毛细管电泳原理及分析策略CE.ppt

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1、毛细管电泳分离原理及分析策略毛细管电泳分离原理及分析策略CE分离原理分离原理-与模式有关与模式有关毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZECZE）毛细管胶束电动色谱（毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKCMECC/MCKC）毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGECGE）毛细管等电聚焦（毛细管等电聚焦（cIEFcIEF）亲和毛细管电泳（亲和毛细管电泳（ACEACE）毛细管电色谱（毛细管电色谱（CECCEC）第一章第一章 毛细管区带电泳毛细管区带电泳样样品在品在电电解解液中泳液中泳动动,根根据据物物质的荷质的荷/质比质比差差异来异来进进行分行分离离，比值愈大比值愈大,跑跑得愈快得愈快进样方式进样方式

2、n压力进样压力进样n电动进样电动进样n浓缩进样浓缩进样毛细管种类毛细管种类非涂层毛细管（裸管）非涂层毛细管（裸管）内壁涂层毛细管（涂层管）内壁涂层毛细管（涂层管）非涂层毛细管非涂层毛细管-电渗流的概念电渗流的概念-H+高高pH低低pH电渗流的特点电渗流的特点EOF-+纯电泳状态纯电泳状态-+EOF电泳电泳+电渗流电渗流0tm(min)电渗流的作用电渗流的作用电渗流的活塞流特点电渗流的活塞流特点 Hydrodynamic flowHydrodynamic flowParabolicResistance to flow at surfaceMore diffusion/broader detect

3、ion zone EOF gives plug flowEOF gives plug flowMinimizes band broadeningNarrows detection zone Hydrodynamic flowHydrodynamic flowParabolicResistance to flow at surfaceMore diffusion/broader detection zone EOF gives plug flowEOF gives plug flowMinimizes band broadeningNarrows detection zone电渗流的活塞流特点电

4、渗流的活塞流特点电渗流是电渗流是CE中最大的驱动力来源之一中最大的驱动力来源之一电渗流的正面及负面作用电渗流的正面及负面作用 正面作用正面作用 增加分离速度增加分离速度 使得正、负电荷物质同使得正、负电荷物质同时分离时分离 负面作用负面作用 减少分离时间和分离有减少分离时间和分离有效距离效距离 电渗流的波动极大的影电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性响了迁移时间的重复性影响电渗流的因素影响电渗流的因素pHpH值值 pHpH越高，电渗流越大越高，电渗流越大离子强度离子强度 离子强度越高，电渗流越小离子强度越高，电渗流越小缓冲溶液添加剂缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精离子型表

5、面活性剂、有机溶剂、环糊精电渗流随电渗流随pH的变化情况的变化情况控制电渗流的三个重要手段控制电渗流的三个重要手段1.采用涂层毛细管，消除电渗流的影响采用涂层毛细管，消除电渗流的影响2.改变改变pHpH，从而调整电渗流的大小。，从而调整电渗流的大小。pH3pH10pH10以后，电渗流基本不增以后，电渗流基本不增加加3.添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用离子分析时使用缓冲溶液的影响和选择缓冲

6、溶液的影响和选择 在在CECE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液：中应该根据以下性质来选择缓冲溶液：1.1.在所选的在所选的pHpH范围内有较强缓冲能力；范围内有较强缓冲能力；2.2.在检测波长处有低的紫外吸收；在检测波长处有低的紫外吸收；3.3.小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。电流。那些被称为生物那些被称为生物“优良缓冲液优良缓冲液”的，如的，如Tris,borate,Tris,borate,CAPSCAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的

7、电流，但大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。常用的常用的CE缓冲体系缓冲体系磷酸钠体系磷酸钠体系 宽缓冲范围宽缓冲范围硼酸钠体系硼酸钠体系 高高pHpH范围范围Tris-HClTris-HCl体系体系 低低pHpH范围范围醋酸醋酸-醋酸铵体系醋酸铵体系 CE/MSCE/MS常用体系常用体系CZE分离条件的选择分离条件的选择毛细管类型毛细管类型-涂层还是非涂层？涂层还是非涂层？毛细管长度毛细管长度-长毛细管还是短毛细管？长毛细管还是短毛细管？缓冲液体系缓冲液体系-种类和种类和pHpH值值添加

8、剂类型添加剂类型-甲醇甲醇|环糊精环糊精|乙腈乙腈检测器选择检测器选择-紫外紫外|二极管阵列二极管阵列|激光诱导荧光激光诱导荧光缓冲溶液的选择缓冲溶液的选择 可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）（最佳）pHpH范围后，再进一步细选出更好范围后，再进一步细选出更好pHpH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pHpH缓冲范围缓冲范围比较宽（比较宽（pH=1.5pH=1.51313），但电导也比较大。），但电导也比较大。缓冲溶液及缓冲溶液及pH值的选

9、择值的选择 研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（性样品，采用酸性（pH 2pH 2）或碱性（）或碱性（pHpH9 9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在样品通常在pH=9pH=91111之间能获得最佳分离；之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在羧酸或其他样品多在pH=5pH=59 9之间选择分离条之间选择分离条件件。缓冲溶液及缓冲溶液及pH值的选择值的选择 pH pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的涂层毛细管只能在

10、一定的pHpH范围内工作，例如范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3 3pHpH8 8的范围以的范围以外工作，其涂层容易水解失效。外工作，其涂层容易水解失效。缓冲溶液及缓冲溶液及pH值的选择值的选择 在相同的在相同的 pHpH下，不同缓冲体系的分离效果不下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和DNADNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为等

11、分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。含邻位羟基或多羟基化合物的分离。缓冲溶液及缓冲溶液及pH值的选择值的选择 缓冲试剂及缓冲试剂及pHpH调节剂的浓度也需要优化。缓调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控制在冲试剂的浓度一般控制在1010200 mmol/L200 mmol/L之间。之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在度多控制在20 mmol/

12、L20 mmol/L附近，而电导小的试剂附近，而电导小的试剂如硼酸及如硼酸及HEPESHEPES等，其浓度可在等，其浓度可在100 mmol/L100 mmol/L以以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（采用很高（0.5mol/L0.5mol/L）的试剂浓度，此时要）的试剂浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降低。低。添加剂的选择添加剂的选择目的：目的：1.改善分离改善分离2.抑制分析物在毛细管上的吸附抑制分析物在毛细管上的吸附添加剂的选择添加剂的选择1.1.甲醇甲醇|乙腈（乙腈（5-5

13、0%5-50%）降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 增加非极性物质的水溶性增加非极性物质的水溶性2.2.环糊精环糊精|SDS|SDS等表面活性剂等表面活性剂 增加分离选择性，提高分析效果增加分离选择性，提高分析效果 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果3.3.非极性高分子聚合物非极性高分子聚合物 掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附 降低电渗流降低电渗流 形成一定的分子筛，提高分子大小选择性形成一定的分子筛，提高分子大小选择性第二章第二章 毛细管胶束电动

14、色谱毛细管胶束电动色谱 电解质电解质中加入中加入表表面活性面活性剂剂(surfactantsurfactant，例如例如SDS)SDS)，使使之之形成形成胶束（胶束（MicelleMicelle），样样品根品根据其据其疏水性疏水性(Hydrophobicity)Hydrophobicity)强弱的强弱的差差异，异，在在胶束胶束与电解质的与电解质的分配系分配系数数有所不同來有所不同來进进行分行分离离 ，样，样品品疏水性愈強疏水性愈強，则进，则进入入胶束胶束的的机会机会愈大愈大。通常通常物质进物质进入入胶束后，胶束后，泳泳动动的速度的速度会变会变慢慢，因此疏因此疏水性愈強的物水性愈強的物质则质则愈

15、慢出來。愈慢出來。毛细管胶束电动色谱原理SDS-+EOFMicellar Electrokinetic Chromatography(MEKC)七种青霉素的分离(A)CZE:20mM Pi-Borate,pH 8.5(B)MEKC:0.1 M SDS in(A)soln.胶束电动色谱的特点胶束电动色谱的特点 优点优点 增加对弱极性物质分离增加对弱极性物质分离的分离度的分离度 在中药分析、天然产物在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常分析、农药分析中经常使用使用 缺点缺点 稳定性不佳，达到好的稳定性不佳，达到好的重复性比较困难重复性比较困难第三章第三章 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 毛細管內先

16、填充毛細管內先填充凝胶凝胶(例如例如polyacrylamidepolyacrylamide或或cellulose)cellulose)，此此时凝胶会时凝胶会在毛細管內形成分子在毛細管內形成分子筛，筛，样样品依分子量品依分子量的的大小在毛細管內移大小在毛細管內移动动速度不同速度不同而而进进行分行分离。离。主要用于核酸片断及蛋白分子量分析主要用于核酸片断及蛋白分子量分析毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳CE双链及单链核酸分析双链及单链核酸分析45-寡核苷酸质控寡核苷酸质控 1.0 2.0 3.0123 45678910111213141516171819202324252627282930303132

17、3334IS21 10.0 15.0Relative Fluorescence IntensitydsDNA片段片段(72 bp-12 Kbp)CE-SDS蛋白分子量分析蛋白分子量分析第四章第四章 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦第五章第五章 亲和毛细管电泳亲和毛细管电泳-分离条件基于分离条件基于CZE 当在当在CZECZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，然除抗原与抗体的选择需

18、要应用生化知识外，其他方面的选择与其他方面的选择与CZECZE等相同。等相同。用于研究用于研究1.分子间相互作用测定，分子构型变化分子间相互作用测定，分子构型变化2.特定物质检测特定物质检测3.活性物质筛选活性物质筛选ACE测定分子间结合常数与解离速率测定分子间结合常数与解离速率JAK2与与SH2-B之间的相互作用研究之间的相互作用研究ACE特定物质的检测特定物质的检测ACE用于相互作用筛选用于相互作用筛选 适体适体AptamerAptamer类似于抗类似于抗体，但可以体外合成，体，但可以体外合成，结合常数比抗体更高，结合常数比抗体更高，有广泛的药物筛选和临有广泛的药物筛选和临床诊断应用潜力床

19、诊断应用潜力 目前已有以下的一些蛋目前已有以下的一些蛋白的白的aptameraptamer是采用是采用CECE方法筛选得到的方法筛选得到的1.1.IgEIgE2.2.HIV type 1 reverse transcriptaseHIV type 1 reverse transcriptase3.3.ThrombinThrombin4.4.Anti-thrombin IIIAnti-thrombin III5.5.Taq DNA polymeraseTaq DNA polymeraseACE用于相互作用筛选用于相互作用筛选 传统筛选方法如亲和色传统筛选方法如亲和色谱或者谱或者CECCEC筛选一

20、个筛选一个AptamerAptamer需要需要4-64-6周周 而而CECE只需要几天就可以只需要几天就可以了，大大提高了筛选速了，大大提高了筛选速度度-MicroScale Bioseparations 2006第六章第六章 检测器选择检测器选择小分子检测小分子检测大分子检测大分子检测CE检测器种类及性能检测器种类及性能小分子检测小分子检测1.1.有紫外吸收有紫外吸收 首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器2.2.无紫外吸收无紫外吸收 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等测

21、器检测，如氨基酸、还原性糖等 不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器测，也可以尝试电化学检测器3.3.有荧光或需要高灵敏度检测的可采用有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIFLIF检测器检测器4.4.需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测虑质谱检测大分子检测大分子检测1.1.蛋白、核酸蛋白、核酸 可以首先选择紫外检测器可以首先选择紫外检测器 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用方

22、法标记荧光，然后用LIFLIF检测检测 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再后再LIFLIF检测检测 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测2.2.多糖多糖 含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测测 含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIFLIF、UVUV的方式检测的方式检测第七章 分离条件选择流程 分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难

23、之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：第第一一步步，尽尽可可能能多多地地了了解解分分离离样样品品的的类类型型、来来源源、组组成成及其性质；及其性质；第第二二步步，根根据据样样品品的的可可能能性性质质和和来来源源，选选择择分分离离模模式式，若无样品信息可先选若无样品信息可先选CZECZE；条件选择流程 第第三三步步，根根据据样样品品性性质质确确定定检检测测方方法法，一一般般先先选选直直接接紫外吸收；紫外吸收；第第四四步步，确确定定样样品品处处理理

24、方方式式，包包括括衍衍生生方方案案以以及及离离心心过滤除蛋白等；过滤除蛋白等；第第五五步步，根根据据样样品品解解离离常常数数计计算算最最佳佳pHpH，或或利利用用75mID75mID毛细管和磷酸缓冲体系确定毛细管和磷酸缓冲体系确定pHpH范围范围;条件选择流程 第第六六步步，根根据据所所需需pHpH构构建建缓缓冲冲体体系系，包包括括进进一一步步优优化化pHpH、缓冲试剂浓度等；缓冲试剂浓度等；第第七七步步，优优化化其其他他操操作作参参数数，如如毛毛细细管管尺尺寸寸、分分离离电电压压和和温度等；温度等；第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；第

25、九步，确定是否需要换用其他分离模式。第九步，确定是否需要换用其他分离模式。条件选择流程 在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项：在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项：最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。毛毛细细管管的的洗洗涤涤或或平平衡衡，与与缓缓冲冲体体系系、pHpH以以及及柱柱子子有有关关。磷磷酸酸根根与与石石英英和和玻玻璃璃之之间间存存在在慢慢相相互互作作用用，需需要要延延长长平平衡衡或或冲洗时间，处理的时间应由分离重现性决定。冲洗时间，处理的时间应由分离重现性决定。条件选择流程 欲欲降降低低缓缓冲冲液液的的电电导导，应应尽尽

26、量量使使用用所所谓谓的的“生生物物缓缓冲试剂冲试剂”；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。欲欲保保持持分分离离重重现现，要要尽尽量量采采用用相相同同的的条条件件，包包括括毛毛细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。第八章第八章 各类物质的分离要点各类物质的分离要点1.阴离子及有机酸阴离子及有机酸此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸收物收物CTABCTAB通常用作电渗流反向剂，以加速出峰，通常用作电渗流反

27、向剂，以加速出峰，提高峰的尖锐度提高峰的尖锐度要使用反向极性分离要使用反向极性分离各类物质的分离要点各类物质的分离要点2.阳离子及金属离子的分离阳离子及金属离子的分离此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法间接紫外法一般以氨基吡啶等物质作为背景间接紫外法一般以氨基吡啶等物质作为背景吸收物吸收物与阴离子不同的是阳离子的分析不需要在缓与阴离子不同的是阳离子的分析不需要在缓冲溶液中添加电渗流反向试剂冲溶液中添加电渗流反向试剂也不需要使用反向极性分离也不需要使用反向极性分离各类物质的分离要点各类物质的分离要点3.易电离有极性的化合物易电离有极性的化合物一般采用长一般

28、采用长60cm60cm的毛细管的毛细管分离的最佳分离的最佳pHpH在分析物在分析物pKa+/-1pKa+/-1左右左右通常不需要添加剂通常不需要添加剂各类物质的分离要点各类物质的分离要点4.弱极性物质和水溶性差的物质（一些中药成弱极性物质和水溶性差的物质（一些中药成分、农药等）分、农药等）要注意分析物的溶解性，防止在毛细管中的要注意分析物的溶解性，防止在毛细管中的沉淀沉淀通过有机溶剂的添加，提高分析物在通过有机溶剂的添加，提高分析物在bufferbuffer中中的溶解度的溶解度添加添加SDSSDS，增加溶解度，增加溶解度降低样品中分析物的浓度，延长降低样品中分析物的浓度，延长ramp time

29、ramp time也也可以防止分析物的析出可以防止分析物的析出各类物质的分离要点各类物质的分离要点5.还原性的单糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳还原性的单糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳糖等及其聚合物）糖等及其聚合物）通常无紫外和荧光，注意检测问题通常无紫外和荧光，注意检测问题可用可用APTSAPTS等衍生试剂衍生，使其带上电荷和等衍生试剂衍生，使其带上电荷和紫外紫外/荧光基团荧光基团多糖也可以采用末端吸收来检测（多糖也可以采用末端吸收来检测（180-180-200nm200nm），不需要衍生化处理，但是要尽量），不需要衍生化处理，但是要尽量采用高采用高pHpH使得羟基部分电离带电使得羟基部分电离带电

30、各类物质的分离要点各类物质的分离要点6.非还原性的单糖、寡糖和多糖非还原性的单糖、寡糖和多糖很难采用衍生的方法检测，通常对单糖和寡很难采用衍生的方法检测，通常对单糖和寡糖采用间接检测法糖采用间接检测法对多糖采用末端吸收的方法来检测对多糖采用末端吸收的方法来检测通常采用高通常采用高pHpH使得羟基部分电离带电使得羟基部分电离带电高高pHpH缓冲液还有防止多糖在毛细管内壁吸附缓冲液还有防止多糖在毛细管内壁吸附的作用的作用各类物质的分离要点各类物质的分离要点7.单链核苷酸、双链核苷酸片断及单链核苷酸、双链核苷酸片断及PCRPCR产物产物容易在毛细管内壁吸附，通常需要使用涂层容易在毛细管内壁吸附，通常

31、需要使用涂层管或者对毛细管进行动态涂层管或者对毛细管进行动态涂层分子筛原理，凝胶的种类和浓度决定了分辨分子筛原理，凝胶的种类和浓度决定了分辨率的最佳范围和大小率的最佳范围和大小各类物质的分离要点各类物质的分离要点8.8.多肽及蛋白质多肽及蛋白质 一般来说小的肽段不需要考虑在毛细管内壁的吸附问一般来说小的肽段不需要考虑在毛细管内壁的吸附问题题 对于大的肽段和蛋白质一定要考虑在毛细管内壁的吸对于大的肽段和蛋白质一定要考虑在毛细管内壁的吸附，可采用极端附，可采用极端pHpH和涂层毛细管的方法来避免吸附和涂层毛细管的方法来避免吸附 在使用极端在使用极端pHpH条件的时候，通常都是用正向电压分条件的时候，通常都是用正向电压分离离 在使用涂层毛细管时通常没有电渗流，而蛋白是两性在使用涂层毛细管时通常没有电渗流，而蛋白是两性物质，需要仔细考虑使用涂层管时的分离极性物质，需要仔细考虑使用涂层管时的分离极性