药物化学复习.ppt

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1、药物筛选复习课选择药物作用靶标的考虑因素选择药物作用靶标的考虑因素1靶标的有效性，即靶标与疾病确实相关，靶标的有效性，即靶标与疾病确实相关，并且通过调节靶标的生理活性能有效地改并且通过调节靶标的生理活性能有效地改善疾病症状。善疾病症状。2靶标的副作用，如果对靶标的生理活性靶标的副作用，如果对靶标的生理活性的调节不可避免地产生严重的副作用，那的调节不可避免地产生严重的副作用，那么将其选作药物作用靶标是不合适的。么将其选作药物作用靶标是不合适的。从天然资源中寻找微生物先导药从天然资源中寻找微生物先导药的一般流程的一般流程1.采集采集各种来源的样品各种来源的样品2.根据不同的分离要求进行根据不同的分

2、离要求进行处理处理3.对各类微生物对各类微生物分离分离纯化纯化4.分离菌株的分离菌株的培养、发酵培养、发酵5.应用各种模型对发酵产品进行高通量应用各种模型对发酵产品进行高通量筛选筛选6.对对活性物质活性物质进行化学进行化学分离纯化及结构测定分离纯化及结构测定7.活性物质体内外活性物质体内外活性评价活性评价8.先导化合物的先导化合物的结构优化及深入研发结构优化及深入研发9.放大放大发酵积累量进行发酵积累量进行临床研究临床研究影响微生物合成的主要因素影响微生物合成的主要因素影响其合成效率的主要因素有：所用微生物的种类、底物、影响其合成效率的主要因素有：所用微生物的种类、底物、酶、培养基类型、温度等

3、。酶、培养基类型、温度等。（一）（一）微生物微生物微生物种类不同，其代谢以及合成的产物的结构类型乃至微生物种类不同，其代谢以及合成的产物的结构类型乃至生物活性多不相同，扩大微生物的来源是寻找新的微生物生物活性多不相同，扩大微生物的来源是寻找新的微生物产物的有效途径之一产物的有效途径之一（二）（二）酶及底物酶及底物由于生物合成酶的底物专一性较低，在其野生型菌株或阻由于生物合成酶的底物专一性较低，在其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程中添加一些结构类似物可作为前体产断突变株的发酵过程中添加一些结构类似物可作为前体产生新的微生物产品生新的微生物产品（三）其他（三）其他培养条件培养条件微生物体具有的合成

4、能力在适宜其生长的条件下会增强，微生物体具有的合成能力在适宜其生长的条件下会增强，也会因改变培养基成分而随之也会因改变培养基成分而随之变化，当环境不利时则会抑变化，当环境不利时则会抑制其合成。制其合成。微生物发酵法微生物发酵法发酵是利用未固定的微生物在发酵罐中生长来获发酵是利用未固定的微生物在发酵罐中生长来获得所需产品，能够进行批次性的生产；得所需产品，能够进行批次性的生产；发酵罐通常为含微生物营养基的大槽或大桶。发发酵罐通常为含微生物营养基的大槽或大桶。发酵罐常配有能够调节培养基温度、酵罐常配有能够调节培养基温度、pH和氧气含量和氧气含量的调节器；的调节器；典型的培养基含碳源如葡萄糖、水合淀

5、粉或果糖；典型的培养基含碳源如葡萄糖、水合淀粉或果糖；蛋白质或氮源如大豆粉、玉米汤或棉籽粉；蛋白质或氮源如大豆粉、玉米汤或棉籽粉；维生素源如酵母提取物；矿物质和其他混合性营维生素源如酵母提取物；矿物质和其他混合性营养物。养物。初级代谢与次级代谢初级代谢与次级代谢一般将微生物通过一般将微生物通过代谢活动代谢活动所产生的所产生的自身繁殖所必需自身繁殖所必需的物质的物质和能量的过程，称为初级代谢，该过程所产生的产物即为初和能量的过程，称为初级代谢，该过程所产生的产物即为初级代谢产物，如氨基酸、核苷类，以及酶或辅酶等。级代谢产物，如氨基酸、核苷类，以及酶或辅酶等。微生物的初级代谢是指微生物从外界吸收各

6、种营养物质，通微生物的初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质物质和能量的过程。和能量的过程。次级代谢与初级代谢关系密切，次级代谢与初级代谢关系密切，次级代谢次级代谢是指微生物在一定是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢的关键性中间产物为前体物质，合的生长时期，以初级代谢的关键性中间产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程，这一成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程，这一过程的产物，即为次级代谢产物。过程的产物，即为次级代谢产物。次级代谢产物在微生物生命活动过程中

7、的产生极其微量，对次级代谢产物在微生物生命活动过程中的产生极其微量，对微生物微生物本身的生命活动没有明显作用本身的生命活动没有明显作用，当次级代谢途径被阻，当次级代谢途径被阻断时，菌体生长繁殖仍不会受到影响。断时，菌体生长繁殖仍不会受到影响。微生物固定法微生物固定法细胞固定就是细胞固定就是将微生物种在一个不溶的细胞将微生物种在一个不溶的细胞性或非细胞性模块性或非细胞性模块上，模块可以是合成的聚上，模块可以是合成的聚合物、生物聚合物或微生物体本身。合物、生物聚合物或微生物体本身。微生物固定有微生物固定有种常用的方法，包括在模块中种常用的方法，包括在模块中诱导诱导、模块上、模块上吸附吸附、压缩压缩

8、入模块、与模块以入模块、与模块以共价键结合共价键结合、细胞间的化、细胞间的化学交叉结合学交叉结合以及絮以及絮凝，最常用的是诱导。凝，最常用的是诱导。基因突变的种类基因突变的种类根据遗传信息的改变方式，可分为同义突变、错义突变和无义突变三根据遗传信息的改变方式，可分为同义突变、错义突变和无义突变三种。种。同义突变：改变后的密码子和改变前的密码子是简并密码子，它们编同义突变：改变后的密码子和改变前的密码子是简并密码子，它们编码同一种氨基酸，这种基因突变称为同义突变码同一种氨基酸，这种基因突变称为同义突变错义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码错义突变：由于一对或几对碱基对的改变

9、而使决定某一氨基酸的密码子变为决定另一种氨基酸的密码子的基因突变叫错义突变。这种基因子变为决定另一种氨基酸的密码子的基因突变叫错义突变。这种基因突变有可能使它所编码的蛋白质部分或完全失活突变有可能使它所编码的蛋白质部分或完全失活无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。其中密码子改变为子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。其中密码子改变为UAG的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAA的无义突变又叫的无义突变又叫赭石突变赭石突变基因突变

10、的特点基因突变的特点1、基因突变在生物界中是普遍存在的、基因突变在生物界中是普遍存在的2、基因突变是随机发生的。它可以发生在生物个、基因突变是随机发生的。它可以发生在生物个体发育的任何时期和生物体的任何细胞体发育的任何时期和生物体的任何细胞3、在自然状态下，对一种生物来说，基因突变的、在自然状态下，对一种生物来说，基因突变的频率是很低的频率是很低的4、大多数基因突变对生物体是有害的、大多数基因突变对生物体是有害的5、基因突变是不定向的。一个基因可以向不同的、基因突变是不定向的。一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因方向发生突变，产生一个以上的等位基因基因突变与药物靶标的发现及

11、应用基因突变与药物靶标的发现及应用在基因水平上寻找药物靶标过程：在基因水平上寻找药物靶标过程：1寻找疾病相关生物分子线索：利用基因突变技寻找疾病相关生物分子线索：利用基因突变技术获取疾病相关的生物分子信息，并进行生物信术获取疾病相关的生物分子信息，并进行生物信息学分析，获取线索。息学分析，获取线索。2对相关的生物分子进行功能研究，以确定候选对相关的生物分子进行功能研究，以确定候选药物作用靶标。药物作用靶标。3候选药物作用靶标，设计基因突变的候选药物作用靶标，设计基因突变的DNA及其及其多肽在分子、细胞和整体动物水平上进行药理学多肽在分子、细胞和整体动物水平上进行药理学研究。研究。4验证靶标的有

12、效性。验证靶标的有效性。What is a microarray?Microarray或或Biochip（生物芯片）是一种微型多参数生（生物芯片）是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的基片表面固定大量的分子识物传感器。它通过在一微小的基片表面固定大量的分子识别探针，或构建微分析单元和系统，实现对化合物、蛋白别探针，或构建微分析单元和系统，实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的筛选或检测。筛选或检测。Amicroarrayisanorderedarrayofmicroscopicelementsonaplana

13、rsubstratethatallowsthespecificbindingofgenesorgeneproducts.蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片是将各种蛋白质有序地固定在玻片、凝胶、微蛋白质芯片是将各种蛋白质有序地固定在玻片、凝胶、微孔板等各种载体上形成密集蛋白质芯片，用来高通量地测孔板等各种载体上形成密集蛋白质芯片，用来高通量地测定蛋白质的生物活性，如酶活性、蛋白质一蛋白质问及蛋定蛋白质的生物活性，如酶活性、蛋白质一蛋白质问及蛋白质一其它分子，如蛋白质一白质一其它分子，如蛋白质一DNA、蛋白质一配基问的相、蛋白质一配基问的相互作用。互作用。免疫共沉淀免疫共沉淀(Co-Immunopre

14、cipitation)免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行然后进行SDS-PAGE及及Westernblotting分析。分析。特

15、点特点优点：优点：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：缺点：缺点：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；

16、间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。放射免疫性检测放射免疫性检测(RIA，Radioimmunoassay）放射免疫性检测放射免疫性检测(RIA，Radioimmunoassay)的基本的基本原理是原理是利用标记抗原利用标记抗原(Ag*)和非标记抗原和非标记抗原(Ag)对特异性抗对特异性抗体体(Ab)发生竞争性结合，用已知不同浓度的标准物发生竞争性结合，用已知不同浓度的标准物和一定量的和一

17、定量的Ag*及限量的及限量的Ab反应，采取一定方法将反应，采取一定方法将Ag*-Ab与与Ag*分开，即可算出该标准物在各浓度下分开，即可算出该标准物在各浓度下Ag*-Ab复合物的结合百分率。复合物的结合百分率。然后，加入要筛选的目标物在标准曲线上即可查出然后，加入要筛选的目标物在标准曲线上即可查出样品中是否含有要筛选的目标物及其浓度。样品中是否含有要筛选的目标物及其浓度。亲和闪烁检测法亲和闪烁检测法ScintillationProximityAssay,SPA该技术使用能产生冷光的特制平板或圆球微粒，其底该技术使用能产生冷光的特制平板或圆球微粒，其底部或外层包被着连接分子，通过化学处理可使抗体

18、、部或外层包被着连接分子，通过化学处理可使抗体、受体蛋白质和酶偶联到含闪烁的微球体（荧光微球体受体蛋白质和酶偶联到含闪烁的微球体（荧光微球体或或SPA）的表面上，当其和同位素标记的配体特异性）的表面上，当其和同位素标记的配体特异性结合，近距离释放射线能量激发产生冷光，继而被探结合，近距离释放射线能量激发产生冷光，继而被探测器所监测；不能特异性结合的小分子，其标记同位测器所监测；不能特异性结合的小分子，其标记同位素所发出的射线能量大部分被水溶液散射，而不足以素所发出的射线能量大部分被水溶液散射，而不足以激发产生冷光。可使用闪烁计数器方便地测定。激发产生冷光。可使用闪烁计数器方便地测定。Homog

19、eneous AssaysOne-pot assays with no transfer or wash steps All the reagents are added in one step or in multisteps The signal is read in a plate readerHeterogeneous Assays多步筛选：多步筛选：multiple additions/incubations/washings/transfers/filtrations/readings of the signalLabor intensive,complicated step,ha

20、rd to automateSPR基本原理基本原理它它利利用用P P偏偏振振光光在在玻玻璃璃与与金金属属薄薄膜膜界界面面处处发发生生全全内内反反射射时时渗渗透透到到金金属属薄薄膜膜内内的的消消失失波波,引引发发金金属属中中的的自自由由电电子子产产生生表表面面等等离离子子体体,当当表表面面等等离离子子体体与与消消失失波波的的频频率率相相等等时时,二二者者将将发发生生共共振振,界界面面处处的的全全反反射射条条件件将将被被破破坏坏,呈呈现现衰衰减减全全反反射射现现象象，入入射射光光被被金金属属表表面面电电子子吸吸收收,使使反反射射光光能能量量急剧下降急剧下降SPR的优点的优点1.待测物无需标记待测物

21、无需标记2.适用于混浊、不透明或者有色溶液适用于混浊、不透明或者有色溶液3.能实时、连续监测反应动态过程能实时、连续监测反应动态过程4.检测方便、快捷检测方便、快捷5.应用范围广，检测灵敏度高应用范围广，检测灵敏度高6.始终保持生物分子的活性始终保持生物分子的活性SPR缺点缺点1.难以区分非特异性吸附难以区分非特异性吸附2.对温度、样品组成等干扰因素敏感对温度、样品组成等干扰因素敏感3.多步结合和多价结合的干扰多步结合和多价结合的干扰4.空间位阻效应空间位阻效应5.配体或者分析物的不均一配体或者分析物的不均一6.扩散速度的限制扩散速度的限制7.重结合现象重结合现象SPR的应用的应用对生物分子进

22、行识别及定量检测对生物分子进行识别及定量检测研究生物分子间的相互作用研究生物分子间的相互作用用用SPR可获得的信息：可获得的信息：1.两个分子之间结合的特异性两个分子之间结合的特异性2.目标分子的浓度目标分子的浓度3.结合以及解离过程的动力学参数结合以及解离过程的动力学参数4.结合的强度结合的强度报告基因检测报告基因检测报告基因检测（报告基因检测（reportgeneassay）报告基因报告基因(reportergene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把

23、它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。报告基因的特点：报告基因的特点：(1)已被克隆和全序列已测定；已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；达产物；(3)其表达产物能进行定量

24、测定。其表达产物能进行定量测定。报告基因的种类报告基因的种类1、氯霉素乙酰转移酶、氯霉素乙酰转移酶2、半乳糖苷酶、半乳糖苷酶3、人生长激素、人生长激素4、荧光素酶、荧光素酶5、荧光蛋白、荧光蛋白荧光产生的原因荧光产生的原因原子荧光光谱原子荧光光谱的产生的产生气态自由气态自由原子吸收原子吸收光源的特征辐射后，光源的特征辐射后，原子的外层电子跃迁到较高能级，然后又原子的外层电子跃迁到较高能级，然后又跃迁返回基态或较低能级，同时发射出与跃迁返回基态或较低能级，同时发射出与原激发波长相同或不同的发射即为原子荧原激发波长相同或不同的发射即为原子荧光。原子荧光是光致发光，也是二次发光。光。原子荧光是光致发

25、光，也是二次发光。当激发光源停止照射之后，再发射过程立当激发光源停止照射之后，再发射过程立即停止。即停止。时间分辨荧光（时间分辨荧光（HTRF）一般荧光技术的缺点是荧一般荧光技术的缺点是荧RF光寿命短，光寿命短，背景荧光高，激发光和发射光容易相互背景荧光高，激发光和发射光容易相互干扰干扰HTRF主要是利用碱土金属寿命长的特点，主要是利用碱土金属寿命长的特点，可以在激发和检测之间延缓一段时间，可以在激发和检测之间延缓一段时间，使具有不同荧光寿命的物质达到分别检使具有不同荧光寿命的物质达到分别检测的目的。同时通过荧光谐振能量传递测的目的。同时通过荧光谐振能量传递原理，区分开激发光和发射光原理，区分

26、开激发光和发射光荧光偏振（荧光偏振（FluorescencePolarization，FP）1926年年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。以首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。以一束单一波长的偏振光照射溶液中的荧光物质，后者可吸收并释放一束单一波长的偏振光照射溶液中的荧光物质，后者可吸收并释放出相应的偏振荧光。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质出相应的偏振荧光。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性，如果其处于运动状态，该物质发出仍将保持原有激发光的偏振性，如果其处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也

27、就是所谓荧光去偏振的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也就是所谓荧光去偏振现象。当荧光染料被单极光激发释放荧光，产生水平和垂直方向光现象。当荧光染料被单极光激发释放荧光，产生水平和垂直方向光束。水平和垂直方向光通量的比值即为偏振值（束。水平和垂直方向光通量的比值即为偏振值（mP）。）。mP大小主要大小主要由荧光物质分子旋转速度决定，而旋转速度与分子大小呈反比。小由荧光物质分子旋转速度决定，而旋转速度与分子大小呈反比。小分子荧光染料与其他分子结合后，分子量增加而旋转速度降低，则分子荧光染料与其他分子结合后，分子量增加而旋转速度降低，则荧光偏振值（荧光偏振值（Mp）升高；相反，如小分子荧光染料从

28、已结合的分子）升高；相反，如小分子荧光染料从已结合的分子上解离，则荧光偏振值降低。由于上解离，则荧光偏振值降低。由于FP直接检测水平和垂直方向光通直接检测水平和垂直方向光通量比值，量比值，Mp值不受绝对荧光强度的影响，具有操作简单、快速；分值不受绝对荧光强度的影响，具有操作简单、快速；分析结果稳定；成本低、高通量和易于自动化等优点。析结果稳定；成本低、高通量和易于自动化等优点。酶联免疫吸附酶联免疫吸附(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性

29、，又保留这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标后，

30、底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。的深浅进行定性或定量分析。双抗体夹心双抗体夹心ELISA1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原

31、与酶）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原。竞争性竞争性ELISA当抗原材料中的干扰物质不易除去，当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时

32、，可用此或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，从而反映出抗体相上的酶标抗体愈少，从而反映出抗体的量的量PCR引物的设计原则总述引物长度（引物长度（primerlength）产物长度（产物长度（productlength）序列序列Tm值值(meltingtemperature)G+C含量（含量（composition）引物二聚体及发夹结构引物二聚体及发夹结构（duplexform

33、ationandhairpin）阅读框阅读框中文名称：中文名称：质粒质粒英文名称：英文名称：plasmid 质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中，能独立于染色体质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中，能独立于染色体DNA而自主复制的共价，闭合，环状而自主复制的共价，闭合，环状DNA分子，其大小分子，其大小通常在通常在1-100kb范围内。质粒的复制和转录要依赖于宿主范围内。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些

34、额外的特性使宿主具有一些额外的特性具有对受体细胞的可移植性或亲和性具有对受体细胞的可移植性或亲和性具有与特定细胞相适应的复制位点和整合位点具有与特定细胞相适应的复制位点和整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的选择性标记具有合适的选择性标记质粒的改造和构建：指导思想质粒的改造和构建：指导思想1.1.删除不必要的删除不必要的删除不必要的删除不必要的DNADNA区域，尽量缩小质粒的相对分子质量，以提高外源区域，尽量缩小质粒的相对分子质量，以提高外源区域，尽量缩小质粒的相对分子质量，以提高外源区域，尽量缩小质粒的相对分子质量，以提高外源DNADNA片

35、段的装载量。片段的装载量。片段的装载量。片段的装载量。2.2.灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mobmob基因，基因，基因，基因，杜绝质粒扩散污染环境，保证杜绝质粒扩散污染环境，保证杜绝质粒扩散污染环境，保证杜绝质粒扩散污染环境，保证DNADNA重组实验的安全重组实验的安全重组实验的安全重组实验的安全3.3.加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含加

36、入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。有重组质粒的受体细胞。有重组质粒的受体细胞。有重组质粒的受体细胞。4.4.在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNADNA序列，同时删除重复的酶切位点。序列，同时删除重复的酶切位点。序列，同时删除重复的酶切位点。序列，同时删除重复的酶切位点。5.5.根据外源基因克

37、隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件或根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件或根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件或根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件或用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列。用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列。用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列。用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列。6.6.非结合型，即要求质粒不会从一个细菌转移到另一个细菌。非结合型，即要求质粒不会从一个细菌转移到另一个细菌。非结合型，即要求质粒不会从一个细菌转移到另一个细菌。非结合型，即要求质粒不会从一个细菌转移到另一个细菌

38、。肿瘤的发生不仅是分裂失控导致的细胞过度增生，同时也肿瘤的发生不仅是分裂失控导致的细胞过度增生，同时也可能是细胞凋亡通路受阻，使本该死亡的细胞继续存在而产可能是细胞凋亡通路受阻，使本该死亡的细胞继续存在而产生肿瘤，因此，选择性诱导肿瘤细胞凋亡为目标的技术已成生肿瘤，因此，选择性诱导肿瘤细胞凋亡为目标的技术已成为肿瘤治疗的重要策略之一。细胞凋亡是存在于细胞中的自为肿瘤治疗的重要策略之一。细胞凋亡是存在于细胞中的自毁机制，细胞凋亡能够使机体清除衰老和异常的细胞，在维毁机制，细胞凋亡能够使机体清除衰老和异常的细胞，在维持许多细胞功能方面起到重要作用。持许多细胞功能方面起到重要作用。1972年年ker

39、r等首先提出等首先提出“细胞凋亡细胞凋亡”这一概念，是由体内外这一概念，是由体内外因素触发的细胞内置的死亡程序诱导的细胞死亡过程。细胞因素触发的细胞内置的死亡程序诱导的细胞死亡过程。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，自己结束其生命的凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，自己结束其生命的过程，具有严格的基因时控性和选择性。生物体各种细胞的过程，具有严格的基因时控性和选择性。生物体各种细胞的数量都是通过增殖与死亡之间的平衡来完成的。数量都是通过增殖与死亡之间的平衡来完成的。细胞周期细胞周期细胞周期指由细胞分裂结束到下一指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所次细胞分裂结束所经历的过

40、程，所需的时间叫细胞周期时间。需的时间叫细胞周期时间。G1期期(gap1)，指从有丝分裂完成，指从有丝分裂完成到期到期DNA复制之前的间隙时间。复制之前的间隙时间。S期期(synthesisphase)，指，指DNA复制的时期，只有在这一时期复制的时期，只有在这一时期H3-TDR才能掺入新合成的才能掺入新合成的DNA中。中。G2期期(gap2)，指，指DNA复制完成复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间。到有丝分裂开始之前的一段时间。M期又称期又称D期期(mitosisordivision)，细胞分裂开始到结束。，细胞分裂开始到结束。微管的功能细胞内，微管以胞质微管和纺锤体微管两种形式存细胞内，

41、微管以胞质微管和纺锤体微管两种形式存在，主要参与细胞运动、细胞器的定位、胞内物质在，主要参与细胞运动、细胞器的定位、胞内物质的运输及真核细胞的有丝分裂过程。的运输及真核细胞的有丝分裂过程。细胞进入分裂期，其胞质微管解聚成微管蛋白后再细胞进入分裂期，其胞质微管解聚成微管蛋白后再组装成纺锤体微管。组装成纺锤体微管。在分裂后期，纺锤体微管牵引着姊妹染色单体从赤在分裂后期，纺锤体微管牵引着姊妹染色单体从赤道面移向纺锤体的两极。道面移向纺锤体的两极。在有丝分裂结束后，纺锤体微管解聚再组装成胞质在有丝分裂结束后，纺锤体微管解聚再组装成胞质微管。微管。抗结核药物的筛选What is 结核病?结核病是由结核杆

42、菌感染引起的慢性传染结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。一年四季都可以发病，染病。一年四季都可以发病，15岁到岁到35岁岁的青少年是结核病的高发峰年龄。潜伏期的青少年是结核病的高发峰年龄。潜伏期48周。其中周。其中结核杆菌结核杆菌80发生在肺部，发生在肺部，其他部位其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼骨骼)也可继发感染。人与人之间呼吸道传也可继发感染

43、。人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。传染源是接触播是本病传染的主要方式。传染源是接触排菌的肺结核患者。排菌的肺结核患者。结核杆菌结核杆菌当前抗结核治疗药物ScreenScreeninging临床常用治疗药物临床常用治疗药物当常规治疗失败后可使用二线抗结核药物当常规治疗失败后可使用二线抗结核药物临床常用治疗药物及耐药靶点临床常用治疗药物及耐药靶点一线抗结核药物作用靶点的突变使原有药物一线抗结核药物作用靶点的突变使原有药物的作用蛋白构像发生了改变的作用蛋白构像发生了改变利福平，异烟肼，链霉素，乙胺丁醇和吡嗪酰胺利福平，异烟肼，链霉素，乙胺丁醇和吡嗪酰胺 这些药物不良反应多、杀菌作用不强、疗

44、程必须使用这些药物不良反应多、杀菌作用不强、疗程必须使用个月以上，患者依从性差。个月以上，患者依从性差。卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、环丙沙卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、环丙沙星、阿米卡星和卡那霉素星、阿米卡星和卡那霉素不良反应较大，治疗时间更长（个月），花费昂不良反应较大，治疗时间更长（个月），花费昂贵，治愈率也更低贵，治愈率也更低年我国总耐药率为，其中年我国总耐药率为，其中初始耐药率为初始耐药率为.，获得性耐药率为，获得性耐药率为.抗结核药物新靶点与胞壁合成相关的新靶点与胞壁合成相关的新靶点与持留态有关的新靶点与持留态有关的新靶点与结核杆菌毒性相关的靶点与结

45、核杆菌毒性相关的靶点与核酸相关的靶点与核酸相关的靶点与胞壁合成相关的新靶点-肌醇-1-磷酸合成酶肌醇存在于分枝杆菌中肌醇存在于分枝杆菌中,与其生长繁殖密切相关。与其生长繁殖密切相关。肌醇是合成细胞壁的必须前体肌醇是合成细胞壁的必须前体结核杆菌利用肌醇合成其体内主要的硫醇结核杆菌利用肌醇合成其体内主要的硫醇分枝硫醇。分枝硫醇在分枝硫醇。分枝硫醇在维持分枝杆菌的氧化还原平衡、保护细胞免受氧化应激的伤害和半胱维持分枝杆菌的氧化还原平衡、保护细胞免受氧化应激的伤害和半胱氨酸的保存方面起着重要的作用氨酸的保存方面起着重要的作用,对细菌的生长和毒力具有重要意义。对细菌的生长和毒力具有重要意义。肌醇在细菌体

46、内合成的第一步是葡萄糖肌醇在细菌体内合成的第一步是葡萄糖-6-磷酸在肌醇磷酸在肌醇-1-磷酸合成酶磷酸合成酶(ino1,酶编号酶编号5.5.1.4)的催化下形成肌醇的催化下形成肌醇-1-磷酸。肌醇磷酸。肌醇-1-磷酸合成酶磷酸合成酶基因突变的结核杆菌，在正常的培养基上无法生长。基因突变的结核杆菌，在正常的培养基上无法生长。肌醇-1-磷酸合成酶故肌醇故肌醇-1-磷酸合成酶可以作为抗结核药物的靶位，而由此产生的药物磷酸合成酶可以作为抗结核药物的靶位，而由此产生的药物可能对结核杆菌具有较强的特异性。可能对结核杆菌具有较强的特异性。肌醇肌醇-1-磷酸合成酶也是真核生物中非常重要的多元醇。在设计和筛选磷

47、酸合成酶也是真核生物中非常重要的多元醇。在设计和筛选结核杆菌肌醇结核杆菌肌醇-1-磷酸合成酶抑制剂的时候，应尽量避免抑制剂对真核磷酸合成酶抑制剂的时候，应尽量避免抑制剂对真核生物的肌醇生物的肌醇-1-磷酸合成酶产生抑制作用，影响人体的正常生理功能，磷酸合成酶产生抑制作用，影响人体的正常生理功能，从而产生药物副作用。从而产生药物副作用。磷酸肌醇合成酶抑制剂磷酸肌醇合成酶抑制剂在在37摄氏度下，摄氏度下，0.5mM2-3H肌醇肌醇(12,000cpm/nmol)(用用3H标记标记)用用CHCl3作溶剂，同时加入作溶剂，同时加入Tris-HC1(pH8.3)48mMMgCl2,0.5mMPtd-CM

48、P,0.25%聚乙二醇辛基苯基聚乙二醇辛基苯基醚醚(TritonX-100),5mM类似物类似物,和和0.05mg的的微粒体蛋白，微粒体蛋白，配置成配置成0.1mL的溶液。反应的溶液。反应20分钟后加入分钟后加入0.5 mL的的0.1NHCl（含有（含有MeOH)和和0.5mLofCHCl3。用。用0.5mL的水分离。的水分离。有机质层的放射性用闪烁探测器来测定。有机质层的放射性用闪烁探测器来测定。肌醇抑制剂放入肌醇抑制剂放入F111细胞细胞将将F111细胞放入培养皿中培养一晚上，培养皿中加入细胞放入培养皿中培养一晚上，培养皿中加入10%经透析的胎经透析的胎牛血清和牛血清和10微克的肌醇。附着

49、在玻盖上的细胞用微克的肌醇。附着在玻盖上的细胞用Krebs-Ringer缓冲液缓冲液(135mMNaC1,4.6mMKC1,1.2mMCaCl2,lmM磷酸钠磷酸钠,1.3mMMgSO4,5mMHEPESpH7.41）冲洗两次，然后浸在含有）冲洗两次，然后浸在含有10pM3H】肌醇】肌醇(l000cpm/pmol)和和5mM类似物中，放入含有类似物中，放入含有5%CO2的恒温的恒温箱恒温在箱恒温在37摄氏度。摄氏度。120分钟后将细胞用分钟后将细胞用140mMNaCl冲洗六次，一份溶解在冲洗六次，一份溶解在1%SDS中，中，另一份溶解在另一份溶解在10%三氯乙酸中，然后离心分离。三氯乙酸中，然

50、后离心分离。最后细胞溶解液在闪烁探测器中测定放射性，用蛋白浓度测定试剂盒最后细胞溶解液在闪烁探测器中测定放射性，用蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质。测定蛋白质。与毒性有关的靶点与毒性有关的靶点-泛酸合成酶泛酸合成酶泛酸是一种泛酸是一种B族维生素族维生素(Vit&)，它是辅酶，它是辅酶A(CoA)和酰基载体蛋和酰基载体蛋白白(ACP)的生物合成的关键前体，的生物合成的关键前体，CoA和和ACP分子结构中的磷分子结构中的磷酸泛酰巯基乙胺来源于泛酸；酸泛酰巯基乙胺来源于泛酸；CoA和和ACP参与生物体内碳水参与生物体内碳水化合物、脂肪酸、蛋白质和能量代谢，是细胞生长过程中重化合物、脂肪酸、蛋白质和能量代