蛋白质的共价结构教学内容.ppt

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1、蛋白质的共价结构蛋白质的含氮量蛋白质的含氮量v氮氮占占生生物物组组织织中中所所有有含含氮氮物物质质的的绝绝大大部部分分。因因此此，可可以以将将生生物物组组织织的的含含氮氮量量近近似似地地看看作作蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量。由由于于大大多多数数蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量接接近近于于16%16%，所所以以，可可以以根根据据生生物物样样品品中中的的含含氮氮量量来来计计算算蛋蛋白白质质的大概含量：的大概含量：v蛋蛋白白质质含含量量（克克%）=每每克克生生物物样样品品中中含含氮的克数氮的克数 6.25 6.25蛋白质的分类蛋白质的分类一、按化学组成分一、按化学组成分1、单纯蛋白：只含蛋白成分、单纯蛋

2、白：只含蛋白成分2、缀合蛋白：蛋白、缀合蛋白：蛋白+辅基辅基二、按功能分二、按功能分单纯蛋白单纯蛋白又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成氨基酸组成的肽链，不含其它成分。的肽链，不含其它成分。1 1，清蛋白和球蛋白：，清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。溶于稀酸中。2 2，谷蛋白，谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于蛋白

3、，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70708080乙醇中。乙醇中。3 3，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。4 4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。缀合蛋白缀合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成。由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成。1 1、色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。、色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。

4、2 2、糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如、糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。细胞膜中的糖蛋白等。3 3、脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。、脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如如血清血清-，-脂蛋白等。脂蛋白等。4 4、核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如、核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。细胞核中的核糖核蛋白等。1.酶类酶类,占细胞内蛋白质种类的绝大部分占细胞内蛋白质种类的绝大部分2.运输蛋白运输蛋白,如如albumin,hemoglobin,transferrin等等3.收缩运动蛋白收缩运动蛋白,如如actin,myosin,tuboli

5、n等等4.激素蛋白激素蛋白,如如insulin,growth hormone等等5.细胞激动素细胞激动素(cytokinin),如如EGF,PDGF,IL-2等等6.受体蛋白受体蛋白,如如insulin receptor,rhodopsin等等7.毒素蛋白毒素蛋白,如如cholera toxin,ricin,pertussis t.8.营养贮藏蛋白营养贮藏蛋白,如如prolamine,glutelin等等9.防御蛋白防御蛋白,如如IgG等等10.结构蛋白结构蛋白,如如keratin,collagen等等按功能的蛋白质分类法按功能的蛋白质分类法按功能的蛋白质分类（二）蛋白质的形状和大小（二）蛋白

6、质的形状和大小按形状和溶解度可将蛋白质分为：按形状和溶解度可将蛋白质分为：1、纤维蛋白、纤维蛋白2、球状蛋白、球状蛋白3、膜蛋白、膜蛋白四、按肽链构成分四、按肽链构成分1、单体蛋白、单体蛋白 2、寡聚蛋白或多聚蛋白、寡聚蛋白或多聚蛋白蛋白质的大小蛋白质的大小蛋白质是由一条或多条多肽蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链链以特殊方式结合而成的生物大分子。以特殊方式结合而成的生物大分子。l蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。决定于蛋白质和分子量概念的定义。l某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基某些蛋白质是由两

7、个或更多个蛋白质亚基(多多肽链肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。千万。primary structure 一级结构：多肽链的一级结构：多肽链的氨基氨基酸序列酸序列secondary structure 二级结构：多肽链借助氢二级结构：多肽链借助氢键排列成的有规则键排列成的有规则螺旋，螺旋，折叠折叠tertiary structure 三级结构：三级结构：多肽链借助各多肽链借助各种非共价键折叠成的紧密球状构象种非共价键折叠成的紧密球状构象 quanternary st

8、ructure 四级结构：寡聚四级结构：寡聚蛋白质蛋白质中各亚基在空间上的相互关系和结合方式中各亚基在空间上的相互关系和结合方式 示意图如下：示意图如下：（三）蛋白质的结构层次（三）蛋白质的结构层次蛋白质结构层次二、二、肽肽（一）（一）肽和肽键结构肽和肽键结构一个氨基酸的氨基一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的与另一个氨基酸的羧基之间失水形成羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称所形成的化合物称为肽。为肽。l由由两两个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称称为为二二肽肽，由由多多个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽则则称称为为多多肽肽。组组成成多多肽肽的的氨氨基基酸酸单单元元称

9、为氨基酸残基称为氨基酸残基。在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨氨基，称为氨基端或基端或N-N-端；端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基，称为羧基端或羧基端或C-C-端。端。氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨端氨基酸残基为终点基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln命名：某氨基酰某氨基酰某氨基酸 或某某肽有时两端会连接成环状态 肽键肽键肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基

10、具有明显的共轭作用。组组成成肽肽键键的的原原子子处处于于同同一一平平面面，肽肽键键是是指指构构成成这这一一平平面的面的-CO-NH-CO-NH-。肽键肽键肽肽键键中中的的C-NC-N键键具具有有部部分分双键性质，不能自由旋转。双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式在大多数情况下，以反式结构存在。结构存在。肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连肽键与氨基酸四肽的结构四肽的结构（三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以但是，也有许

11、多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。其中很殊的生理功能，常称为活性肽。其中很多作为激素发挥作用。多作为激素发挥作用。如：如：谷胱甘肽谷胱甘肽（P168P168）；脑啡肽；激素）；脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；蛇毒多肽。类多肽；抗生素类多肽；蛇毒多肽。+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研

12、究的基础。自从研究的基础。自从19531953年年F.SangerF.Sanger测定测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。上千种不同蛋白质的一级结构被测定。蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primary structure)包括：包括：1 1、组成蛋白质的多肽链、组成蛋白质的多肽链数目数目.2 2、多肽链的氨基酸顺序，、多肽链的氨基酸顺序，3 3、多肽链内或链间二硫、多肽链内或链间二硫键的数目和位置。键的数目和位置。其中最重要的是多肽链其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋的氨基酸顺序，它

13、是蛋白质生物功能的基础。白质生物功能的基础。测定蛋白质的一级结构的基本要测定蛋白质的一级结构的基本要求：求：1 1，样品必需纯（，样品必需纯（97%97%以上）；以上）；2 2，知道蛋白质的相对分子量。，知道蛋白质的相对分子量。（一）蛋白质测序的策略（一）蛋白质测序的策略蛋白质一级结构测定的步骤蛋白质一级结构测定的步骤1、测定蛋白质多肽链数目、测定蛋白质多肽链数目2、拆分蛋白质分子多肽链、拆分蛋白质分子多肽链3、断开链内二硫键、断开链内二硫键4、分析每一多肽链氨基酸组成、分析每一多肽链氨基酸组成5、鉴定多肽链、鉴定多肽链N-末端和末端和C-末端末端6、多种方法的部分水解，分离水解后得到的小片段

14、、多种方法的部分水解，分离水解后得到的小片段多肽多肽7、测定上述小片段多肽的序列、测定上述小片段多肽的序列8、利用交叉重叠法拼出一条完整多肽链、利用交叉重叠法拼出一条完整多肽链9、确定二硫键位置、确定二硫键位置测定步骤测定步骤1 1、测定蛋白质分子中多肽链的数目、测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。链的数目。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定测定步骤测定步骤2、多肽链的拆分多肽链的拆分。几条多肽链借助非共价键连

15、接在一起，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为称为寡聚蛋白质寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚，如，血红蛋白为四聚体。体。可用可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍处理，盐酸胍处理，即可分开多肽链即可分开多肽链(亚基亚基).).蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定测定步骤测定步骤3、二硫键的断裂二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还巯基乙醇处理，使

16、二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。的巯基，以防止它重新被氧化。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定4 4、测定每测定每条多肽链条多肽链的氨基酸的氨基酸组成，并组成，并计算出氨计算出氨基酸成分基酸成分的分子比；的分子比；进行完全进行完全水解后用水解后用氨基酸自氨基酸自动分析仪动分析仪测定测定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定测定步骤测定步骤5 5、分析多肽链的、分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端。末端。多肽链末端氨基酸分为两类：

17、多肽链末端氨基酸分为两类：N-N-端氨基端氨基酸酸(amino-terminal)(amino-terminal)和和C-C-端氨基酸。端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定N N末端和末端和C C末端残基鉴定末端残基鉴定N N末端：末端：1、DNFB（Sanger）法）法2、丹磺酰氯（、丹磺酰氯（DNS）法）法3、PITC（Edman）法）法4、酶法、酶法C C末端：末端：1、肼解法肼解法2、酶降解法、酶降解法 末端测序法（1）San

18、gerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链能够与肽链N-N-端的游离氨基作用，生成二硝端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（基苯衍生物（DNPDNP）。）。在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸，氨基酸，其余为游离氨基酸。该产物能够用乙醚抽提其余为游离氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法（层氨基酸可以用色谱法（层析法）进行鉴定。析法）进行鉴定。N N-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定（1 1）二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法Sanger

19、Sanger试剂试剂(FDNB)(FDNB)标记标记N N末端末端Sanger试剂标记反应在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与氯）可以与N-N-端氨基酸的游离氨基作用，得端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰到丹磺酰-氨基酸。氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到质，检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。N N-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定（2 2）丹磺酰氯法）丹磺酰氯法（3）苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯法（法（PITC法）法）DABITC DABITC ：有色

20、有色EdmanEdman试剂试剂在在EdmanEdman试剂上加发色基团试剂上加发色基团氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-N-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为氨酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端

21、的肽键速度最大。N N-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定（4 4）氨肽酶法氨肽酶法此法是多肽链此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法。多肽与肼端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即从肽链上端氨基酸即从肽链上解离出来，解离出来，其余的氨基酸其余的氨基酸则变成则变成肼化物肼化物。肼。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与与C-C-端氨基酸分离。端氨基酸分离。C C-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定（1 1）肼解法肼解法蛋白质与无水肼加热蛋白质与无水肼加热 -NH-CH-CONH-CH-COOH|Rx Ry -NH-CH-

22、CONH-NH2 +NH2-CH-COOH|Rx RyC末端的肼末端的肼(hydrazine)法测定法测定NHNH2 2NHNH2 2，100100，5 510h10h溶于有机溶剂而被除去溶于有机溶剂而被除去溶于有机溶剂而被除去溶于有机溶剂而被除去多种方法确定多种方法确定多种方法确定多种方法确定肼法C端测定羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。

23、目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末末端残基的肽键。端残基的肽键。C C-末末端端基基氨氨基基酸酸测测定定（2 2）羧肽酶法羧肽酶法测定步骤测定步骤6 6、多肽链断裂成多个肽段，可采用两多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断种或

24、多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。分离开来。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定 酶解法酶解法:胰蛋白酶胰蛋白酶，糜蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多多多多肽肽肽肽链链链链的的的的选选选选择择择择性性性性降降降降解解解解重要的具有典型特征的有：重要的具有典型特征的有：胰蛋白酶：胰蛋白酶：R1=Lys,Arg 糜蛋白酶糜蛋白酶:R1=Phe,Tyr,Trp 肽键的专一性水解肽键的专一性水解(酶法酶法)酶法专一性水解

25、化学法：化学法：(Cyanogen bromide)(Cyanogen bromide)溴化氰水解法，它能选择性地切割由溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸甲硫氨酸的羧的羧基所形成的肽键。基所形成的肽键。多多多多肽肽肽肽链链链链的的的的选选选选择择择择性性性性降降降降解解解解了解了解肽键的专一性水解肽键的专一性水解(化学法化学法)化学法化学法:BrCN,H+,NH2OH,etc化学法专一性水解测定步骤测定步骤7 7、测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定（1 1）Edman Edman（苯异硫氰酸

26、酯）法氨基酸顺序苯异硫氰酸酯）法氨基酸顺序分析法实际上也是一种分析法实际上也是一种N-N-端分析法。此法的端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链特点是能够不断重复循环，将肽链N-N-端氨基端氨基酸残基逐一进行标记和解离。酸残基逐一进行标记和解离。E E E Ed d d dm m m ma a a an n n n氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸顺顺顺顺序序序序分分分分析析析析法法法法Edman 测序测序法法Edman降解与降解与DNS-Cl法的结合法的结合DNSEdman法法用用DNS法鉴定法鉴定N-末端氨基酸，末端氨基酸，用用Edman法降解提供依次减法降解提供依次减少一个氨基酸残基的多肽

27、。少一个氨基酸残基的多肽。（2）其他序列测定法（了解）其他序列测定法（了解）酶降解酶降解 法法 序列序列 ABCDEFGHIJK-酶解酶解 AB，CD，EF，GH，IJ，K Edman Edman循环后再酶解循环后再酶解 BC，DE，FG，HI，JK，-质谱法质谱法其它测定方法 利用外切蛋白水解酶利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)将将肽链的氨基酸从肽链的氨基酸从N端端(aminopeptidase)或或C端端(carboxypeptidase)一个接一个游离一个接一个游离出来，在不同时间取样进行分析，根据所出来，在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基游

28、离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序酸的排列顺序。酶解法肽小片段测序酶解法肽小片段测序酶解法末端测序质谱法质谱法 EdmanEdmanEdmanEdman循环后看分子量循环后看分子量循环后看分子量循环后看分子量的变化的变化的变化的变化质谱法一般测定步骤一般测定步骤8 8、确定肽段在多肽链中的次序。、确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。的氨基酸顺序。P179P179蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定一般测定步骤

29、一般测定步骤9 9、二硫键位置的确定。（了解）、二硫键位置的确定。（了解）蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质一一一一级级级级结结结结构构构构的的的的测测测测定定定定1、为防止、为防止Cys跟跟Cys-Cys发生交换反应，先发生交换反应，先 将自由将自由SH基封闭。基封闭。2、进行专一性部分水解、进行专一性部分水解3、纸层析分离水解产物、纸层析分离水解产物4、气相过甲酸法切断、气相过甲酸法切断S-S键，作第二相纸层键，作第二相纸层 析析5、将迁移率发生变化的多肽进行测序、将迁移率发生变化的多肽进行测序经典的二硫键位置的确定法经典的二硫键位置的确定法二硫键位置确定一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键一般采用胃

30、蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。确定二硫键的位置。二二硫硫键键位位置置的的确确定定蛋白质测序举例1953年，英国年，英国Sanger等，牛胰岛素等，牛胰岛素（1）5.7Kd （2）两条链：）两条链：A（21AA），），B（30AA）（3）A，B间有两个二硫键，间有两个二硫键，A链上有一链上有一链内二硫键链内二硫键The relationsh

31、ip between the amino acid sequences of protein and its function 蛋白质一级结构与功能关系的特点是蛋白质一级结构与功能关系的特点是:A 相同氨基酸组成的蛋白质功能一定相同相同氨基酸组成的蛋白质功能一定相同B 一级结构相近的蛋白质其功能类似性越大一级结构相近的蛋白质其功能类似性越大C 一级结构中任何氨基酸的改变一级结构中任何氨基酸的改变,其生物活性就丧失其生物活性就丧失D 不同生物来源的同种蛋白质不同生物来源的同种蛋白质.其一级结构完全相同其一级结构完全相同 E 一级结构中氨基酸残基任何改变一级结构中氨基酸残基任何改变,都不会影响其功

32、能都不会影响其功能*镰刀状红细胞贫血症镰刀状红细胞贫血症 四、蛋白质的序列与生物学功能四、蛋白质的序列与生物学功能（自学）（自学）1.The function of a protein depends on its amino acid sequenceEach separate type of protein has a unique amino acid sequence.Each of the 3000 different proteins in an E.coli cell,the 100,000 ones in a human being has a different amino

33、acid sequence.Proteins of different functions always have different amino acid sequences.Genomic annotation is assigning functions to genes based on sequence information.Many human genetic diseases have been traced to the deficiency of a single enzyme or protein.The deficiency of many such enzymes a

34、re found to be caused by a single change of amino acid residue,indicating protein functions are determined by their amino acid sequences.Proteins that have similar functions but from different species are found to be very similar in amino acid sequences.(cytochrome c,myoglobin,etc.)sequence homology

35、 as a basis for phylogenetic trees.2.Many proteins have variations in their amino acid sequences in the same population(individual polymorphism)or in different species.Many such variations in amino acid sequences,especially in the same population,mostly do not affect protein functions.This phenomeno

36、n of amino acid variation in the same population is called polymorphism and widely used in places where identification of individuals are needed(in the court,by examining DNA molecules).Proteins of the same(or similar)functions vary in their amino acid sequences,in proportion to their evolutionary d

37、istance or relationship(more different,less similar,farther in relationship).27 invariant residues(yellow),conservative substitutions(blue)nonconservative or variable residues(unshaded)3.Conservation and variation of cytochrome c sequences 4.The amino acid sequences of proteins provide important bio

38、chemical information(application of bioinformatic tools).A newly revealed amino acid sequence(of well studied or unknown proteins)is usually compared with a large bank of stored sequences.Thousands of sequences have been revealed and stored in computerized databases(e.g.,Swiss-Prot,PIR,TreEMBL).Sequ

39、ence similarity usually reveals functional relatedness.5.Homologous proteins share a common ancestor during evolution,hence are of the same function.Homology describes the percentage of similarity(or identity)between two proteins(or DNA molecules),usually referring to sequence rather than structure.

40、Amino acid residues between two proteins at certain positions(counting from the N-terminal as 1)can be identical,conservative(similar),or variable.The amino acid sequences of two or more homologous proteins can be compared by sequence alignment.6.Evolution can be studied quantitatively at the molecu

41、lar level:phylogenetic trees are made by using the number of residues that differ.Highly conserved residues usually play important roles in protein structure and/or function.(need to be further exploited,e.g.How does it determine the three dimension structure?).Homologous proteins share the same thr

42、ee-dimensional structure.(sequence-structure-function paradigm,unless the structure is flexible and non-unique).习题习题简单蛋白与结合蛋白简单蛋白与结合蛋白 多肽链多肽链 桑格（桑格（Sanger）反应）反应氨基酸残基氨基酸残基酰胺平面中具有部分双键性质的单键是：酰胺平面中具有部分双键性质的单键是：A C-C B C-N C N-H D N-C*可用来鉴定蛋白质肽链可用来鉴定蛋白质肽链N-末端氨基酸的试剂是：末端氨基酸的试剂是：A 茚三酮茚三酮 B 亚硝酸亚硝酸 C 甲醛甲醛D 2，

43、4二硝基氟苯二硝基氟苯 E 异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯 *可用来判断蛋白质水解程度的反应是：可用来判断蛋白质水解程度的反应是：A 茚三酮反应茚三酮反应 B 亚硝酸反应亚硝酸反应 C 甲醛反应甲醛反应D 2，4-二硝基氟苯反应二硝基氟苯反应 E 异硫氰酸苯酯反应异硫氰酸苯酯反应 胰岛素胰岛素A链与链与B链的交联靠：链的交联靠：A 氢键氢键 B 盐键盐键 C 二硫键二硫键 D 酯键酯键 E 范德华力范德华力 蛋白质一级结构与功能关系的特点是蛋白质一级结构与功能关系的特点是:A 相同氨基酸组成的蛋白质功能一定相同相同氨基酸组成的蛋白质功能一定相同B 一级结构相近的蛋白质其功能类似性越大一级结构相近的蛋

44、白质其功能类似性越大C 一级结构中任何氨基酸的改变一级结构中任何氨基酸的改变,其生物活性就丧失其生物活性就丧失D 不同生物来源的同种蛋白质不同生物来源的同种蛋白质.其一级结构完全相同其一级结构完全相同 E 一级结构中氨基酸残基任何改变一级结构中氨基酸残基任何改变,都不会影响其功能都不会影响其功能 习题习题一一个个蛋蛋白白质质样样品品经经酸酸水水解解后后，能能用用氨氨基基酸酸自自动动分分析析仪仪准准确确测测定定它它的的所所有氨基酸有氨基酸。可用可用8M尿素拆开蛋白质分子中的二硫键。尿素拆开蛋白质分子中的二硫键。蛋白质在蛋白质在pI（等电点）时，其溶解度最小（等电点）时，其溶解度最小。有有一一个个

45、七七肽肽,经经分分析析它它的的氨氨基基酸酸组组成成是是:Lys,Gly,Arg,Phe,Ala,Tyr,和和Ser.此此肽肽未未经经糜糜蛋蛋白白酶酶处处理理时时,与与FDNB反反应应不不产产生生-DNP-氨氨基基酸酸.经经糜糜蛋蛋白白酶酶作作用用后后,此此肽肽断断裂裂成成两两个个肽肽段段,其其氨氨基基酸酸组组成成分分别别为为Ala,Tyr,Ser,和和Gly,Phe,Lys,Arg.这这两两个个肽肽段段分分别别与与FDNB反反应应,可可分分别别产产生生DNP-Ser和和DNP-Lys.此此肽肽与与胰胰蛋蛋白白酶酶反反应应,同同样样能能生生成成两两个个肽肽段段,它它们们的的氨氨基基酸酸组组成成分

46、分别别是是Arg,Gly,和和Phe,Tyr,Lys,Ser,Ala.试试问问此此七七肽的一级结构是怎样的肽的一级结构是怎样的?一一个个A肽肽：经经酸酸解解分分析析得得知知由由Lys,His,Asp,Glu2,Ala,以以及及Val,Tyr和和两两个个NH3分分子子组组成成。当当A肽肽与与FDNB试试剂剂反反应应后后,得得DNP-Asp;当当用用羧羧肽肽酶酶处处理理后后得得游游离离缬缬氨氨酸酸。如如果果我我们们在在试试验验中中将将A肽肽用用胰胰蛋蛋白白酶酶降降解解时时,得得到到二二肽肽,其其中中一一种种(Lys,Asp,Glu,Ala,Tyr)在在pH6.4时时,净净电电荷荷为为零零,另另一一

47、种种(His,Glu,以以及及Val)可可给给出出DNP-His,在在pH6.4时时,带带正正电电荷荷.此此外外,A肽肽用用糜糜蛋蛋白白酶酶降降解解时时,也也得得到到二二种种肽肽,其其中中一一种种(Asp,Ala,Tyr)在在pH6.4时时呈呈中中性性,另另一一种种(Lys,His,Glu2,以以及及Val)在在pH6.4时时,带正电荷，问带正电荷，问A肽的氨基酸顺序如何肽的氨基酸顺序如何?有有一一个个七七肽肽,经经分分析析它它的的氨氨基基酸酸组组成成是是:Lys,Gly,Arg,Phe,Ala,Tyr,和和Ser.此此肽肽未未经经糜糜蛋蛋白白酶酶处处理理时时,与与FDNB反反应应不不产产生生

48、-DNP-氨氨基基酸酸.经经糜糜蛋蛋白白酶酶作作用用后后,此此肽肽断断裂裂成成两两个个肽肽段段,其其氨氨基基酸酸组组成成分分别别为为Ala,Tyr,Ser,和和Gly,Phe,Lys,Arg.这这两两个个肽肽段段分分别别与与FDNB反反应应,可可分分别别产产生生DNP-Ser和和DNP-Lys.此此肽肽与与胰胰蛋蛋白白酶酶反反应应,同同样样能能生生成成两两个个肽肽段段,它它们们的的氨氨基基酸酸组组成成分分别别是是Arg,Gly,和和Phe,Tyr,Lys,Ser,Ala.试试问问此此七七肽的一级结构是怎样的肽的一级结构是怎样的?因因为为此此肽肽未未经经糜糜蛋蛋白白酶酶处处理理时时与与FDNB反

49、反应应不不产产生生-DNP-氨氨基基酸酸可可推推断断为为环环七七肽肽。从从经经糜糜蛋蛋白白酶酶水水解解成成的的两两个个片片段段及及它它们们与与FDNB的的反反应产物可知该两片段可能为：应产物可知该两片段可能为：SerAlaTyr （1）LysGly、Arg、Phe（2）此肽与胰蛋白酶反应生成的两个片段应是：此肽与胰蛋白酶反应生成的两个片段应是：GlyArg （3）Phe、Tyr、Ser、Ala、Lys（4）（2）肽肽段段结结合合（3）肽肽段段综综合合分分析析应应为为：LysGlyArgPhe（A）（4）与与（1）肽肽段段综综合合分分析析应应为为PheSerAlaTyrLys（B）综合综合（A）

50、与与（B）肽段，肽段，此肽应为：此肽应为：GlyArgPheSerAla Lys _Tyr 一一个个A肽肽：经经酸酸解解分分析析得得知知由由Lys,His,Asp,Glu2,Ala,以以及及Val,Tyr和和两两个个NH3分分子子组组成成。当当A肽肽与与FDNB试试剂剂反反应应后后,得得DNP-Asp;当当用用羧羧肽肽酶酶处处理理后后得得游游离离缬缬氨氨酸酸。如如果果我我们们在在试试验验中中将将A肽肽用用胰胰蛋蛋白白酶酶降降解解时时,得得到到二二肽肽,其其中中一一种种(Lys,Asp,Glu,Ala,Tyr)在在pH6.4时时,净净电电荷荷为为零零,另另一一种种(His,Glu,以以及及Val