药物靶标发现与筛选.ppt

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1、药物靶标发现与筛选药物靶标发现与筛选一、基因靶标一、基因靶标 1、在基因数据库中搜寻药物靶标、在基因数据库中搜寻药物靶标（1）表达序列标志(expressed sequence tag,EST)数据库 （2）归纳逻辑设计程序 ESTEST是从一个随机选择的是从一个随机选择的cDNA cDNA 克隆进行克隆进行55端和端和33端端单一次测序获得的短的单一次测序获得的短的cDNA cDNA 部分序列部分序列,代表一个完整代表一个完整基因的一小部分基因的一小部分,在数据库中其长度一般从在数据库中其长度一般从20 20 到到7000bp 7000bp 不等不等,平均长度为平均长度为360 120bp

2、360 120bp。EST EST 来源于来源于一定环境下一个组织总一定环境下一个组织总mRNA mRNA 所构建的所构建的cDNA cDNA 文库文库,因此因此ESTEST也能说明该组织中各基因的表达水平。也能说明该组织中各基因的表达水平。首先从样品组织中提取首先从样品组织中提取mRNA,mRNA,在逆转录酶的作用下用在逆转录酶的作用下用oligo(dT)oligo(dT)作为引物进行作为引物进行RT-PCR RT-PCR 合成合成cDNA,cDNA,再选择再选择合适的载体构建合适的载体构建cDNA cDNA 文库文库,对各菌株加以整理对各菌株加以整理,将每一将每一个菌株的插入片段根据载体多

3、克隆位点设计引物进行两个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序端一次性自动化测序,这就是这就是EST EST 序列的产生过程。序列的产生过程。Copyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.et al.DNA Res 2006 13:275-286;doi:10.1093/dnares/dsl016Quantitative real-time RT-PCR of upregulated or downregulated genes randomly selected from the libraries of human normal S

4、N(黑质黑质)and PDs SNCopyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.et al.DNA Res 2006 13:275-286;doi:10.1093/dnares/dsl016Immunohistochemical staining for TH and alpha-tubulin in the SN of an MPTP mice modelTHalpha-tubulinCopyrightrestrictionsmayapply.Cell death activity of differentially expressed genes in PD

5、Upregulated genesDownregulated genesAminoAcidSequencesofOrexins(食欲素食欲素)andOrexinReceptors(A)Structuresofmatureorexin-Aand-BpeptidesCell1998;92(4):573-585 TissueDistributionofRatprepro-orexinandOrexinReceptormRNAsA Cell1998;92(4):573-585 Localizationofprepro-orexinmRNAandImmunoreactivePeptideinAdultR

6、atBrain Cell1998;92(4):573-585Up-Regulationofprepro-orexinmRNAinFastedRatsCell1998;92(4):573-585一、基因靶标一、基因靶标 2 2、基因芯片技术、基因芯片技术（1 1）普通基因芯片）普通基因芯片（2 2）ChIP-DSLChIP-DSL（coupling ChIP with a DNA selection and ligation strategy），芯片/DNA选择结扎技术基因芯片（基因芯片（Gene ChipGene Chip）通常指）通常指DNADNA芯片，其基本原理芯片，其基本原理是将指大量寡

7、核苷酸分子固定于支持物上，然后与标是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片的概念现已泛化到断样品中靶分子的数量。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）、微阵列（）、微阵列（MicroarrayMicroarray）、）、DNADNA芯片（芯片（DNA chipDNA chip），甚至蛋白芯片。），甚至蛋白芯片。INH(异烟阱异烟阱)-inducedmRNAexpressionprofilesmonitoredbymicroarray

8、hybridizationanalysis.用用INHINH处理处理INH INH 敏感敏感的结核菌株的结核菌株(红红:INH:INH处处理的理的;绿绿:INH:INH未处理的未处理的)PNAS1999;96(22):12833-12838.用用INH处理处理INH耐药的结核菌株耐药的结核菌株用乙硫异烟胺处理用乙硫异烟胺处理INH耐药的结核菌株耐药的结核菌株TemporalprofileofINH-inducedexpressionofselectedgenes.PNAS1999;96(22):12833-12838.RolesofINH-inducedgenesinthecontextofa

9、proposedpathwayformycolicacid(结核环脂酸结核环脂酸)biosynthesis.PNAS1999;96(22):12833-12838.TheChIP-DSLschemePNAS2007;104（2):4852-4857E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;10

10、4（2):4852-4857一、基因靶标一、基因靶标3、基因敲除（、基因敲除（knock-out)技术技术AninhibitoryglycinesynapseTrendsPharmacolSci.2005;26(6):283-286GLYT:GLYT:甘氨酸酸转运子甘氨酸酸转运子Aglutamatesynapse.TrendsPharmacolSci.2005;26(6):283-286 GMS:GMS:修饰后的修饰后的NMDANMDA受体受体FlowchartoftheKnockoutStrategyCurrBiol.2005;15(18):1663-1669 mde2IsRequiredf

11、orSegregationofHomologousCentromeresduringMeiosisICurrBiol.2005;15(18):1663-1669 Deletionofmde2PermitsaStrainExpressingaRec8ProteinRefractorytoSeparaseCleavagetoUndergotheFirstMeioticDivisionwithoutPrecociousSeparationofSisterChromatids CurrBiol.2005;15(18):1663-1669 CurrBiol.2005;15(18):1663-1669 D

12、ouble-Strand-BreakFormationIsStronglyReducedinmde2一、基因靶标一、基因靶标4 4、检测报告基因、检测报告基因把靶基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连转导入细胞内把靶基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连转导入细胞内,通过简单地检测酶活性的变化通过简单地检测酶活性的变化,就可以反映化合物对转录因子和基因就可以反映化合物对转录因子和基因表达的作用性质和程度。这种能间接反映基因转录水平的编码某种酶表达的作用性质和程度。这种能间接反映基因转录水平的编码某种酶活性的基因称为报告基因。活性的基因称为报告基因。StructureofSB2474

13、64Science.1998;281(5374):257-259 ActivityofG-CSF(粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子)andSB247464inNFS60cellluciferaseassaysScience.1998;281(5374):257-259 PhosphorylationofsignalingproteinsincellstreatedwithSB247464orG-CSF.Science.1998;281(5374):257-259 ThemurineG-CSFreceptorconfersresponsivenesstoSB247464.Science.19

14、98;281(5374):257-259未转染受体未转染受体转染转染CSF受体受体GranulocyticcolonyformationinresponsetoSB247464invitro.GranulopoieticactivityofSB247464invivo.Science.1998;281(5374):257-259一、基因靶标一、基因靶标5 5、低等生物功能基因组筛选、低等生物功能基因组筛选 Drug entry route into C.elegans(Drug entry route into C.elegans(秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫)Nat Rev Drug Disco

15、v2006;5:387-398The serotonergic synapse of C.elegans.Nat Rev Drug Discov2006;5:387-398Overview of the RNA interference supported target identification processNat Rev Drug Discov 2006;5:387-398 Chemical genetics as a tool for target site identificationNat Rev Drug Discov2006;5:387-398 Chemical geneti

16、cs as a tool for target site identificationNat Rev Drug Discov2006;5:387-398ProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419Curing of a nematode E.faecalis infection on solid medium by antibiotic treatment Tet:四环素四环素Cipro:万古霉素万古霉素Van:环丙沙星环丙沙星ProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419The liquid infection

17、 assay gauges differences in nematode killing due to E.faecalis strains with varying degrees of pathogenicity or due to antibiotic treatment.Cyl:溶细胞素溶细胞素Amp:氨苄青霉素氨苄青霉素Scoring live/dead worms in the liquid killing assay Proc Natl Acad Sci U S A.2006;103(27):10414-10419 二、核糖核酸靶标二、核糖核酸靶标1、核酶技术核酶技术 核酶(r

18、ibozyme)核酶核酶:用于描述具有催化活性的用于描述具有催化活性的RNA,RNA,即化学本即化学本 质是核糖核酸质是核糖核酸(RNA)(RNA)，却具有酶的催化功能。却具有酶的催化功能。内含子内含子(intron)(intron)内含子是基因内的间隔序内含子是基因内的间隔序列，它不出现在成熟的列，它不出现在成熟的RNARNA分子中，也就是分子中，也就是说在转录后要通过加工被切除。说在转录后要通过加工被切除。外显子外显子(exon)(exon)最后出现在成熟最后出现在成熟RNARNA中的基中的基因序列。因序列。核酶的发现核酶的发现:1981 1981年，年，Thomas CechThomas

19、 Cech和他的同事在研究和他的同事在研究四膜虫的四膜虫的26S rRNA26S rRNA前体加工去除基因内含前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现子时获得一个惊奇的发现内含子的切除内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S 26S rRNArRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是液中，可能的解释只能是:内含子切除是由内含子切除是由26S rRNA26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。前体自身催化的，而不是蛋白质。核酶的证实核酶的证实 为了证明这一发现，他们将编码为了证明这一发现，他们将编码2

20、6S rRNA26S rRNA前前体体DNADNA克隆到细菌中并在无细胞系统中转录成克隆到细菌中并在无细胞系统中转录成26S rRNA26S rRNA前体分子。结果发现这种人工制备前体分子。结果发现这种人工制备的的26S rRNA26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。这种现象称为自我剪接子。这种现象称为自我剪接(self-splicing)(self-splicing)，这是人类第一次发现，这是人类第一次发现RNARNA具有催化化学反应具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的的活

21、性，具有这种催化活性的RNARNA称为核酶。称为核酶。Thomas Cech Thomas Cech 因发现了核酶而获得因发现了核酶而获得19891989年诺年诺贝尔化学奖。贝尔化学奖。内含子的切除内含子的切除:核酶的作用机理核酶的作用机理 除了除了rRNArRNA前体中有内含子前体中有内含子,tRNA,tRNA和和mRNAmRNA前体中前体中都有内含子的存在都有内含子的存在,这些内含子都要通过加工这些内含子都要通过加工被切除被切除,才能得到成熟的才能得到成熟的rRNArRNA、tRNAtRNA或或mRNAmRNA。虽然这些虽然这些RNARNA中内含子切除的机理各不相同中内含子切除的机理各不相

22、同,但都涉及到核酶的作用。但都涉及到核酶的作用。核剪接核剪接(nuclear splicing)(nuclear splicing)真核生物的结构基因中一般都含有内含子，真核生物的结构基因中一般都含有内含子，转录后，从转录后，从pre-mRNApre-mRNA中将内含子切除，然后中将内含子切除，然后将外显子重新连接成一个成熟的将外显子重新连接成一个成熟的mRNAmRNA的过程的过程称为称为RNARNA剪接剪接(RNA splicing)(RNA splicing)。鸡的卵清蛋白基因中有鸡的卵清蛋白基因中有鸡的卵清蛋白基因中有鸡的卵清蛋白基因中有7 7 7 7个内含子，转录后需要被个内含子，转录

23、后需要被个内含子，转录后需要被个内含子，转录后需要被切除，切除，切除，切除，8 8 8 8个外显子连接起来形成有功能的个外显子连接起来形成有功能的个外显子连接起来形成有功能的个外显子连接起来形成有功能的mRNAmRNAmRNAmRNA。鸡的卵清蛋白基因初始鸡的卵清蛋白基因初始RNARNA转录物的剪接转录物的剪接 核酶种类核酶种类:1.1.1.1.发卡状核酶发卡状核酶2.2.2.2.锤头状核酶锤头状核酶3.3.3.3.I I型内含子核酶型内含子核酶4.4.4.4.RnasePRnaseP核酶核酶5.5.5.5.丁型肝炎病毒核酶丁型肝炎病毒核酶Ribozyme design and gene ac

24、tivation NucleicAcidsRes.2002;30(24):e141 Ribozyme-mediated phenotype alteration on indicator media.NucleicAcidsRes.2002;30(24):e141 Testfortarget-independentgrowthonselectivemedia.NucleicAcidsRes.2002;30(24):e141Relative growth rate of strains expressing ribozymes with DTA sequences as the 3 exon N

25、ucleic Acids Res.2002;30(24):e141 二、核糖核酸靶标二、核糖核酸靶标2 2、反义寡核苷酸反义寡核苷酸 反义寡核苷酸反义寡核苷酸(antisense(antisense oligonucleotide,asON)oligonucleotide,asON)人工合成的，与人工合成的，与靶基因或靶基因或mRNAmRNA某一区段互补的核酸片断，某一区段互补的核酸片断，可以通过碱基互补原则结合于靶基因可以通过碱基互补原则结合于靶基因/mRNA/mRNA上上,从而封闭基因的表达。包括：反义从而封闭基因的表达。包括：反义DNADNA，反义反义RNARNA，其来源可有人工合成和体

26、内其来源可有人工合成和体内表达两类。表达两类。反义寡核苷酸可用于基因沉默，所以是一反义寡核苷酸可用于基因沉默，所以是一种研究基因功能的重要工具。大多数药物种研究基因功能的重要工具。大多数药物属于靶标基因（或疾病基因）的抑制剂，属于靶标基因（或疾病基因）的抑制剂，因此反义寡核苷酸模拟了药物的作用，这因此反义寡核苷酸模拟了药物的作用，这功能丢失（功能丢失（LOF)LOF)的研究方法比传统的功能的研究方法比传统的功能获得（获得（GOF)GOF)方法更具优势。同时，那些在方法更具优势。同时，那些在靶标实验中证明有效的反义寡核苷酸本身靶标实验中证明有效的反义寡核苷酸本身还可以被进一步开发成为反义寡核苷酸

27、药还可以被进一步开发成为反义寡核苷酸药物。物。Table 1.PS-ODNs targeting the M.tuberculosis 30,32A,and 32B protein(分枝酰基转移酶分枝酰基转移酶)gene transcriptsmRNAtarget53mRNAtarget53PS-ODN53PS-ODN5330-kDaprotein30-kDaprotein30:12430:124AATCTTTCGGCTCACGTCTGTCATAATCTTTCGGCTCACGTCTGTCAT30:HP2/HP130:HP2/HP1GCGCATATGCGCGCGCATATGCGCAATCTTTC

28、GGCTCACGTCTGTCATAATCTTTCGGCTCACGTCTGTCATGCGCGCGCGCGCGCGC30:124-MM30:124-MMAtTCaTTtGGtTCtCGaCTcTCtTAtTCaTTtGGtTCtCGaCTcTCtT30:HP2/HP1-MM30:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCGCGCATATGCGCAtTCaTTtGGtTCcCGaCTcTCtTAtTCaTTtGGtTCcCGaCTcTCtTGCGCGCGCGCGCGCGC32A-kDaprotein32A-kDaprotein32A:12432A:124ACGAACCCTGTCAACAAGCTGC

29、ATACGAACCCTGTCAACAAGCTGCAT32A:HP2/HP132A:HP2/HP1GCGCATATGCGCGCGCATATGCGCACGAACCCTGTCAACAAGCTGCATACGAACCCTGTCAACAAGCTGCATGCGCGCGCGCGCGCGC32A:124-MM32A:124-MMAgGAtCCtTGaCAtCAtGCaGCtTAgGAtCCtTGaCAtCAtGCaGCtT32A:HP2/HP1-MM32A:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCGCGCATATGCGCAtGAtCCaTGcCAgCAtGCaGCtTAtGAtCCaTGcCAgCAtGCa

30、GCtTGCGCGCGCGCGCGCGC32B-kDaprotein32B-kDaprotein32B:12432B:124TCGCACCTGTTCGAAGAACGTCATTCGCACCTGTTCGAAGAACGTCAT32B:HP2/HP132B:HP2/HP1GCGCATATGCGCGCGCATATGCGCTCGCACCTGTTCGAAGAACGTCATTCGCACCTGTTCGAAGAACGTCATGCGCGCGCGCGCGCGC32B:124-MM32B:124-MMTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtTTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtT32B:HP2/HP1-

31、MM32B:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCGCGCATATGCGCTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtTTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtTGCGCGCGCGCGCGCGCPS-ODNs:antisensephosphorothioateoligodeoxyribonucleotides;MM:错配的核苷酸错配的核苷酸HPS-ODNs:5-,3-hairpin-modifiedPS-ODNs发夹修饰的反义寡核苷酸发夹修饰的反义寡核苷酸Inhibition of M.tuberculosis growth by antisense HPS-ODNs speci

32、fic for the 30/32-kDa protein gene plex.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204Specific inhibition of protein synthesis by antisense HPS-ODNs.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204Inhibition of 30,32A,and 32B protein gene transcript synthesis ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204HPS-ODN inh

33、ibition of M.tuberculosis multiplication in human macrophages Proc Natl Acad Sci U S A.2007;104(17):7199-7204 二、核糖核酸靶标二、核糖核酸靶标3、RNA干扰技术干扰技术 转录后基因表达抑制现象的发现转录后基因表达抑制现象的发现CHS GeneCHS Gene矮牵牛花矮牵牛花(Jorgensen,R,1990)(Jorgensen,R,1990)CHS:CHS:与色素合成相关的与色素合成相关的酶酶,以加深花的颜色以加深花的颜色RNAi 现象的发现现象的发现线虫（线虫（C.elegans)

34、C.elegans)(Andrew(Andrew Fire,1998Fire,1998)+Par-1 Gene Par-1 Gene DisruptionDisruptionExpressionExpressionDownDownDouble Strand RNADouble Strand RNA线线 虫，虫，果果 蝇蝇微生物，微生物，植植 物物 失败的原因失败的原因:在合成反义在合成反义RNARNA时存在技术问题时存在技术问题,用于注射的正用于注射的正义和反义义和反义RNARNA中都混有少量双链中都混有少量双链RNARNAdsRNAdsRNADicer cleavage of dsRNADi

35、cer cleavage of dsRNAsiRNAsiRNARNAi RNAi 抑制基因表达的机理抑制基因表达的机理siRNA associatedsiRNA associatedWith RISC plexWith RISC plexCell MembraneCell Membrane5POH3Target mRNATarget mRNADicer:Dicer:是一种核酸是一种核酸酶酶,将双链将双链RNARNA降解成降解成21-23bp21-23bp的小干扰的小干扰RNARNARISC:RNARISC:RNA诱导的诱导的沉默小体沉默小体,他是由他是由单链单链siRNAsiRNA与一些与一些

36、蛋白形成的复合体蛋白形成的复合体RNARNA干扰干扰(RNA interference,RNAi)(RNA interference,RNAi)RNAi RNAi 是将一段双链的是将一段双链的RNA RNA 序列导入机体或细胞中序列导入机体或细胞中,机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到抑制机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到抑制,甚至表达受到完全抑制甚至表达受到完全抑制Decreased human MK expression in PC-3 cells transfected with various siRNAsCancer.2006;107(4):864-873 MK

37、:MK:肝素结合细胞因子肝素结合细胞因子Effect of treatment with MK siRNA bined with PTX(紫杉醇)on PC-3 cell viability and anchorage-independent growthCancer.2006;107(4):864-873 PTX:siRNA-SCR:siRNA-SCR:乱序乱序siRNSsiRNSDetermination of a suitable dose and the duration of the siRNA to downregulate MK in PC-3 xenograftsCancer.

38、2006;107(4):864-873 Antitumor effect of MK siRNA in PC-3 xenografts.Cancer.2006;107(4):864-873 三、蛋白质靶标三、蛋白质靶标1 1、抗体和胞内抗体抗体和胞内抗体 抗体除对组织和细胞中特异性抗原进行定位外，尚有强大的中和能力阻断蛋白质功能。对于细胞内的靶分子，需要以合适的方式将抗体导入细胞。显微注射是一种将抗体注入细胞的方式，但是这种方式难以做到高通量，影响了药物靶标发现验证的速度。为了满足高通量研究的需要，Moris 创建了一套化学试剂方法将抗体导入细胞，而抗体的功能和细胞的活性不受影响。另一种将抗体

39、导入细胞的方式是让抗体在细胞内表达(intrabodies)，其中包括使用灭活病毒的方法。A bispecific,tetravalent intradiabody JBiolChem.2003;278(48):47812-47819Intrabody and Tie-2/VEGF-R2 colocalization on HUVEC JBiolChem.2003;278(48):47812-47819A,kinetics of surface expression of Tie-2 and VEGF-R2 after gene transfer of the intradiabody and

40、 conventional scFv intrabodies on HUVEC using rebinant adenoviruses with an MOI of 10 B,gene transfer of intrabodies directed to human Tie-2,VEGF-R2,or Tie-2/VEGF-R2 by rebinant adenoviruses on day 6 after infection JBiolChem.2003;278(48):47812-47819Inhibition of capillary tube formation in vitro J

41、Biol Chem.2003;278(48):47812-47819 三、蛋白质靶标三、蛋白质靶标2 2、生色团、生色团辅助激光灭活辅助激光灭活(chromophore-assistedlaserinactivation,CALI)CALlCALl能够直接对蛋白质进行操作，而不是能够直接对蛋白质进行操作，而不是通过对蛋白质量的变化进行检测。将标记通过对蛋白质量的变化进行检测。将标记有孔雀绿染料的非功能灭活抗体与特异性有孔雀绿染料的非功能灭活抗体与特异性蛋白质结合，然后对蛋白质复合物进行激蛋白质结合，然后对蛋白质复合物进行激光照射。染料受激光激发短暂的产生活性光照射。染料受激光激发短暂的产生活性

42、分子，对结合的蛋白质造成破坏而起到灭分子，对结合的蛋白质造成破坏而起到灭活作用，但不影响其他蛋白质组分。活作用，但不影响其他蛋白质组分。A lentiviral system for simultaneous knockdown and rescue with a functional EGFP-fusion plement.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707CALI of EGFP-CP induces the formation of dorsal ruffles and filopodia only in the knockdown/res

43、cue background.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707CALI of EGFP-CP in KDR cells generates a local increase in barbed ends of actin filaments and dorsal F-actin.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707CALI of EGFP-Mena in Mena/VASP-deficient cells induces more stable lamellipodial protrusions P

44、roc Natl Acad Sci U S A.2007;104(16):6702-6707 三、蛋白质靶标三、蛋白质靶标3 3、蛋白质组技术、蛋白质组技术 基基 因因基因是一段基因是一段DNADNA（脱氧核糖核酸分子脱氧核糖核酸分子）双链。双链。碱基成对出现碱基成对出现:-ATCGGCC-:-ATCGGCC-TAGCCGG-TAGCCGG-基因表达中的信息流基因表达中的信息流中心中心法则（法则（The The C Central entral D Dogmaogma）蛋白质翻译蛋白质翻译蛋白质结构的层次蛋白质结构的层次一级结构一级结构 -氨基酸序列氨基酸序列二级结构二级结构 -主要由氢键稳固

45、的局部构象，主要由氢键稳固的局部构象，如如-helix,-helix,-sheet-sheet等等三级结构三级结构 -三维构象三维构象四级结构四级结构 -多个多肽链的组合多个多肽链的组合蛋白质结构的图形描述蛋白质结构的图形描述分子表面分子表面 -分子可视化分子可视化 -分子对接分子对接 -基于结构的药物设计基于结构的药物设计 -蛋白质组分析的首要要求l l将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。l l2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照

46、组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白

47、溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定蛋白质二维电泳：蛋白质二维电泳：蛋白质提取蛋白质提取样品前处理样品前处理一向等一向等电聚焦电聚焦二向二向SDSPAGE凝胶银染及扫描凝胶银染及扫描双向电泳分双向电泳分析软件分析析软件分析差异蛋白差异蛋白质点的质质点的质普分析普分析生物信息数据查询、建立蛋白质数据库生物信息数据查询、建立蛋白质数据库双向电泳分析中的样品制备制备原则制备原则：l l应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括应使所有待分析的蛋白样

48、品全部处于溶解状态（包括应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。l l防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。l l防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止在样品制

49、备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。l l完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。l l尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。待研究蛋白的可检测性。待研究蛋白的可检测性。待研究蛋白的可检测性。可溶性样品可溶性样品 固体组织样品固

50、体组织样品 细胞细胞不同样品的基本处理方法不同样品的基本处理方法样品的分级处理样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。样品的溶解l l是是2-DE2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。成功分离蛋白质的最关键因素之一。l l溶解的目标：溶解的目标：1 1、样品中非共价结合的蛋白质复合样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使液（否则样品中结合