血凝和血凝抑制实验.ppt

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1、血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验一、实验目的1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法2、了解新城疫有关背景知识 二、实验内容1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）三、实验原理1 1、血凝试验（、血凝试验（HAHA）原理：某些病毒或病毒的）原理：某些病毒或病毒的血凝血凝素素能能选择性地选择性地使某种动物地使某种动物地红细胞红细胞发生凝集，这种发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（凝集红细胞的现象称为血凝（HAHA）,也称直接血凝也称直接血凝反应。反应。病病毒毒颗颗粒粒红红细细胞胞2 2、血凝抑制试验（、血凝

2、抑制试验（HIHI）原理：当病毒的悬液中加入）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体特异性抗体，且这种抗体的量足以，且这种抗体的量足以抑制抑制病毒颗粒或其病毒颗粒或其血凝素时，则血凝素时，则红细胞表面的受体红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（称为红细胞凝集抑制（HIHI）反应，也称血凝抑制反应。）反应，也称血凝抑制反应。I am lateI am late！抗体抗体抗原抗原四、实验材料1、血凝板（96孔90V型）2、新城疫阳性血清3、被检血清（1份）4、1红细胞悬液5、稀

3、释液6、移液器（50ul,2人/把）7、枪头五、实验方法与结果判定血凝试验（HA)1 1、在血凝板上第一排和第二排的、在血凝板上第一排和第二排的1 11212孔内各加入孔内各加入25ul25ul生理盐水生理盐水2 2、在第、在第1 1孔内加入孔内加入25ul25ul病毒抗原，然后依次倍比稀病毒抗原，然后依次倍比稀释至第释至第1111孔，最后弃孔，最后弃25ul25ul（也就是可以一次做（也就是可以一次做2 2个抗个抗原效价测定）原效价测定）3 3、每孔加入、每孔加入1 1鸡红细胞悬液鸡红细胞悬液25ul25ul4 4、轻轻振荡均匀，后放于室温或、轻轻振荡均匀，后放于室温或3737中静置中静置3

4、030分分钟钟5 5、结果判定、结果判定 血凝效价测定血凝效价测定结果判定标准1 1、：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即、：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100100凝集；凝集；2 2、：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而、：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即稍向孔底集中，即7575凝集；凝集；3 3、：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即5050凝集；凝集；4 4、：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即周稍有凝集块，即2525凝集；凝集；5 5、：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，

5、即：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；无凝集；血凝价的判定以出现（50凝集）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝价（1:128）？。25ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一个血凝单位。血凝抑制试验1 1、将病毒抗原稀释成、将病毒抗原稀释成4 4个血凝单位（个血凝单位（1/1284=1:321/1284=1:32）2 2、在血凝板上、在血凝板上1 11212孔内各加入孔内各加入25ul25ul生理盐水；生理盐水；3 3、在第、在第1 1孔内加入被检血清孔内加入被检血清25ul25ul，然后倍比稀释至第，然后倍比稀释至第1010孔，最后弃孔，最后弃25ul25ul；4 4、第、第1

6、11111孔内加入孔内加入4 4单位抗原单位抗原25ul25ul（第（第1111孔为抗原对孔为抗原对照第照第1212孔为红细胞对照）；孔为红细胞对照）；5 5、轻轻振荡均匀，后放于室温或、轻轻振荡均匀，后放于室温或3737中静置中静置3030分钟分钟6 6、每孔加入、每孔加入1 1鸡红细胞悬液鸡红细胞悬液25ul25ul；7 7、轻轻振荡均匀，后放于室温或、轻轻振荡均匀，后放于室温或3737中静置中静置3030分钟分钟8 8、结果判定、结果判定 血凝抑制效价测定血凝抑制效价测定结果判定标准1 1、：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即、：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100100凝集；凝集；2 2、

7、：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而、：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即稍向孔底集中，即7575凝集；凝集；3 3、：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块，：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块，即即5050凝集；凝集；4 4、：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即周稍有凝集块，即2525凝集；凝集；5 5、：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即、：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。无凝集。血凝抑制价的判定以出现完全抑制凝集(即不凝集)的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制价（1:4）即抗体为22。六、注意事项

8、1、红细胞用前请摇匀2、用枪加样定要准，尽量不要有气泡3、结果判定有耐心4、HA和HI勿相混红细胞的制备1、采SPF鸡血20-40ml于加抗凝剂的试管中（真空采血管）2、用生理盐水以1:5的比例稀释鸡全血后放入离心管中以1500r/min离心10min，3、离心后用移液器吸取上清液，再次加入生理盐水稀释并以1500r/min离心10min。4、离心后用移液器吸取上清液，再次加入生理盐水稀释并以1800r/min离心8min。5、离心后用移液器吸取上清液，剩余红细胞配制为10%的红细胞溶液，4保存备用。注意事项1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。