荧光定量PCR技术-讲座.ppt

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1、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术的技术的原理、应用及实践原理、应用及实践(Real time Quantitative PCR)Real time Quantitative PCRReal time Quantitative PCR 基本原理Company name 基本原理基本原理Company nameReal-time qPCR的定量原理的定量原理2Real-time qPCR的检测方法的检测方法3Real-time qPCR的基本概念的基本概念1Real-time qPCR的解析方法的解析方法4Real-time qPCR的计算方法的计算方法5Real-time qPCR的定义

2、的定义Company name实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。Real-time PCR仪 ABI7500PCR：基本原理：基本原理Denaturation:94 96CAnnealing:50 65CExtension:70 75C基本要素：基本要素：Template Primers DNA polymerase dNTP,N=A,G,C or TCompany name 与普通与普通PCRPCR的比较的比较S形曲线，具有平台效应形曲线，具有平台效应终点检测法终点检测法反应效率差异的累

3、积使反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能终点定量几乎不可能不同浓度的起始模板经不同浓度的起始模板经PCRPCR扩增后到达扩增后到达某一定某一定值时值时所需要的所需要的循环数循环数来来计算起始模板量计算起始模板量 定量原理定量原理Company name理想的PCR反应：X=X0*2n实际的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 定量原理定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同

4、时取对数得:log M=log X0(1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:log X0=-log(1+Ex)Ct+log M (3)log(1+Ex)Ct=-log X0+log M Ct=-klogXCt=-klogX0 0+b +b Company nameCompany name 每个模板的每个模板的 CT CT 值值与该模板的起始拷贝数与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CT CT 值越小。值越小。确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度 定量原理定量原理Ct=-klogXCt=-klogX0 0+b+breal-time qP

5、CR使确定模板初始数量成为可能使确定模板初始数量成为可能11实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR中的三个概念中的三个概念1 1扩增曲线扩增曲线 (primary curve)(primary curve)2 2荧光阈值（荧光阈值（threshold)threshold)3 3CT CT 值值(Cycle Threshold)(Cycle Threshold)扩增曲线扩增曲线 (primary curve)(primary curve)Company name荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧

6、光强度信号，得到一条荧光增长曲线图横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 Company name 荧光阈值（荧光阈值（threshold)是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在PCR反应指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。阈值线阈值线 原则：1）要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；2）同时要尽量选择进入指数期的最初阶段 CT 值值(Cycle Threshold)Company nameCtCt值的定义值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)valu

7、e Company nameCtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性 检测方法检测方法Company name非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：SYBR Green I特异性荧光标记：特异性荧光标记：水解探针：水解探针：TaqMan非水解探针：非水解探针：Molecular beacon 17 解析方法解析方法2 2标准曲线分析标准曲线分析1 1融解曲线分析融解曲线分析3 3绝对定量和相对定量绝对定量和相对定量Company name将温度对荧光强度的变化求导。将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)(-dI/dT)Tm值值确认PCR反应的

8、特异性融解曲线分析融解曲线分析Company name融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确融解曲线分析融解曲线分析Company name 初始模板量的对数与循环数（Ct值）呈线性关系，就可以制作以起始拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线.未知未知10410310610510210标准曲线分析标准曲线分析计算样品的起始拷贝数已知基因拷贝数的标准品建立标准曲线已知基因拷贝数的标准品建立标准曲线关键：DNA的精确定量

9、绝对定量绝对定量Sample2522 相对定量表达量表达量校正样品量校正样品量内参内参beta-actin、GAPDH基因、基因、rRNA等看家基因等看家基因在细胞中的表达在细胞中的表达量或在基因组中量或在基因组中的拷贝数恒定，的拷贝数恒定，受环境因素影响受环境因素影响较小较小目的基因目的基因/内标基内标基因，均一化为每因，均一化为每个细胞或基因组个细胞或基因组对应的目的基因对应的目的基因数量数量以各自样本中内参基因为标准，比较不同样本中目的以各自样本中内参基因为标准，比较不同样本中目的基因的相对表达丰度基因的相对表达丰度23相对定量的数据处理相对定量的数据处理Ct CtPfaffl Modi

10、ficationVandesompele Method非均一化的非均一化的需要后续的需要后续的均一化均一化以内参基因作以内参基因作为标准为标准目标样品的相目标样品的相对定量通过内参对定量通过内参基因的相对定量基因的相对定量进行均一化进行均一化只有一个内参只有一个内参基因基因假设扩增效率假设扩增效率为为100%扩增效率扩增效率不同不同只有一个只有一个内参基因内参基因扩增效率扩增效率不同不同多个内参多个内参基因基因简单简单复杂 比较Ct法 2-CtFold induction=23=8Company namesample内参内参目的基因目的基因Tissue#1:2122Tissue#2:20 24

11、1st Delta Ct#1:22-21=1 Ct#2:24-20=42nd Delta Ct:4-1=3相对定量方法相对定量方法 Ct存在的问题存在的问题Company name成立条件：假设扩增效率为成立条件：假设扩增效率为100%满足条件：满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近）内参基因和目标基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率为）内参基因和目标基因的扩增效率为90%-110%相对定量方法相对定量方法实验流程Company name 应应 用用 v定量 基因表达水平检测v定量 基因拷贝数检测v多色标记 SNP检测v高精度溶解曲线分析（HRM）-SNPv高精度溶解曲

12、线分析（HRM）-DNA甲基化分析 基因表达水平检测基因表达水平检测 Company name样本处理样本处理RNA提取提取qPCR数据分析数据分析实 验 流 程逆转录逆转录 样本处理与样本处理与RNA提取提取v外界刺激 可检测的表达改变v样品离开定义环境 裂解、固定细胞Trizon 裂解液（氰酸胍，异硫氰酸呱，SDS）液氮RNA保存液 v小心DNA污染！使用DNase 以RNA作PCR阴性对照 CW0580 CW0592 逆转录逆转录逆转录引物选择逆转录引物选择下游应用：是否检测其它基因？Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？检测灵敏度是否足够？是否会有二级结构

13、干扰？一步法还是两步法？一步法还是两步法？两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。推荐：工作的初期阶段推荐：工作的初期阶段 RealSYBR RealSYBR 二步法荧光定量二步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX RealSYBR RealSYBR 一步法荧光定量一步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX RealSuper RealSuper 二步法荧光定量二步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX一步法：一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原

14、因。推荐：工作的成熟阶段推荐：工作的成熟阶段 RealSuper RealSuper 一步法荧光定量一步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX Master mix的优化的优化vHotstar化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟vFast Hotstar抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒几十秒 CW0696 CW0704热启动DNA聚合酶 反应条件优化反应条件优化内参基因内参基因单一特异性产物反应效率90%-110%反应条件优化反应条件优化目的基因目的基因单一特异性产物反应效率接近内参基因反应效率尽量高 内参基因 高丰度高丰度 ACTB，GAPDH中

15、等丰度中等丰度 beta2M低丰度低丰度 HPRT136扩增产物设计原则扩增产物设计原则二级结构二级结构颈环结构颈环结构片段长度片段长度75-200bp最佳长度最佳长度80-120bp有限的二级结构有限的二级结构二级结构的预测二级结构的预测用用mFold http:/bioinfo.math.rpi.edu/mfold/applications引物避免位于颈引物避免位于颈环结构上环结构上总原则与普通总原则与普通PCRPCR相同相同 二级结构二级结构Company namev扩增产物的二级结构引物避免位于颈环结构上引物避免位于颈环结构上Company name引物的位置Company name5

16、56065温度对二级结构的影响Company name实 践Company name实 践内参基因的标准曲线的绘制与数据分析Company name样本：293T细胞株 人提取方法：Trizon RNA 提取试剂 CWBIO 公司 CW0580说明书2106 个细胞总RNA 琼脂糖凝胶电泳图RNA提取Company name逆转录：HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒 CWBIO 公司 CW0744说明书取5ul扩增产物，用1.7%琼脂糖凝胶进行电泳体系：2 TaqMasterMix 10ulGAPDHF引物（10um）0.5ulGAPDHR引物（10um）0.5ulcDNA 1u加入

17、灭菌水至20 ul。逆转录Company name模板 cDNA模板稀释倍数10000倍1000倍100倍10倍引物内参基因引物 模板模板反应体系的配置反应体系的配置cDNA 模板 2.0l正向引物F(10M)0.5l反向引物R(10M）0.5lREALSYBR Mixture(2)10.0lddH2O 7.0lTotal 20.0lCompany name注意：1、为了避免加样误差，做预混体系 2、充分混匀，如有气泡短暂离心Company name1.95 5min2.95 10-15sec3.60 20-30sec4.Plate read5.Go to 2 for 39 cycles mo

18、re6.Melting curve analysis:from 72 to 95,read every 0.2,hold 1sec between reads EndTmTm值：值：值：值：DNADNA解链一半时的温解链一半时的温解链一半时的温解链一半时的温度度度度将荧光强度的变化对温度求导：将荧光强度的变化对温度求导：将荧光强度的变化对温度求导：将荧光强度的变化对温度求导：-dI/dTdI/dTTm-dI/dT(max)dI/dT(max)反应反应条件的设定条件的设定Company nameu 常规考虑：避免实验操作的污染。戴手套常规考虑：避免实验操作的污染。戴手套u 空白对照空白对照:监测污染监测污染(假阳性假阳性)u 设反应重复（一般至少二个）设反应重复（一般至少二个）u 保证重复性好：配制反应预混合液，避免取样误差保证重复性好：配制反应预混合液，避免取样误差实验操作注意事项实验操作注意事项 Real time PCR Real time PCR 的实验技术应用讨论的实验技术应用讨论Company name实 验 操 作