实验一 特殊显微镜的工作原理和使用.ppt

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1、实验一实验一特殊显微镜的工作原理和使用特殊显微镜的工作原理和使用放大倍数和数值孔径放大倍数和数值孔径10/0.25，40/0.65 ，100/1.3标准机械筒长和盖玻片厚度标准机械筒长和盖玻片厚度160/0.17160/0或或160/160/-/0或或/-油浸物镜：油浸物镜：oil、oel、Hi等等水浸物镜：水浸物镜：W或或Water甘油浸物镜：甘油浸物镜：Glyz和和Glye复消色差物镜：复消色差物镜：APO半复消色差物镜：半复消色差物镜：FL平场物镜：平场物镜：PL特殊显微镜是与明视场普通显微镜相对而言，在成像原理、结构和用途上存在差异的显微镜。这里介绍：1、暗视场显微镜 2、相差显微镜

2、3、荧光显微镜 一、一、暗视场显微镜暗视场显微镜应用：应用：应用：应用：微小粒子、细菌微小粒子、细菌形态、细菌记数，透形态、细菌记数，透明标本观察等。明标本观察等。(一)原理和结构特点 在日常生活中，室内飞扬的微粒灰在日常生活中，室内飞扬的微粒灰在日常生活中，室内飞扬的微粒灰在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间尘是不易被看见的，但在暗的房间尘是不易被看见的，但在暗的房间尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，中若有一束光线从门缝斜射进来，中若有一束光线从门缝斜射进来，中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的灰尘便粒粒可见了，这是光

3、学上的灰尘便粒粒可见了，这是光学上的灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。丁达尔现象。丁达尔现象。丁达尔现象。暗视场显微镜就是利用此原理设计暗视场显微镜就是利用此原理设计暗视场显微镜就是利用此原理设计暗视场显微镜就是利用此原理设计的。的。的。的。丁达尔现象丁达尔现象暗视场显微镜是在普通光学显微镜中去除明视场聚光器，暗视场显微镜是在普通光学显微镜中去除明视场聚光器，暗视场显微镜是在普通光学显微镜中去除明视场聚光器，暗视场显微镜是在普通光学显微镜中去除明视场聚光器，换上一个暗视场聚光器而成。换上一个暗视场聚光器而成。换上一个暗视场聚光器而成。换上一个暗视场聚光器而成。它的结构特点主要是使用中央

4、遮光板或暗视场聚光器，它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视场聚光器，它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视场聚光器，它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视场聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡,不不不不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上。倾斜地照射在观察的标本

5、上。倾斜地照射在观察的标本上。倾斜地照射在观察的标本上。明场普通显微镜成像光路图明场普通显微镜成像光路图暗场照明光路图暗场照明光路图成像特点及优缺点成像特点及优缺点在暗视野中所观察到的是被检物体的在暗视野中所观察到的是被检物体的在暗视野中所观察到的是被检物体的在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像衍射光图像衍射光图像衍射光图像,并非物并非物并非物并非物体的本身，所以只能看到物体的体的本身，所以只能看到物体的体的本身，所以只能看到物体的体的本身，所以只能看到物体的存在和运动存在和运动存在和运动存在和运动，不能辨清物，不能辨清物，不能辨清物，不能辨清物体的细微结构，只能呈现出物体的轮廓而且比实

6、物要大。体的细微结构，只能呈现出物体的轮廓而且比实物要大。体的细微结构，只能呈现出物体的轮廓而且比实物要大。体的细微结构，只能呈现出物体的轮廓而且比实物要大。但被检物体为非均质时，并大于但被检物体为非均质时，并大于但被检物体为非均质时，并大于但被检物体为非均质时，并大于1 12 2波长，则各级衍射光波长，则各级衍射光波长，则各级衍射光波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨一般暗视野显

7、微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最最最最大的分辨力为大的分辨力为大的分辨力为大的分辨力为0.2um)0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞所不具有的特性，可用以观察活细胞所不具有的特性，可用以观察活细胞所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的的结构和细胞内微粒的的结构和细胞内微粒的的结构和细胞

8、内微粒的运动运动运动运动等。等。等。等。(二)制作中央遮光板 普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野安装暗视野安装暗视野安装暗视野聚光器聚光器聚光器聚光器，即可改装成暗视野显微镜。，即可改装成暗视野显微镜。，即可改装成暗视野显微镜。，即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普在无

9、暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。(1)(1)将显微镜聚光器调到最高位置，用低将显微镜聚光器调到最高位置，用低将显微镜聚光器调到最高位置，用低将显微镜聚光器调到最高位置，用低倍镜对好焦距。倍镜对好焦距。倍镜对好焦距。倍镜对好焦距。(2)(2)取下目镜，从镜筒中观察并调节光阑取下目镜，从镜筒中观察并调节光阑取下目镜，从镜筒中观察并调节光阑取下目镜，从镜筒中观察并调

10、节光阑的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。(3)(3)用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径与滤光片框架相同，中央部分的大小与调节与滤光片框架相同，中央部分的大小与调节与滤光片框架相同，中央部分的大小与调节与滤光片框架相同，中央部分的大小与调节好的光阑孔径一样好的光阑孔径一样好的光阑孔径一样好的光阑孔径一样(可用半透明的小纸片，可用半透明的小纸片，可用半透明的小纸片，可用半透明的小纸

11、片，放在通光孔处聚光镜镜面上，纸上显示的光放在通光孔处聚光镜镜面上，纸上显示的光放在通光孔处聚光镜镜面上，纸上显示的光放在通光孔处聚光镜镜面上，纸上显示的光斑即为光阑的孔径，再用圆规量取大小斑即为光阑的孔径，再用圆规量取大小斑即为光阑的孔径，再用圆规量取大小斑即为光阑的孔径，再用圆规量取大小)。(4)(4)将中央挡光板放在滤光片框架上，开将中央挡光板放在滤光片框架上，开将中央挡光板放在滤光片框架上，开将中央挡光板放在滤光片框架上，开大光阑进行样品观察。大光阑进行样品观察。大光阑进行样品观察。大光阑进行样品观察。如需使用高倍镜作暗视野观察，应按高倍镜对焦后的视野大小如需使用高倍镜作暗视野观察，应

12、按高倍镜对焦后的视野大小如需使用高倍镜作暗视野观察，应按高倍镜对焦后的视野大小如需使用高倍镜作暗视野观察，应按高倍镜对焦后的视野大小重新制作中央挡光板。重新制作中央挡光板。重新制作中央挡光板。重新制作中央挡光板。要求与注意事项要求与注意事项(1)(1)制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻片片片片(载玻片厚度约载玻片厚度约载玻片厚度约载玻片厚度约1.O1.O1.1mm1.1mm，盖玻片厚度约，盖玻片厚度约，盖玻

13、片厚度约，盖玻片厚度约0.1mm)0.1mm)，否则会影响，否则会影响，否则会影响，否则会影响暗视野集光器斜射光焦点的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻暗视野集光器斜射光焦点的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻暗视野集光器斜射光焦点的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻暗视野集光器斜射光焦点的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。(2)(2)采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物像不清晰。采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物

14、像不清晰。采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物像不清晰。采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物像不清晰。(3)(3)调节光源：使光线集中在暗视野集光器上。先用低倍镜观察，移调节光源：使光线集中在暗视野集光器上。先用低倍镜观察，移调节光源：使光线集中在暗视野集光器上。先用低倍镜观察，移调节光源：使光线集中在暗视野集光器上。先用低倍镜观察，移动暗视野集光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央。如暗视动暗视野集光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央。如暗视动暗视野集光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央。如暗视动暗视野集光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央。如暗视野

15、集光器已准确固定好，则可免去这一步骤。野集光器已准确固定好，则可免去这一步骤。野集光器已准确固定好，则可免去这一步骤。野集光器已准确固定好，则可免去这一步骤。(4)(4)先在暗视野的集光器上加香柏油一滴，然后将标本放在载物台上，先在暗视野的集光器上加香柏油一滴，然后将标本放在载物台上，先在暗视野的集光器上加香柏油一滴，然后将标本放在载物台上，先在暗视野的集光器上加香柏油一滴，然后将标本放在载物台上，把暗视野集光器向上移，使其上的柏木油与标本片的底面接触，中间把暗视野集光器向上移，使其上的柏木油与标本片的底面接触，中间把暗视野集光器向上移，使其上的柏木油与标本片的底面接触，中间把暗视野集光器向上

16、移，使其上的柏木油与标本片的底面接触，中间不能有气泡存在。不能有气泡存在。不能有气泡存在。不能有气泡存在。(5)(5)高倍观察：在标本高倍观察：在标本高倍观察：在标本高倍观察：在标本盖玻片上盖玻片上盖玻片上盖玻片上再加香柏油一滴，降下镜筒，使油镜再加香柏油一滴，降下镜筒，使油镜再加香柏油一滴，降下镜筒，使油镜再加香柏油一滴，降下镜筒，使油镜浸在香柏油内，再用粗、细螺旋调节物镜的焦距，有时还需稍微升降浸在香柏油内，再用粗、细螺旋调节物镜的焦距，有时还需稍微升降浸在香柏油内，再用粗、细螺旋调节物镜的焦距，有时还需稍微升降浸在香柏油内，再用粗、细螺旋调节物镜的焦距，有时还需稍微升降暗视野集光器以调节

17、斜射光焦点，使其正好落在标本上，并且调节油暗视野集光器以调节斜射光焦点，使其正好落在标本上，并且调节油暗视野集光器以调节斜射光焦点，使其正好落在标本上，并且调节油暗视野集光器以调节斜射光焦点，使其正好落在标本上，并且调节油镜头的光圈，相互配合，直到物像清楚为止，即可开始检查。镜头的光圈，相互配合，直到物像清楚为止，即可开始检查。镜头的光圈，相互配合，直到物像清楚为止，即可开始检查。镜头的光圈，相互配合，直到物像清楚为止，即可开始检查。也可用低倍或高倍物镜进行镜检，这就不必在盖玻片上加香柏油。也可用低倍或高倍物镜进行镜检，这就不必在盖玻片上加香柏油。也可用低倍或高倍物镜进行镜检，这就不必在盖玻片

18、上加香柏油。也可用低倍或高倍物镜进行镜检，这就不必在盖玻片上加香柏油。普通显微镜普通显微镜暗视场显微镜暗视场显微镜相差显微镜相差显微镜人口腔上皮细胞在不同显微镜下的图像人口腔上皮细胞在不同显微镜下的图像（二（二）相差显微镜相差显微镜原理和结构特点原理和结构特点光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达指在某一时间上光的波动所能达指在某一时间上光的波动所能达指在某一时间上光的波动所能达到的位置到的位置到的位置到的位置)的不同。当光波遇到物体时，其的不同。当光

19、波遇到物体时，其的不同。当光波遇到物体时，其的不同。当光波遇到物体时，其波长波长波长波长(颜色颜色颜色颜色)和和和和振幅振幅振幅振幅(亮度亮度亮度亮度)发生变化，发生变化，发生变化，发生变化，于是就能看到物体，于是就能看到物体，于是就能看到物体，于是就能看到物体，当光波通过当光波通过当光波通过当光波通过透明透明透明透明的物体时，虽然物体的内部不同结构会有厚度和折光率不同的物体时，虽然物体的内部不同结构会有厚度和折光率不同的物体时，虽然物体的内部不同结构会有厚度和折光率不同的物体时，虽然物体的内部不同结构会有厚度和折光率不同的差异，而波长和振幅则仍然是不会发生改变的。因此，就不易看清这些不的差异

20、，而波长和振幅则仍然是不会发生改变的。因此，就不易看清这些不的差异，而波长和振幅则仍然是不会发生改变的。因此，就不易看清这些不的差异，而波长和振幅则仍然是不会发生改变的。因此，就不易看清这些不同的结构。同的结构。同的结构。同的结构。用普通光学显微镜观察一些活的微生物或其他细胞等透明物体时，也就不易用普通光学显微镜观察一些活的微生物或其他细胞等透明物体时，也就不易用普通光学显微镜观察一些活的微生物或其他细胞等透明物体时，也就不易用普通光学显微镜观察一些活的微生物或其他细胞等透明物体时，也就不易分清其内部的细微结构。分清其内部的细微结构。分清其内部的细微结构。分清其内部的细微结构。但是，光线通过但

21、是，光线通过但是，光线通过但是，光线通过厚度不同厚度不同厚度不同厚度不同的透明物体时，其的透明物体时，其的透明物体时，其的透明物体时，其相位相位相位相位却会发生改变，形成却会发生改变，形成却会发生改变，形成却会发生改变，形成相差。不过，相差不表现为明暗和颜色的差异，这种微小的变化，人相差。不过，相差不表现为明暗和颜色的差异，这种微小的变化，人相差。不过，相差不表现为明暗和颜色的差异，这种微小的变化，人相差。不过，相差不表现为明暗和颜色的差异，这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以

22、观察到。眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。我们可以利用光学的相干干涉原理，可以把我们可以利用光学的相干干涉原理，可以把我们可以利用光学的相干干涉原理，可以把我们可以利用光学的相干干涉原理，可以把相差改变为振幅差相差改变为振幅差相差改变为振幅差相差改变为振幅差，这样，这样，这样，这样就能使透明的、厚度和性质不均匀的结构表现就能使透明的、厚度和性质不均匀的结构表现就能使透明的、厚度和性质不均匀的结构表现就能使透明的、厚度和性质不均匀的结构表现明暗明暗明暗明暗的不同，能够较清的不同，能够较清的不同，能够较清的不同，能够较清楚地予以区别。楚地予以区别。楚地予以区别。楚地予以区别。如果这两

23、条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失，滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失，滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失，滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失，或者相对振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波或者相对振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波或者相对

24、振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波或者相对振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波长长长长,但两条光波位相相同但两条光波位相相同但两条光波位相相同但两条光波位相相同,则因波的叠加而光线增强则因波的叠加而光线增强则因波的叠加而光线增强则因波的叠加而光线增强-明相差明相差+暗相差暗相差相差显微镜，能够通过相差显微镜，能够通过其复杂的结构，改变直其复杂的结构，改变直射光或衍射光的相位，射光或衍射光的相位，并且利用光的并且利用光的衍射衍射衍射衍射和和干干涉涉涉涉现象，现象，把相差变成振把相差变成振把相差变成振把相差变成振幅差，即明暗差幅差，即明暗差幅差，即明暗差幅差，即明

25、暗差，可以，可以被我们的感觉器官所感被我们的感觉器官所感知。知。同时它还吸收部分直射同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。活细胞或未染色标本。相差显微镜的构造特点相差显微镜的构造特点相差显微镜的构造以普通显微镜为基础，与普通显相差显微镜的构造以普通显微镜为基础，与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜用带相板的物镜(通常标有通常标有PHPH的标记的标记)代替普通物代替普通物镜，并带有一个调节合轴用的望远镜。镜，并带有一个调节合轴用的望远镜。

26、相差环则是由大小不同的环状孔形相差环则是由大小不同的环状孔形相差环则是由大小不同的环状孔形相差环则是由大小不同的环状孔形成的光阑，放置在光源通路上，使成的光阑，放置在光源通路上，使成的光阑，放置在光源通路上，使成的光阑，放置在光源通路上，使光线只能由环状部分通过，环状光光线只能由环状部分通过，环状光光线只能由环状部分通过，环状光光线只能由环状部分通过，环状光圈的大小可由集光镜的数值口径圈的大小可由集光镜的数值口径圈的大小可由集光镜的数值口径圈的大小可由集光镜的数值口径(N.A)(N.A)来调节。来调节。来调节。来调节。环状光圈的大小由不同大小的环状环状光圈的大小由不同大小的环状环状光圈的大小由

27、不同大小的环状环状光圈的大小由不同大小的环状孔控制。环状光阑的直径和孔宽是孔控制。环状光阑的直径和孔宽是孔控制。环状光阑的直径和孔宽是孔控制。环状光阑的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是与不同的物镜相匹配的。其作用是与不同的物镜相匹配的。其作用是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁将直射光所形成的像从一些衍射旁将直射光所形成的像从一些衍射旁将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。像中分出来。像中分出来。像中分出来。相差环相差环相差物镜是在物镜的后焦点处加一环状相板。相差物镜是在物镜的后焦点处加一环状相板。相差物镜是在物镜的后焦点处加一环状相板。相差物镜是在物镜

28、的后焦点处加一环状相板。相板由光学玻璃制成，安装在物镜的后焦面处，相板装有相板由光学玻璃制成，安装在物镜的后焦面处，相板装有相板由光学玻璃制成，安装在物镜的后焦面处，相板装有相板由光学玻璃制成，安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，具有改变相位的吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，具有改变相位的吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，具有改变相位的吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，具有改变相位的作用。作用。作用。作用。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使它

29、除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。放大倍数不同的物镜，其相板也不亮度发生变化的作用。放大倍数不同的物镜，其相板也不亮度发生变化的作用。放大倍数不同的物镜，其相板也不亮度发生变化的作用。放大倍数不同的物镜，其相板也不同。同。同。同。调轴望远镜：是用来进行调轴望远镜：是用来进行调轴望远镜：是用来进行调轴望远镜：是用来进行合铀合铀合铀合铀调节的。使用不同的相差物镜时，应配调节的。使用不同的相差物镜时，应配调节的。使用不同的相差物镜时，应配调节的。使用不同的相差物镜时，应配合相应的环状光圈，并用合轴调节望远镜观察环状光圈和相板，调节合相应的环状光圈，并用合轴调节望远镜

30、观察环状光圈和相板，调节合相应的环状光圈，并用合轴调节望远镜观察环状光圈和相板，调节合相应的环状光圈，并用合轴调节望远镜观察环状光圈和相板，调节至环状光圈的亮环与相板的暗环完全重合。这样，光线通过标本后，至环状光圈的亮环与相板的暗环完全重合。这样，光线通过标本后，至环状光圈的亮环与相板的暗环完全重合。这样，光线通过标本后，至环状光圈的亮环与相板的暗环完全重合。这样，光线通过标本后，就必须经过相板而发生相位的改变，造成明暗差异的影像。就必须经过相板而发生相位的改变，造成明暗差异的影像。就必须经过相板而发生相位的改变，造成明暗差异的影像。就必须经过相板而发生相位的改变，造成明暗差异的影像。要使得聚

31、光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必要使得聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必要使得聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必要使得聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。效能。效能。效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不

32、能吸收，该推迟相否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。环状光圈、相差物镜配合与调节好之后，其他操作方法与普通光学显环状光圈、相差物镜配合与调节好之后，其他操作方法与普通光学显环状光圈、相差物镜配合与调节好之后，其他操作方法与普通光学显环状光圈、相差物镜配合与调节好之后，其他操作方法与普通光学显微镜相同。微镜相同。微镜相同。微镜相同。使用方法

33、使用方法（1 1）相差装置的调换安装）相差装置的调换安装 卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。（2 2）调焦）调焦 打开光源，旋转集光器转盘，将打开光源，旋转集光器转盘，将“0”0”对准标示对准标示孔，使普通

34、聚光器部分进入光路。先使用低倍相差孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。旋旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为物镜相适应，如相差物镜为40X40X时应用时应用40X40X标示孔的标示孔的光阑。光阑。（3 3）合铀调整）合铀调整 拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜向内观察，并用左手固定其外筒；一边用右镜向内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能手转动望远镜

35、内筒使其上升，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合。合。（4 4）观察）观察 换回目镜，按常规要领进行观察。在更换换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。配的环状光阑。用途相差显微镜是利用样品中质点折射率的不同

36、或质相差显微镜是利用样品中质点折射率的不同或质点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本不必染色就可以看到，而且能够观察到活细胞内不必染色就可以看到，而且能够观察到活细胞内线粒体及染色体等精细结构，还可以应用于霉菌、线粒体及染色体等精细结构，还可以应用于霉菌、细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察，并数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察，并可进行量度与比较。可进行量度与比较。用途：观察未经染色的玻片标本用途：观察未经染色的玻片标本用途用途特点特点:鉴定活体细胞最实

37、用、最经济的方法鉴定活体细胞最实用、最经济的方法缺点缺点:需要光强高需要光强高切片不能太厚切片不能太厚(510um)盖片、载片需符合标准盖片、载片需符合标准最好配用单色滤光镜最好配用单色滤光镜荧光效果不如明场物镜荧光效果不如明场物镜三、荧光显微镜三、荧光显微镜荧光概念荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光回到低能状态时释放出

38、的光，是非温度辐射光回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光冷光。冷光。冷光。冷光。可分为：化学荧光（氧化还原反应发出的荧光）、可分为：化学荧光（氧化还原反应发出的荧光）、可分为：化学荧光（氧化还原反应发出的荧光）、可分为：化学荧光（氧化还原反应发出的荧光）、光化荧光光化荧光光化荧光光化荧光（光源（光源（光源（光源激发而产生的荧光）、生物荧光、放射荧光。激发而产生的荧光）、生物荧光、放射荧光。激发而产生的荧光）、生物荧光、放射荧光。激发而产生的荧光）、生物荧光、放射荧光。荧光显微镜应用的是荧光显微镜应用的是荧光显微镜应用的是荧光显微镜应用的是光化荧光。光化荧光。光化荧光。光化荧光。荧光现象：荧

39、光物质吸收长波光（荧光现象：荧光物质吸收长波光（荧光现象：荧光物质吸收长波光（荧光现象：荧光物质吸收长波光（320-400nm320-400nm）的能量，以较长波）的能量，以较长波）的能量，以较长波）的能量，以较长波长的可见光形式发射出去，这种现象就是荧光现象。长的可见光形式发射出去，这种现象就是荧光现象。长的可见光形式发射出去，这种现象就是荧光现象。长的可见光形式发射出去，这种现象就是荧光现象。荧光的性质：荧光的性质：1 1、吸收光，必需有激发光源吸收光，必需有激发光源 2 2、荧光波长激发波长（损失热能）、荧光波长激发波长（损失热能）3 3、荧光强度小于激发光的强度、荧光强度小于激发光的强

40、度 4 4、有不同程度的衰减、有不同程度的衰减 5 5、荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光效率荧光的产生一次荧光：又叫自发荧光或固有荧光，经过紫外光照射一次荧光：又叫自发荧光或固有荧光，经过紫外光照射一次荧光：又叫自发荧光或固有荧光，经过紫外光照射一次荧光：又叫自发荧光或固有荧光，经过紫外光照射直接发出荧光。直接发出荧光。直接发出荧光。直接发出荧光。二次荧光：又叫继发荧光，被观察物体经过荧光染料处二次荧光：又叫继发荧光，被观察物体经过荧光染料处二次荧光：又叫继发荧光，被观察物体经过荧光染料处二次荧光：又叫继发荧光，被观察物体经过荧光染料处理

41、之后，经过紫外光照射才能发出荧光。理之后，经过紫外光照射才能发出荧光。理之后，经过紫外光照射才能发出荧光。理之后，经过紫外光照射才能发出荧光。荧光染料种类很多：荧光染料种类很多：荧光染料种类很多：荧光染料种类很多：荧光显微镜原理荧光显微镜原理荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光过滤色系统发出一定波长的光过滤色系统发出一定波长的光过滤色系统发出一定波长的光(如波长短的紫外如波长短的紫外如波长短的紫外如波长短的紫外光光光光365nm365nm或紫蓝光

42、或紫蓝光或紫蓝光或紫蓝光420nm420nm)作为激发光、激发标作为激发光、激发标作为激发光、激发标作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。再通过物镜和目镜的放大进行观察。再通过物镜和目镜的放大进行观察。再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于

43、细胞结构和功能易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。以及化学成分等的研究。以及化学成分等的研究。以及化学成分等的研究。荧光显微镜结构特点荧光显微镜结构特点荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件上一些附件上一些附件上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束如荧光光源、激发滤片、双色束如荧光光源、激发滤片、双色束如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片分离器和阻断

44、滤片分离器和阻断滤片分离器和阻断滤片等等等等)的基础上组成的。的基础上组成的。的基础上组成的。的基础上组成的。光源现在多采用现在多采用现在多采用现在多采用200W200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅内充一定数量的汞，工作时

45、由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达速升高，当水银完全蒸发时，可达速升高，当水银完全蒸发时，可达速升高，当水银完全蒸发时，可达50507070个标准大气压力，这一过程一般约个标准大气压力，这一过程一般约个标准大气压力，这一过程一般约个标准大气压力，这一过程一般约需需需需5 515min15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫

46、光，足以激发各类荧光物程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。质，因此，为荧光显微镜普遍采用。质，因此，为荧光显微镜普遍采用。质，因此，为荧光显微镜普遍采用。超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条

47、件，工作环境温度不宜太高。温度不宜太高。温度不宜太高。温度不宜太高。200W200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用超高压汞灯的平均寿命，在每次使用超高压汞灯的平均寿命，在每次使用超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h2h的情况下约为的情况下约为的情况下约为的情况下约为200h200h，开动一次，开动一次，开动一次，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min20min，则寿命降低，则寿命降低，则寿命降低，则寿命降低50%50%。因。因。因。因此，使用时尽量此，使

48、用时尽量此，使用时尽量此，使用时尽量减少启动次数减少启动次数减少启动次数减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭点燃灯泡后不可立即关闭点燃灯泡后不可立即关闭点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸，以免水银蒸，以免水银蒸，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等发不完全而损坏电极，一般需要等发不完全而损坏电极，一般需要等发不完全

49、而损坏电极，一般需要等15min15min。超高压汞灯（超高压汞灯（超高压汞灯（超高压汞灯（100W100W或或或或200W200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。射镜，前面

50、安装有集光透镜。射镜，前面安装有集光透镜。射镜，前面安装有集光透镜。滤色系统荧光光源的采用超高压汞灯，它可发出各种波长的光，但每种荧光光源的采用超高压汞灯，它可发出各种波长的光，但每种荧光光源的采用超高压汞灯，它可发出各种波长的光，但每种荧光光源的采用超高压汞灯，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有荧光物质都有荧光物质都有荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有