电泳和色谱分离技术(应用).ppt

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1、制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春高等制药分离工程高等制药分离工程n各种不同分子量的蛋白质在电场内迁移速率与它的净电荷数成正比，而与其分子半径及溶液黏度成反比。n实验证明，蛋白质的电泳迁移速率与蛋白质分子量的对数成线性关系制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春高等制药分离工程高等制药分离工程n根据此性质，可对具有相同电荷，不同分子量的蛋白质进行分离。制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春高等制药分离工程高等制药分

2、离工程电泳技术分类电泳技术分类n影响电泳迁移率的因素n n电场强度。电场强度是指单位长度(cm)的电位降也称电势梯度。根据电场强度不同，将电泳分为常压电泳(2-10V/cm)和高压电泳(20-200V/cm)。电场强度高，带电质点的迁移率加速，因此省时，但会产生大量热量。n 制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春高等制药分离工程高等制药分离工程n溶液的pH值。溶液的pH值决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。n对于带有两性基团的电解质，溶液存在一pH值，此时，溶液所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，在电场中

3、不再移动，这一pH值称为电解质的等电点（isoelectric point,PI)。n若溶液pH值处于等电点酸侧，即pHp I，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动；n若溶液pH值处于等电点碱侧，即pHpI，则蛋内质带负电荷,向正极移动。溶液的pH值离pI越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春高等制药分离工程高等制药分离工程n 溶液的离子强度n一方面，电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。n带电质点吸引相反电荷的离子聚集其周围，形成一个与运动质点电荷相反的离子氛(ionic atmo

4、sphere),离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。n另一方面，离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响n质点的带电量，改变泳动速度。制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春高等制药分离工程高等制药分离工程n电渗。在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗(electroosmosis)。由于电渗的影响，质点迁移的表观速度不同于其固有速度。n因固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤

5、维素吸附OH-带负电荷，而与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表观速度比其固有速度要快；若质点原来移向正极，表观速度比其固有速度要慢。因此应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春高等制药分离工程高等制药分离工程n电泳的技术问题和对策：n影响迁移速率的主要因素（1）各组分的分子净电荷数;(2)分子量;(3)电泳系统介质的有效黏滞度。n（1）一般控制溶液pH4.5-9.5范围内。n（2）选择适当的缓冲系统。n（3）表面活性剂n（4）控制电泳系统介质的有效黏滞度制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春高等制药分离工程高等制药分离工程n（5）电泳过程的产热问题nA、蛋白质变性;B、引起区带扩散，降低分辨率。n最常采用的办法是将电泳产生的热量从电泳系统中移出，保持电泳温度恒定。制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春制作者：黄德春高等制药分离工程高等制药分离工程