的效价。第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法式式中中，A A为为供供试试品品的的效效价价（U/mLU/mL）；T T为为供供试试品品的的抑抑菌菌最最大大稀稀释释倍倍数数；S S为为标标准准品品的的抑抑菌菌最最大大稀稀释释倍数；倍数；C C为每为每mLmL标准品溶液中所含单位数。标准品溶液中所含单位数。第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法设设C=40U/mLC=40U/mL，则，则本法测定误差较大，各国药典均未收载，一般用于本法测定误差较大，各国药典均未收载，一般用于测测定定

44、抗生素对试验菌的抗生素对试验菌的最低抑菌浓度最低抑菌浓度或或最低杀菌浓度最低杀菌浓度。第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法2 2、比浊法比浊法细菌生长产生的细菌生长产生的浊度浊度与与细菌数的增加细菌数的增加、细菌群体质量细菌群体质量的增加的增加和和细菌细胞容积细菌细胞容积的增加之间，存在着相关性，的增加之间，存在着相关性，在一定的范围内符合比耳定律。在一定的范围内符合比耳定律。将将抗生素抗生素标准品的稀释液与供试品的稀释液分别标准品的稀释液与供试品的稀释液分别加入加入试管试管中，再中，再加入加入已接种已接种试验菌试验菌的液体培养基，摇匀，的液体培养基，摇匀，置置373

45、7的培养箱中的培养箱中培养培养24h24h后，观察试验菌生长情况。后，观察试验菌生长情况。由于抗生素由于抗生素浓度不同浓度不同，试验菌受抑制的程度也不同，试验菌受抑制的程度也不同，因而产生因而产生不同程度的混浊不同程度的混浊。用分光光度计测定其用分光光度计测定其透光透光率率或或吸收度吸收度，用标准曲线法，用标准曲线法可测定出供试品的效价。可测定出供试品的效价。第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法取取每每mLmL含含24.024.0、26.826.8、29.929.9、33.533.5和和37.5U37.5U的的链链霉霉素素标标准准品品溶溶液液各各1mL1mL，分分别别

46、加加入入1515支支试试管管中中(3(3个个平平行行)。另另取试管取试管3 3支，每管中各加入供试品溶液支，每管中各加入供试品溶液1mL1mL。于于1818支支试试管管中中各各加加入入已已接接种种试试验验菌菌的的液液体体培培养养基基9mL9mL，摇匀。摇匀。将将标标准准品品管管和和供供试试品品管管置置3737培培养养箱箱中中培培养养2 24h4h后后，取取出出，分分别别于于每每管管中中各各加加入入1212甲甲醛醛溶溶液液0.5mL0.5mL，摇摇匀匀，即即可可于于分分光光光光度度计计上上530nm530nm处处以以未未接接种种试试验验菌菌的的液液体体培培养养基基9mL9mL，加加蒸蒸馏馏水水1

47、mL1mL，1212甲甲醛醛溶溶液液0.5mL0.5mL，摇摇匀匀作作为空白，测定各管内培养物的为空白，测定各管内培养物的透光透光率率。以以透透光光度度为为纵纵坐坐标标，链链霉霉素素浓浓度度为为横横坐坐标标绘绘制制标标准准曲曲线线，则可在标准曲线上查出供试品的效价。，则可在标准曲线上查出供试品的效价。第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法3 3、琼脂扩散法、琼脂扩散法(diffuse method(diffuse method即管碟法即管碟法)管碟法是目前国际上测定抗生素效价的管碟法是目前国际上测定抗生素效价的通用方法通用方法。我国药典收载的微生物检定法也是我国药典收载

48、的微生物检定法也是管碟法管碟法。此此法法灵灵敏敏度度高高，但但操操作作较较麻麻烦烦，影影响响试试验验结结果果的的因因素素较较多多，需需要要从从各各个个操操作作步步骤骤严严格格控控制制试试验验条条件件，尽尽可可能减小试验误差，才能使试验结果达到精密、准确。能减小试验误差，才能使试验结果达到精密、准确。第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法二、管碟法测定效价二、管碟法测定效价1 1、管碟法的原理、管碟法的原理管碟法是利用抗生素在管碟法是利用抗生素在摊布特定试验菌摊布特定试验菌的的琼脂培养基琼脂培养基内扩散，形成含一定浓度抗生素的内扩散，形成含一定浓度抗生素的球型区球型区，抑

49、制了试，抑制了试验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基，可观察到验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基，可观察到透明的透明的抑菌圈抑菌圈。在一定的抗生素浓度范围内，在一定的抗生素浓度范围内，对数浓度对数浓度（剂量）与（剂量）与抑抑菌圈面积菌圈面积或直径或直径成正比成正比。第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法方法设计是在方法设计是在同样条件下同样条件下将已知效价的标准品溶液与将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应（抑菌圈）未知效价的供试品溶液的剂量反应（抑菌圈）进行比进行比较较；当当标准品和供试品标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时，标准是属于同一性质的抗生素时，标准

50、品溶液和供试品溶液，对一定试验菌所得的品溶液和供试品溶液，对一定试验菌所得的剂量反应剂量反应曲线曲线，在一定剂量范围内应，在一定剂量范围内应互相平行互相平行。根据以上原理，可设计为根据以上原理，可设计为一剂量法一剂量法、二剂量法二剂量法及及三剂三剂量法量法等，从而可以较为准确地测定供试品的效价。等，从而可以较为准确地测定供试品的效价。第二节第二节 抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法2 2、抑菌圈的形成、抑菌圈的形成根据抗生素在琼脂培养基中的扩散现象，可总结为方根据抗生素在琼脂培养基中的扩散现象，可总结为方程式：程式：换成常用对数：换成常用对数：抗生素的抗生素的最低抑菌浓度最低抑菌