遗传工程和转基因技术.ppt

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1、DNADNA重组技术的应用重组技术的应用 重组蛋白质的表达系统重组蛋白质的表达系统克隆能编码特定蛋白质的基因或克隆能编码特定蛋白质的基因或cDNA.cDNA.开发合适的表达系统开发合适的表达系统常用的表达系统常用的表达系统1.1.大肠杆菌大肠杆菌E.coli E.coli 2.2.枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌Bacillus SubtilisBacillus Subtilis3.3.酵母酵母4.4.培养的昆虫细胞培养的昆虫细胞5.5.哺乳动物细胞哺乳动物细胞 选择表达系统，根椐所生产的蛋白质的性状确定。选择表达系统，根椐所生产的蛋白质的性状确定。细菌细胞细菌细胞优越性优越性1.操作方便操作方便2.

2、细菌繁殖快细菌繁殖快3.可获得大量蛋白质且价格低廉可获得大量蛋白质且价格低廉缺点缺点1.多肽成份常不能适当的折叠，常形成不溶性包涵体。而从多肽成份常不能适当的折叠，常形成不溶性包涵体。而从包涵体中制备的蛋白质常无生物活性。包涵体中制备的蛋白质常无生物活性。2.菌体因产生的大量异体蛋白，而对细菌产生毒性副作用，菌体因产生的大量异体蛋白，而对细菌产生毒性副作用，而使细菌培养物中细菌的浓度不高。而使细菌培养物中细菌的浓度不高。3.细菌缺乏转录后修饰的酶，如在蛋白质上加上磷酸根，糖细菌缺乏转录后修饰的酶，如在蛋白质上加上磷酸根，糖基。而这些修饰作用对蛋白质完成其功能常常是必须的。基。而这些修饰作用对蛋

3、白质完成其功能常常是必须的。酵母细胞酵母细胞优越性优越性1.为十分简单的真核细胞，其特性和哺乳动物细胞为十分简单的真核细胞，其特性和哺乳动物细胞相似，而其生长和细菌一样快。相似，而其生长和细菌一样快。2.可完成人类蛋白质的转录后修饰。并可诱导表达可完成人类蛋白质的转录后修饰。并可诱导表达蛋白分泌至培养基中。蛋白分泌至培养基中。缺点缺点 其有活性的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白，使其有活性的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白，使其产量降低。其产量降低。昆虫细胞昆虫细胞利用昆虫病毒，杆状病毒在昆虫细胞中表达异体蛋白质。利用昆虫病毒，杆状病毒在昆虫细胞中表达异体蛋白质。优越性优越性1.1.蛋白能高水平表达，

4、多肽能正确折叠。蛋白能高水平表达，多肽能正确折叠。2.2.具有转录后修饰作用。具有转录后修饰作用。缺点缺点昆虫细胞培养价格高于细菌和酵母昆虫细胞培养价格高于细菌和酵母 哺乳动物细胞哺乳动物细胞生产哺乳动物蛋白质的最佳表达系统。生产哺乳动物蛋白质的最佳表达系统。启动子，载体，转染方法启动子，载体，转染方法在哺乳动物细胞稳定组入扩增基因，可供产生大量蛋白在哺乳动物细胞稳定组入扩增基因，可供产生大量蛋白缺点缺点细胞培养价格高于细菌和酵母和昆虫细胞。细胞培养价格高于细菌和酵母和昆虫细胞。启动子启动子 可使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备后面这可使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须

5、具备后面这几个条件几个条件1.1.它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达 量占细胞总蛋白的量占细胞总蛋白的10103030以上。以上。2.2.这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平。这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平。3.3.这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。诱导物而得以诱导。如在大批量的蛋白质制备中，热和化学诱导便是两种广泛如在大批量的蛋白质制备中，热和化学诱导便是两种广泛使用的方式。使用的方式。IPTG IPTG是杂种强启动子

6、是杂种强启动子tactac和和trctrc的一种有效的化学诱导物。的一种有效的化学诱导物。但对于人类临床药用蛋白质的大批量制备，但对于人类临床药用蛋白质的大批量制备，IPTGIPTG则不是理想则不是理想的诱导物，因为它有毒性。的诱导物，因为它有毒性。编码热敏感编码热敏感laclac阻遏物的温度敏感突变体阻遏物的温度敏感突变体lacIlacI基因，为诱基因，为诱导导1ac1ac及其派生启动子提供了方便的手段。及其派生启动子提供了方便的手段。1.1.在启动子在启动子tactac的一的一1010和一和一3535元件之间有一段元件之间有一段17bp17bp的间隔的间隔序列。序列。2.2.核糖体结合位点

7、核糖体结合位点,RBS,RBS 由由ShineDalgarno,SDShineDalgarno,SD序列及其序列及其后的一段富含后的一段富含ATAT碱基的转译间隔区组成，碱基的转译间隔区组成，间隔区的间隔区的最适最适长度约为长度约为8 8个碱基。个碱基。3.3.在转译起始期间，在转译起始期间，SDSD序列与序列与16srRNA16srRNA的的3 3末端发生作用。末端发生作用。4.4.三个起始密码子及其在大肠杆菌中的使用频率。三个终三个起始密码子及其在大肠杆菌中的使用频率。三个终止密码子中其后连着止密码子中其后连着U U的的UAAUAA是大肠杆菌最有效的转译终是大肠杆菌最有效的转译终止密码子。

8、止密码子。1.调节基因调节基因R R 编码阻遏物，可调节启动子的编码阻遏物，可调节启动子的活性，它既可以存在于表达载体上，也可以活性，它既可以存在于表达载体上，也可以是整合在寄主染色体上。是整合在寄主染色体上。2.2.转录终止子，转录终止子，TTTT 可使可使mRNAmRNA和载体分子稳和载体分子稳定。抗菌素抗性基因，定。抗菌素抗性基因，terter为载体提供了表为载体提供了表型选择记号，复制起点，型选择记号，复制起点，0ri0ri决定着载体的决定着载体的拷贝数。拷贝数。克隆载体克隆载体克隆质粒载体克隆质粒载体基因克隆的目的不仅是为了获得大量的克隆在载体上的基因克隆的目的不仅是为了获得大量的克

9、隆在载体上的DNADNA片段，而且还要考虑后续实验如测序，表达，突变的要求。片段，而且还要考虑后续实验如测序，表达，突变的要求。pGEM-TpGEM-T和和pGEM-T EasypGEM-T Easy载体载体1.1.PCRPCR扩增中常用的扩增中常用的DNADNA聚合酶聚合酶Taq DNATaq DNA聚合酶可以不需要模板聚合酶可以不需要模板在在PCRPCR产物上加一个产物上加一个A A，一些生物公司根据这一特点研究制了，一些生物公司根据这一特点研究制了T T载体。载体。2.2.在在pGEM-TpGEM-T载体的两边还分别有一个限制性内切酶载体的两边还分别有一个限制性内切酶BstZ IBstZ

10、 I的识的识别位点，如果在外源别位点，如果在外源DNADNA片段上没有该酶的识别位点，只用片段上没有该酶的识别位点，只用该酶就可以将外源基因完整的切下来，根据酶切片段的大小该酶就可以将外源基因完整的切下来，根据酶切片段的大小对重组质粒进行签定。在对重组质粒进行签定。在pGEM-T EasypGEM-T Easy质粒的插入点两边，质粒的插入点两边，增加了增加了EcoR IEcoR I和和Not INot I酶切位点，使外源酶切位点，使外源DNADNA片段的鉴定更加片段的鉴定更加容易。容易。表达质粒载体表达质粒载体1.1.原核表达质粒载通常须具有一个强的启动子，一个位于启原核表达质粒载通常须具有一

11、个强的启动子，一个位于启动子和起始密码子动子和起始密码子ATGATG之间的核糖体结合序列以及位于外之间的核糖体结合序列以及位于外源基因插入序列下游的转录终止序列。源基因插入序列下游的转录终止序列。2.2.原核表达载体常用的启动子原核表达载体常用的启动子laclac启动子启动子 较早使用的启动子，来自大肠杆菌的乳糖操纵子，常用较早使用的启动子，来自大肠杆菌的乳糖操纵子，常用IPTGIPTG诱导，启动外诱导，启动外源基因的表达。源基因的表达。trptrp启动子启动子 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，表达载体上的启动子常常包含操纵子的启来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，表达载体上的启动子常常包含操纵子的启动基

12、因，操纵基因和部分动基因，操纵基因和部分trpEtrpE基因，删除了衰减子序列，在基因，删除了衰减子序列，在-吲哚丙氨吲哚丙氨酸的诱导下，转录水平比大肠杆菌中的正常启动子提高酸的诱导下，转录水平比大肠杆菌中的正常启动子提高8 8到到1010倍。倍。tactac启动子启动子 是一组由是一组由laclac和和trptrp启动子人工构建的杂合启动子，但仍可以用启动子人工构建的杂合启动子，但仍可以用IPTGIPTG诱导，诱导，tactac是一个非常强的启动子，由是一个非常强的启动子，由tactac启动子启动的基因的转录水平比启动子启动的基因的转录水平比laclac和和trptrp启动子高。启动子高。P

13、LPL启动子启动子 来自来自噬菌体，也是一个非常强的启动子。噬菌体，也是一个非常强的启动子。受受噬菌体阻噬菌体阻遏基因遏基因cIcI编码的阻遏蛋白的控制，表达载体的宿主菌带有编码的阻遏蛋白的控制，表达载体的宿主菌带有一个一个cIcI基因温度敏感突变体，它表达的阻遏蛋白在基因温度敏感突变体，它表达的阻遏蛋白在28283030才有活性，能够阻抑启动子的表达；当温度提高到才有活性，能够阻抑启动子的表达；当温度提高到4242时，它的表达产物失去活性，启动子能够转录外源基时，它的表达产物失去活性，启动子能够转录外源基因。这种温度诱导的特性是以因。这种温度诱导的特性是以PLPL为表达载体的一大优点。为表达

14、载体的一大优点。T7T7启动子启动子 来自于来自于T7T7噬菌体，有该启动子并在噬菌体，有该启动子并在T7 RNAT7 RNA聚合酶驱动下表聚合酶驱动下表达外源基因的大肠杆菌质粒称为达外源基因的大肠杆菌质粒称为pETpET表达载体家族。表达载体家族。T7 T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶不仅能够选择性的与聚合酶不仅能够选择性的与T7T7启动子结合，启动子结合，而且在不降低启动效率的前题下，其沿而且在不降低启动效率的前题下，其沿DNADNA模板合成模板合成mRNAmRNA的的速度比大肠杆菌速度比大肠杆菌RNARNA聚合酶快聚合酶快5 5 倍，因此提高了对外源基因倍，因此提高了对外源基因的转录水

15、平。的转录水平。pETpET表达系统表达外原蛋白必须使用特殊的大肠杆菌受体菌，表达系统表达外原蛋白必须使用特殊的大肠杆菌受体菌，如如BL21BL21和和HNS174HNS174。这些菌株是这些菌株是噬菌体的溶源衍生菌，其染色体上含有噬菌体的溶源衍生菌，其染色体上含有PlacUV5PlacUV5启动子控制下的启动子控制下的T7 RNAT7 RNA聚合酶基因。聚合酶基因。pET pET表达系统是一个基因表达的级联反应，表达系统是一个基因表达的级联反应，IPTGIPTG首先诱导首先诱导 PlacUV5PlacUV5启动子表达启动子表达T7 RNAT7 RNA聚合酶，聚合酶，T7 RNAT7 RNA聚

16、合酶再选择性的聚合酶再选择性的结合结合T7T7启动子启动外源基因的转录。启动子启动外源基因的转录。pcDNA3.1/HispcDNA3.1/His表达载体表达载体 pCDNA3.1/HispCDNA3.1/His表达载体是表达载体是InvitrogenInvitrogen公司的产品，载体采用人公司的产品，载体采用人巨细胞病毒的立即早期启动子，用来在哺乳动物细胞内获得高表达巨细胞病毒的立即早期启动子，用来在哺乳动物细胞内获得高表达的外源基因及进行基因功能的研究。的外源基因及进行基因功能的研究。pCDNA3.1/His pCDNA3.1/His载体是一种穿梭质粒表达载体，带有载体是一种穿梭质粒表达

17、载体，带有pUCpUC质粒的复质粒的复制起点和制起点和amprampr基因，可以在大肠杆菌内扩增和选择重组转化子，同基因，可以在大肠杆菌内扩增和选择重组转化子，同时载有时载有SV40SV40的复制起点和新霉素抗性基因，可以在表达的复制起点和新霉素抗性基因，可以在表达SV40TSV40T抗原抗原的细胞内复制并选择重组转化子。的细胞内复制并选择重组转化子。表达载体起始密码子下游有一段编码表达载体起始密码子下游有一段编码6 6个组氨酸的个组氨酸的DNADNA片段及编码片段及编码一段短肽一段短肽DLYDDDDKDLYDDDDK的的DNADNA片段，外源基因克隆在这些基因的上游，片段，外源基因克隆在这些

18、基因的上游，构成融合基因。构成融合基因。此融合基因能够表达目的蛋白和组氨酸，故通过标记组氨酸可分离此融合基因能够表达目的蛋白和组氨酸，故通过标记组氨酸可分离纯化目的融合蛋白，组氨酸可以作为检测融合蛋白的标签。纯化目的融合蛋白，组氨酸可以作为检测融合蛋白的标签。在表达载体上设计有蛋白酶的识别和切割位点，用蛋白酶可以切除在表达载体上设计有蛋白酶的识别和切割位点，用蛋白酶可以切除融合蛋白上非目的蛋白的氨基因酸序列如组氨酸和融合蛋白上非目的蛋白的氨基因酸序列如组氨酸和DLYDDDDKDLYDDDDK短肽。短肽。组织纤溶酶原激活物克隆表达组织纤溶酶原激活物克隆表达tPA tPA 纤溶酶原纤溶酶原纤溶酶纤

19、溶酶水解纤维蛋白（可用于血凝水解纤维蛋白（可用于血凝块的溶解，治疗血栓梗塞性疾病）块的溶解，治疗血栓梗塞性疾病）tPAtPA基因（信号肽基因（信号肽 和和tPA CDNAtPA CDNA）表达载体）表达载体重组载体重组载体转染哺乳动物细胞转染哺乳动物细胞用用HATHAT培养基选择出稳定的转染细胞培养基选择出稳定的转染细胞细胞表达低水平的细胞表达低水平的tPAtPAMtxMtx（氨甲蝶呤）筛选（氨甲蝶呤）筛选细胞表达细胞表达高水平的高水平的tPAtPA细胞在发酵器培养细胞在发酵器培养tPAtPA分泌分泌tPAtPA于培养液于培养液中。中。DNADNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化DNADNA限

20、制性内切酶消化是基因分析中的关键步骤，限制性内切酶消化是基因分析中的关键步骤，内切酶是最关键内切酶是最关键的工具酶。限制性内切酶是一类具有严格识别位点，并在识别位点的工具酶。限制性内切酶是一类具有严格识别位点，并在识别位点内或附近切割双链内或附近切割双链DNA DNA 的脱氧核糖核酸酶。酶单位规定为在最适应的脱氧核糖核酸酶。酶单位规定为在最适应条件下小时完全消化条件下小时完全消化11DNADNA的酶量为个单位。的酶量为个单位。影响限制性内切酶活性的因素包括影响限制性内切酶活性的因素包括DNADNA的纯度、缓冲液、温度的纯度、缓冲液、温度及酶本身。及酶本身。DNADNA甲基化，含有蛋白质或高分子

21、量甲基化，含有蛋白质或高分子量DNADNA胶体溶液太粘稠胶体溶液太粘稠均会降低内切酶的消化效率。均会降低内切酶的消化效率。由于在限制性内切酶消化反应中，由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过甘油浓度超过5 5会抑制内切酶活性，因此在会抑制内切酶活性，因此在20l20l反应体系中，甘反应体系中，甘油浓度应少于油浓度应少于1l1l。不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要求各不相同。缓冲液一般分为高、中、低盐种。一般使用厂家提求各不相同。缓冲液一般分为高、中、低盐种。一般使用厂家提供的与酶配套的缓冲液。供的与酶配套的缓冲液。在需进行双酶切反应时，可采用以下不

22、同的方法进行。如果两种酶在需进行双酶切反应时，可采用以下不同的方法进行。如果两种酶的反应缓冲液相同或相近，可以同时加入两种酶进行酶切，但反应的反应缓冲液相同或相近，可以同时加入两种酶进行酶切，但反应体积应稍大些，以免甘油浓度过高，影响酶的活性。如果相差甚远，体积应稍大些，以免甘油浓度过高，影响酶的活性。如果相差甚远，则必须如下进行：则必须如下进行：在第个酶酶解反应完毕后，采用乙醇沉淀，在第个酶酶解反应完毕后，采用乙醇沉淀，回收已线性化的回收已线性化的DNADNA，再建立第个酶切体系，继续酶解。再建立第个酶切体系，继续酶解。也可也可先用低盐浓度的酶进行酶解，等酶解完全后，补加先用低盐浓度的酶进行

23、酶解，等酶解完全后，补加NaClNaCl及相差的化及相差的化学成分或调节学成分或调节pHpH然后再加入第种酶继续酶解。然后再加入第种酶继续酶解。如果两个酶的反如果两个酶的反应条件只是温度上的差别，可以先加一种酶进行酶解，然后加入另应条件只是温度上的差别，可以先加一种酶进行酶解，然后加入另一种酶在相应的温度下酶解。一种酶在相应的温度下酶解。酶解反应酶解反应 主要应用于质粒的酶切鉴定。典型的反应是主要应用于质粒的酶切鉴定。典型的反应是20l20l体积中含体积中含0.20.21gDNA1gDNA。酶切反应体系如下酶切反应体系如下 质粒质粒DNA 10lDNA 10l 10 10缓冲液缓冲液 2l 2

24、l 限制酶限制酶 1l 1l 双蒸去离子水双蒸去离子水 7l 7l 总体积总体积 20l 20l 操作方法操作方法 按下列顺序加入试剂按下列顺序加入试剂 (1)(1)在一灭菌的新的在一灭菌的新的EppendorfEppendorf管中加入管中加入7l7l双蒸水。双蒸水。(2)(2)加入加入1010缓冲液缓冲液2l2l。(3)(3)加限制酶加限制酶1l1l (4)(4)最后加入质粒最后加入质粒DNA10lDNA10l。(5)(5)稍离心，混合。稍离心，混合。(6)37 (6)37水浴水浴1 12h2h。(7)(7)取出后电泳分析鉴定是否酶解取出后电泳分析鉴定是否酶解。注意问题注意问题1.1.双蒸

25、水为可变体积，当其它反应成分确定后，用双蒸水将反应体积双蒸水为可变体积，当其它反应成分确定后，用双蒸水将反应体积 补足。补足。2.2.为保持限制酶的活性，将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的为保持限制酶的活性，将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的 冰浴中，操作应迅速，用后立即放回低温水箱中。冰浴中，操作应迅速，用后立即放回低温水箱中。3.3.大多数酶多以浓缩液存放，吸取时需严格取量。大多数酶多以浓缩液存放，吸取时需严格取量。4.4.若要取用多种酶，若要取用多种酶，每种酶必须单独使用吸头，避免交叉污染。每种酶必须单独使用吸头，避免交叉污染。5.5.大多数限制酶均加大多数限制酶均加5050甘油

26、缓冲液置于甘油缓冲液置于-20-20保存，其活力稳定，保存，其活力稳定，但在配制反应混合物时，酶的加入量要准确，小于总体积的但在配制反应混合物时，酶的加入量要准确，小于总体积的1/101/10，否则甘油会抑制酶解反应。否则甘油会抑制酶解反应。UNIQ-10UNIQ-10质粒提取试剂盒提取质粒质粒提取试剂盒提取质粒DNADNA 本试剂盒的核心是本试剂盒的核心是UNIQ-10UNIQ-10柱。柱的底部有一层由柱。柱的底部有一层由SangonSangon研制开发的惰性大分子材料，它能选择性吸附核酸研制开发的惰性大分子材料，它能选择性吸附核酸物质，不吸附蛋白质，多糖和其它物质。物质，不吸附蛋白质，多糖

27、和其它物质。DNADNA与与UNIQ-1 0UNIQ-1 0的结合需要一定的离子强度。抽提质粒时，细菌用常规的碱的结合需要一定的离子强度。抽提质粒时，细菌用常规的碱裂解，离心除去基因组裂解，离心除去基因组D NAD NA。含质粒的上清液加入到。含质粒的上清液加入到UNIQ-1 0UNIQ-1 0拄中，经简单的洗涤步骤除去非特异性结合的杂拄中，经简单的洗涤步骤除去非特异性结合的杂质。所要抽提的质粒用质。所要抽提的质粒用Elution BufferElution Buffer，TETE或者水洗脱。或者水洗脱。质粒质粒 DNA提取提取操作步骤操作步骤1 1 将过夜培养的将过夜培养的1 12ml2ml

28、细菌细菌1212，000rpm000rpm离心离心1515秒，彻秒，彻 底去除上清。底去除上清。注意：对于低拷贝数的质粒，请用注意：对于低拷贝数的质粒，请用2 25ml5ml细胞，同时按比例细胞，同时按比例 相应提高相应提高Solution lSolution l，lIlI和和llIllI的用量。在执行步骤的用量。在执行步骤5 5后，将后，将 上清分批加入到上清分批加入到UNlQ-10UNlQ-10柱中，重复步骤柱中，重复步骤6 6，直至处理完所有，直至处理完所有 样品。样品。2.2.加入加入100 l Solution I100 l Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。，用枪头

29、或振荡器充分悬浮细菌。3 3加入加入200 l Solution II200 l Solution II，立即温和混匀，立即温和混匀(倾斜倾斜4545度角，度角，顺一个方向，慢慢旋转离心管顺一个方向，慢慢旋转离心管)，使细菌裂解，室温放，使细菌裂解，室温放 置置2 2分钟。注意：不能剧烈混合，否则会出观基因组分钟。注意：不能剧烈混合，否则会出观基因组DNADNA污染。污染。4 4加入加入350 l SoIution llI 350 l SoIution llI 立即上下颠倒立即上下颠倒5 51010次，使之次，使之 充分中和，室温放置充分中和，室温放置2 2分钟。分钟。5.125.12，000

30、rpm000rpm，离心，离心5 5分钟。分钟。6 6将步骤将步骤5 5中上清转移到套放于中上清转移到套放于2.0 ml2.0 ml收集管内的收集管内的 UNIQ-10 UNIQ-10柱中，柱中，8 8，000rpm000rpm室温离心室温离心1515秒。秒。注意：不要吸取沉淀，否则会出现基因组注意：不要吸取沉淀，否则会出现基因组DNADNA和蛋白质污染。和蛋白质污染。7.7.弃收集管中的废液，将弃收集管中的废液，将UNlQ-10UNlQ-10柱放入同一支收集管柱放入同一支收集管 中，中，吸取吸取500 l Wash Solution500 l Wash Solution至至 UNIQ-1O

31、UNIQ-1O柱，柱，10 10，000rpm000rpm室温离心室温离心3030秒。秒。8 8 重复步骤重复步骤7 7。9 9 弃收集管中的废液，将弃收集管中的废液，将UNIQ-10UNIQ-10柱放入同一支收集管柱放入同一支收集管 中，中，1O1O，000rpm000rpm室温离心室温离心3030秒以彻底去除秒以彻底去除WashWash SOlutiOn SOlutiOn。1 01 0将将UNIQ-10UNIQ-10柱放入新的洁净柱放入新的洁净1.5 ml1.5 ml离心管中，加离心管中，加 50l Elution Buffer 50l Elution Buffer，室温放置，室温放置2

32、2分钟后，分钟后，10,000rpm10,000rpm室温室温 离心离心1 1分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNADNA。注意：如果要提高质粒的浓度，可以用注意：如果要提高质粒的浓度，可以用30 l Elution 30 l Elution Buffer,37 Buffer,37或或5050下放置下放置2 2分钟，分钟，10,000rpm10,000rpm室温离心室温离心1 1分钟。分钟。DNADNA体外连接体外连接利用利用DNADNA连接酶把目的连接酶把目的DNADNA片段和载体片段和载体DNADNA连接在一起，连接在一起，成为一个新成为一个新的重组

33、分子，这就是基因工程中常说的的重组分子，这就是基因工程中常说的DNADNA体外连接。目的体外连接。目的DNADNA片段片段被限制酶消化后其末端只可能有三种形式被限制酶消化后其末端只可能有三种形式 1.1.带有相同的粘性末端：带有相同的粘性末端：用同一种酶或同尾酶处理可得这样的末端。由于质粒载体也必须用用同一种酶或同尾酶处理可得这样的末端。由于质粒载体也必须用同样的酶消化，亦得两个相同的粘性末端，因此在连接反应中，外同样的酶消化，亦得两个相同的粘性末端，因此在连接反应中，外目的基因片段和质粒载体目的基因片段和质粒载体DNADNA均可能发生自身环化，均可能发生自身环化，而且正反两种而且正反两种连接

34、方向都有。为防止载体连接方向都有。为防止载体DNADNA自身环化，在连接前需除去载体分自身环化，在连接前需除去载体分子子5-p5-p，使之最大限度地抑制载体环化现象。使之最大限度地抑制载体环化现象。2.2.带有非互补的粘端带有非互补的粘端 用两种不同的限制酶进行消化可以产生这样的用两种不同的限制酶进行消化可以产生这样的末端。一般情况下，常用质粒载体的多克隆位点总能找到若干个不同末端。一般情况下，常用质粒载体的多克隆位点总能找到若干个不同的酶单酶切位点，用同样两种酶消化载体后，可将外源目的片段定向的酶单酶切位点，用同样两种酶消化载体后，可将外源目的片段定向克隆到载体上。克隆到载体上。3.3.带有

35、平末端带有平末端 由产生平末端的限制酶或核酸外切酶由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由消化产生，或由DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段补平片段补平33凹陷，使不相匹配的末凹陷，使不相匹配的末端转变为平端所致。端转变为平端所致。成功的连接反应需纯净的目的成功的连接反应需纯净的目的DNADNA片段，相对应的末端浓片段，相对应的末端浓度。一般采用插入片段与载体度。一般采用插入片段与载体DNADNA分子数比分子数比3 35:15:1。目的。目的基因比例太多，基因比例太多，易产生基因自连后插入载体的多聚体，易产生基因自连后插入载体的多聚体，根据插入片段和载体的分子量大小、计算

36、连接反应体系中根据插入片段和载体的分子量大小、计算连接反应体系中需要加入的各需要加入的各DNA DNA 片段含量。片段含量。粘性末端连接粘性末端连接 碱性磷酸酶去除碱性磷酸酶去除55磷酸基团磷酸基团 1.1.建立下列的反应系建立下列的反应系 线性化载体线性化载体 10l 10l 10CIP 10CIP缓冲液缓冲液 2l 2l 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 CIP 0.5l CIP 0.5l 双蒸水双蒸水 7.5l 7.5l 2.37 2.37水浴水浴15min15min 3.3.再加再加CIP 0.5lCIP 0.5l，置，置5555水浴水浴45min45min 4.4.加加2l0.5mol/L ED

37、TA,652l0.5mol/L EDTA,65灭活灭活15min15min 5.5.乙醇沉淀，乙醇沉淀，TETE溶解。溶解。载体与目的载体与目的DNADNA片段的连接片段的连接1.1.在在0.5ml EP0.5ml EP管中建立连接反应体系管中建立连接反应体系 线性化目的基因线性化目的基因 （0.4g 0.4g）4 l 4 l 载体载体DNA DNA（经（经CIPCIP处理）处理）1 l 1 l 10 10连接缓冲液连接缓冲液 1 l 1 l T4DNA T4DNA连接酶连接酶 1 l 1 l H2O H2O 至至 10 l 10 l2.162.16水浴水浴12 12 6h6h。3.3.取取2

38、 2 5l5l连接产物进行琼脂糖凝胶电泳。连接产物进行琼脂糖凝胶电泳。平粘端连接平粘端连接 1.1.制备目的基因酶切片段（如二端均为制备目的基因酶切片段（如二端均为EcoEcoRIRI粘端）。粘端）。2.2.制备载体酶切片段（一端为制备载体酶切片段（一端为EcoEcoRIRI粘端，一端为其它酶切的粘端）。粘端，一端为其它酶切的粘端）。3.3.用用T4T4连接酶连接匹配的粘末端（另一端不匹配，没有连接）。连接酶连接匹配的粘末端（另一端不匹配，没有连接）。4.4.用用KlenowKlenow补平不匹配的粘末端补平不匹配的粘末端 目的目的DNADNA和和/或线性载体或线性载体 0.5g 0.5g 1

39、0Klnow buffer 2l 10Klnow buffer 2l klenow klenow片段片段 1l 1l 2mmol/L dNTP 2l 2mmol/L dNTP 2l H2O H2O 至至20l20l 5.37 5.37水浴水浴1h1h，乙醇沉淀，溶于，乙醇沉淀，溶于7lTE7lTE（pH8.0pH8.0）。）。6.6.取上述取上述5lTE5lTE，加，加1l1l连接缓冲液，连接缓冲液，1l1l连接酶，连接酶，ddHddH2 2O 13lO 13l作作 用用16 16 20h20h。7.7.电泳观察连接效果（电泳观察连接效果（2lTE 2lTE 来自来自5,5,作连接前对照）并估

40、计含量。作连接前对照）并估计含量。8.8.取适量作转化。取适量作转化。重组重组DNADNA的转化的转化转化是将外源转化是将外源DNADNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷变异株，种方法。转化所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷变异株，即不含限性内切酶和甲基化酶。将对数生长期的细菌经理化方法处即不含限性内切酶和甲基化酶。将对数生长期的细菌经理化方法处理后，理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNADNA分子分子进入的感受态细胞。进入的感

41、受态细胞。进入受体细胞的进入受体细胞的DNADNA分子通过复制和表达实现分子通过复制和表达实现遗传信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的遗传信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，可筛出带有异源细胞在筛选培养基上培养，可筛出带有异源DNA DNA 分子的细胞。分子的细胞。试剂及仪器试剂及仪器 1.LB 1.LB液体培养基液体培养基 2.LB 2.LB固体培养基固体培养基 液体培养基中加液体培养基中加1.51.5琼脂糖琼脂糖 3.0.1mol/L CaCl2 3.0.1mol/L CaCl2 4.4.抗菌素抗菌素 5.5.培养箱培养箱 6.6

42、.恒温摇床恒温摇床 7.7.无菌操作台无菌操作台 受体菌的培养受体菌的培养 1.1.将甘油贮存受体菌将甘油贮存受体菌EColi DH5EColi DH5在在LBLB平板上划线平板上划线3737培养过液。培养过液。2.2.从平板上挑取单菌落接种于从平板上挑取单菌落接种于1ml LB1ml LB液体培养基中，液体培养基中，3737振摇过夜。振摇过夜。3.3.取取200200300l300l菌液转入菌液转入50ml LB50ml LB液体中，液体中，3737振荡培养振荡培养2.52.53h 3h 对数生长期对数生长期 A600=0.3 A600=0.30.5 0.5 感受态细胞的制备感受态细胞的制备

43、1.1.将培养的菌液冰上放置将培养的菌液冰上放置10min10min，倒入离心管内，倒入离心管内4000rpm10min4000rpm10min。2.2.弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，控干。弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，控干。3.3.沉淀轻悬于沉淀轻悬于10ml10ml预冷的预冷的0.1mol/L CaCl20.1mol/L CaCl2中，冰浴中，冰浴15min15min。此时此时为感受态细胞。为感受态细胞。4.4000rpm4.4000rpm，44离心离心10min10min，弃上清，沉淀悬于，弃上清，沉淀悬于2ml 0.1mol/L 2ml 0.1mol/L CaCl2CaCl2中。中

44、。5.5.分装成分装成100l/100l/小份于小份于EPEP管中。贮存管中。贮存12-24h12-24h可增加转化效率，超可增加转化效率，超 过过24h24h效率下降。效率下降。转化转化1.1.加外源加外源DNA 100DNA 100500ng(500ng(小于小于5l)5l)与与100l100l感受态细胞混匀，感受态细胞混匀，冰浴冰浴30min30min（阴性对照同时进行）。（阴性对照同时进行）。2.2.将管转移到将管转移到4242水浴中加热冲击水浴中加热冲击9090秒或秒或375min,375min,迅速置冰浴冷迅速置冰浴冷 却却3 3 5min5min。3.3.加加400l LB400

45、l LB，3737轻摇培养轻摇培养45min45min（使抗性基因表达）。（使抗性基因表达）。4.4.取取100l100l涂布于筛选平板上（加抗菌素），对照菌涂布于另一筛涂布于筛选平板上（加抗菌素），对照菌涂布于另一筛选平板。选平板。5.5.室温至液体吸收后，室温至液体吸收后，3737培养过夜。培养过夜。重组重组DNADNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区以区别转化子与非转化子，重组子与非重组子以及鉴定所需的特异别转化子与非转化子，重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使性重组子。在转化过程中，

46、并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含目的基因，所以需采用有效方法进获得转化细胞，也并非都含目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。行筛选。重组质粒的筛选重组质粒的筛选插入失活法筛选插入失活法筛选 原理原理 该法选用于含有个以上选择标志的载体，如该法选用于含有个以上选择标志的载体，如pBR322 pBR322 带有氨卞青霉素带有氨卞青霉素 和四环素抗性基因。若将外源基因插入和四环素抗性基因。若将外源基因插入tettet基因区后，则该基因失活，基因区后，则该基因失活，所构建的重组质粒转化菌落只能在所构建的重组质粒转化菌落只能在ApAp存在下生长，而不能在存在下生长，而不能在tett

47、et存在下存在下 生长。据此，判断含有重组质粒的菌落。生长。据此，判断含有重组质粒的菌落。操作操作 1.1.制备制备LBLB琼脂培养板分别含有琼脂培养板分别含有ApAp和和tettet。2.2.将将100l100l转化菌液用无菌玻璃涂布器分别均匀涂布于含转化菌液用无菌玻璃涂布器分别均匀涂布于含ApAp培养板培养板 表面，表面，置置3737培养箱培养箱20min20min后倒置培养后倒置培养121216h16h。3.3.挑取转化菌落并分别接种于挑取转化菌落并分别接种于ApAp培养板和培养板和tet tet 培养板的互相对应的培养板的互相对应的 位置上，位置上，3737培养培养121216h16h

48、。4.4.挑选在挑选在ApAp培养板生长而在培养板生长而在tet tet 培养板不能生长的菌落，并将其接培养板不能生长的菌落，并将其接 种于含种于含ApAp的的LBLB液体培养基液体培养基5ml5ml中培养中培养8 812h12h。5.5.小量制备质粒，限制酶切分析进一步鉴定小量制备质粒，限制酶切分析进一步鉴定。互补筛选互补筛选 适用于含有适用于含有半乳糖苷酶基因，半乳糖苷酶基因，LacZLacZ的载体，如的载体，如pUCpUC系列等，系列等，其原理是载体含有其原理是载体含有LacZLacZ的调控序列和的调控序列和N N端端146146个氨基酸的编码信息。个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入

49、了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码半乳糖苷酶端部分序列的宿主细胞后，它们可以融为一体，半乳糖苷酶端部分序列的宿主细胞后，它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫互补。由互补。由互补而产互补而产生的生的Lac+Lac+细菌在呈色底物细菌在呈色底物5-5-溴溴-4-4氯氯-3-3吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷，半乳糖苷，X-galX-gal和诱导剂异丙基硫代和诱导剂异丙基硫代-D-D-半乳糖苷，半乳糖苷，IPTGIPTG存在下形成蓝色菌落。存在下形成蓝色菌落。当外源当外源DNADNA插入到质粒

50、的多克隆位点后，插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无导致产生无互补能力互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备质粒质粒DNADNA进行限制酶切分析，可确定这些质粒的结构。进行限制酶切分析，可确定这些质粒的结构。试剂试剂X-gal(20mg/ml)X-gal(20mg/ml)将将20mgX-gal20mgX-gal溶于溶于1ml1ml二甲基甲酰胺中，二甲基甲酰胺中，-20-20避光存。避光存。IPTG(20