细胞周期的调控与检测.ppt

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1、细胞周期及其调控机制细胞周期及其调控机制苏苏 川川南京医科大学病原生物学系南京医科大学病原生物学系86862774江苏省病原生物学重点实验室江苏省病原生物学重点实验室86862773提纲提纲一、基本概念介绍一、基本概念介绍二、历史回顾二、历史回顾三、细胞周期各时相的动态变化三、细胞周期各时相的动态变化四、细胞周期的调控四、细胞周期的调控五、细胞周期得以进行的两大机制五、细胞周期得以进行的两大机制六、细胞周期的界面机制六、细胞周期的界面机制七、肿瘤与细胞周期七、肿瘤与细胞周期八、常用的细胞周期检测方法八、常用的细胞周期检测方法九、细胞周期同步化九、细胞周期同步化 生命是如何生长、生存、繁衍和死亡

2、？在每一个生命个体中都存在一个生命是如何生长、生存、繁衍和死亡？在每一个生命个体中都存在一个精密的程序，或生物钟。生物钟决定着细胞是否、何时生长、分裂、或死亡。精密的程序，或生物钟。生物钟决定着细胞是否、何时生长、分裂、或死亡。这就是细胞周期调控机制，它在相关基因的控制下，依据一定的规则和节奏这就是细胞周期调控机制，它在相关基因的控制下，依据一定的规则和节奏运行着，调控细胞的生长、分裂和死亡。在胚胎细胞，细胞周期保持快速运运行着，调控细胞的生长、分裂和死亡。在胚胎细胞，细胞周期保持快速运行，在一些成年细胞中其运行慢得多，而在神经元细胞周期几乎完全不运行。行，在一些成年细胞中其运行慢得多，而在神

3、经元细胞周期几乎完全不运行。在生长过程中的细胞，如果细胞周期不能运行，结果是死亡。而在成熟细胞，在生长过程中的细胞，如果细胞周期不能运行，结果是死亡。而在成熟细胞，细胞周期不正确的运行，结果则是肿瘤的发生。细胞周期不正确的运行，结果则是肿瘤的发生。细胞周期细胞周期(cellcycle)细胞周期调控细胞周期调控(cellcycleregulation)“细胞周期细胞周期”也称也称“细胞分裂周期细胞分裂周期”，是指一个细胞经生长、分裂而增，是指一个细胞经生长、分裂而增殖成两个所经历的全过程，通常可分为若干阶段，即殖成两个所经历的全过程，通常可分为若干阶段，即G1期、期、S期、期、G2期和期和M期。

4、细胞在期。细胞在G1期完成必要的生长和物质准备，在期完成必要的生长和物质准备，在S期完成其遗传物质期完成其遗传物质染色体染色体DNA的复制，在的复制，在G2期进行必要的检查及修复以保证期进行必要的检查及修复以保证DNA复制的准确复制的准确性，然后在性，然后在M期完成遗传物质到子细胞中的均等分配，并使细胞一分为二。期完成遗传物质到子细胞中的均等分配，并使细胞一分为二。一、基本概念介绍一、基本概念介绍2001NobelPrizeLelandH.Hartwell1970s“Checkpoint”Yeastgenetics100CDCgenesStartgeneTimHunt1980sCyclinsS

5、eaUrchinsPaulM.Nurse1970sCDKsyeast二、历史回顾二、历史回顾生命复制之谜的揭开生命复制之谜的揭开（1）1858年建立细胞理论：年建立细胞理论：生命的基本形式是细胞，机体由细胞构成，细胞的生长复制形成生命的基本形式是细胞，机体由细胞构成，细胞的生长复制形成了生物体的生长繁衍，细胞的异常或死亡导致机体的疾病或死亡。了生物体的生长繁衍，细胞的异常或死亡导致机体的疾病或死亡。（2 2）19511951年发现了细胞分裂周期：年发现了细胞分裂周期：G1 S G2 M G0G1 S G2 M G0细胞生长中有两种形式细胞生长中有两种形式-有丝分裂期和细胞间期有丝分裂期和细胞间

6、期细细细细胞胞胞胞周周周周期期期期细胞间期细胞间期细胞间期细胞间期有丝分裂期（有丝分裂期（有丝分裂期（有丝分裂期（M期）期）DNA合成前期（合成前期（GG1 1期期期期）DNA合成期（合成期（S S期期期期）DNA合成后期（合成后期（GG2 2期期期期）前期前期中期中期后期后期末期末期（3 3）随随着着成成熟熟刺刺激激因因子子（maturationpromotingfactor,MPF），细细胞胞周周期期素素（cyclin），细细胞胞周周期期素素依依赖赖性性蛋蛋白白激激酶酶(cyclin dependent dependent kinasekinase，CDK)CDK)的的发发现现使使对对细细

7、胞胞周周期期及及与与肿肿瘤瘤的的发发生生发发展展关关系系的的研研究究有了很大进展。有了很大进展。三、细胞周期各时相的动态变化三、细胞周期各时相的动态变化、G1期期（DNA合合成成前前期期，指指有有丝丝分分裂裂完完成成到到DNA合合成成之前之前的一段时间）的一段时间）RNA在在此此期期大大量量合合成成，导导致致蛋蛋白白质质量量明明显显增增加加。S期期所所需需的的DNA复复制制相相关关的的酶酶系系，如如DNA聚聚合合酶酶，G1期期向向S期期转转变变相相关关的的蛋蛋白质如触发蛋白、钙调蛋白、细胞周期蛋白等均在此期合成。白质如触发蛋白、钙调蛋白、细胞周期蛋白等均在此期合成。蛋蛋白白质质的的磷磷酸酸化化

8、作作用用在在G1期期开开始始增增加加，这这将将有有利利于于G1晚晚期期染染色色体体结结构构成成分分的的重重排排。非非组组蛋蛋白白、一一些些蛋蛋白白激激酶酶在在G1期期也也可可发发生生磷磷酸酸化化，已已知知大大多多数数蛋蛋白白激激酶酶磷磷酸酸化化发发生生于于其其丝丝氨氨酸酸或或苏苏氨氨酸酸、酪氨酸部位。酪氨酸部位。触触发发蛋蛋白白是是一一种种不不稳稳定定蛋蛋白白，它它对对细细胞胞从从G1期期进进入入S期期是是必必须须的的。只只有有当当其其含含量量积积累累到到临临界界值值，细细胞胞周周期期才才能朝能朝DNA合成方向进行。合成方向进行。钙钙调调蛋蛋白白是是真真核核细细胞胞内内重重要要的的钙钙受受体体

9、，它它调调节节细细胞胞内内钙钙的的水水平平，钙钙调调蛋蛋白白的的含含量量，在在G1晚晚期期可可达达峰峰值值，用用抗抗钙钙调调蛋蛋白白药药物物处处理理细细胞胞，可可延延缓缓其其从从G1期期到到S期期的的进进程。程。G1期期蛋蛋白白质质量量的的增增加加，可可能能与与蛋蛋白白质质合合成成增增强强有有关关，而另一原因则可能使其降解的减弱。而另一原因则可能使其降解的减弱。、S期期（DNA合合成成期期，从从DNA合合成成开开始始到到DNA合合成成结结束束的的全过程，是细胞增殖周期的关键阶段）全过程，是细胞增殖周期的关键阶段）S期是细胞进行大量期是细胞进行大量DNA复制的阶段，组蛋白及非组蛋白也在此期大复制

10、的阶段，组蛋白及非组蛋白也在此期大量合成，最后完成染色体的复制量合成，最后完成染色体的复制（）（）DNA复制需要多种酶的参与复制需要多种酶的参与包包括括DNA聚聚合合酶酶、DNA连连接接酶酶、胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸激激酶酶、核核苷苷酸酸还还原原酶酶等等。随随着着细细胞胞由由G1期期进进入入S期期，这这些些酶酶的的含含量量或或活活性可显著增高性可显著增高（）（）DNA复制具有严格的时间顺序复制具有严格的时间顺序通通常常，GC含含量量较较高高的的DNA序序列列在在早早S期期复复制制，晚晚S期期复复制制的的主主要要为为含含量量高高的的DNA序序列列；就就染染色色体体而而言言，常常染染色色体体的

11、的复复制制较较异异染染色色体体要要早早，典典型型的的例例子子如如人人类类女女性性的的细细胞胞中中，当当其其它它染色体都被复制完以后，才开始进行纯化的染色体都被复制完以后，才开始进行纯化的X染色体复制。染色体复制。（）（）S期是细胞合成的主要时相期是细胞合成的主要时相此此时时细细胞胞质质中中可可出出现现大大量量的的组组蛋蛋白白mRNA，新新合合成成的的组组蛋蛋白白从从胞胞质质进进入入胞胞核核，与与复复制制后后的的DNA迅迅速速结结合合，绕绕成成核核小小体体，进进而而形形成成具具有有两两条条单单体体的的染染色色体体。除除了了蛋蛋白白质质合合成成以以外外，在在S期期细细胞胞中不断进行着组蛋白的持续磷

12、酸化。中不断进行着组蛋白的持续磷酸化。（）中心粒的复制也在（）中心粒的复制也在S期完成期完成原原本本垂垂直直的的一一对对中中心心粒粒发发生生分分离离，各各自自在在其其垂垂直直方方向向形形成成一一个个子子中中心心粒粒，由由此此形形成成的的两两对对中中心心粒粒在在以以后后的的细细胞胞周周期期进进程程中中，将将发发挥挥微微管管组组织织中中心心的的作作用用，纺纺锤锤体体微微管管，星星体体微微管管的的形形成成均均与与此相关。此相关。、G2期期（DNA合合成成后后期期，从从DNA复复制制完完成成到到有有丝丝分分裂裂开开始始前前的的时时期期，为有丝分裂为有丝分裂进行物质条件进行物质条件）为为细细胞胞分分裂裂

13、准准备备期期，细细胞胞中中合合成成一一些些与与M期期结结构构功功能能相相关关的的蛋蛋白白质，与核膜破裂，染色体凝集相关的成熟促进因子在此期合成。质，与核膜破裂，染色体凝集相关的成熟促进因子在此期合成。微微管管蛋蛋白白G期期合合成成达达高高峰峰，为为M期期纺纺锤锤体体微微管管的的形形成成提提供供了了丰丰富的来源。富的来源。已经复制的中心粒在已经复制的中心粒在G2期逐渐长大，并开始向细胞两极分离。期逐渐长大，并开始向细胞两极分离。、M期期（有有丝丝分分裂裂期期，细细胞胞经经过过分分裂裂将将染染色色体体平平均均分分配配到到两两个个子子细细胞胞中）中）在在此此期期细细胞胞中中，染染色色体体凝凝集集后后

14、发发生生姊姊妹妹染染色色单单体体的的分分离离，核核膜膜核核仁仁破破裂裂后后再再重重建建，胞胞质质中中有有纺纺锤锤体体收收缩缩环环出出现现，随随着着两两个个子子核核的的形成，胞质也一分为二，由此完成细胞分裂。形成，胞质也一分为二，由此完成细胞分裂。G1期：为期：为DNADNA合成准备所需要的合成准备所需要的RNARNA、蛋白质、脂类、糖类等蛋白质、脂类、糖类等G1早期：细胞的生长早期：细胞的生长G1晚期：为晚期：为S S期的期的DNADNA合成做准备合成做准备S S期（期（DNADNA合成期）合成期）DNADNA合成合成(复制复制)染色体蛋白的合成：组染色体蛋白的合成：组蛋白、非组蛋白等蛋白、非

15、组蛋白等中心粒的复制中心粒的复制G2G2期（期（DNADNA合成后期）合成后期）有活跃的有活跃的RNARNA和蛋白质合成和蛋白质合成微管蛋白，促有丝分裂因子（微管蛋白，促有丝分裂因子（MPFMPF）中心粒向两极移动中心粒向两极移动M M期（有丝分裂期）期（有丝分裂期）DNADNA、RNARNA、蛋白质合成停止。蛋白质合成停止。细胞发生一系列形态变化、结构建细胞发生一系列形态变化、结构建成。将加倍的成。将加倍的DNADNA平均分配到两个子平均分配到两个子细胞中细胞中1)细胞周期调控研究过程的重要事件细胞周期调控研究过程的重要事件-MPF的发现：的发现：最早发现，最早发现，MPF是一种在是一种在G

16、G2 2期形成、能促进期形成、能促进期形成、能促进期形成、能促进MM期启期启期启期启动的调控因子，称之为促细胞成熟因子或促细胞分动的调控因子，称之为促细胞成熟因子或促细胞分动的调控因子，称之为促细胞成熟因子或促细胞分动的调控因子，称之为促细胞成熟因子或促细胞分裂因子（裂因子（裂因子（裂因子（MPF)MPF)。MPF由调节亚单位细胞周期素（由调节亚单位细胞周期素（cyclin）和催化亚）和催化亚单位细胞周期素依赖性蛋白激酶（单位细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK）组成。组成。1、细胞周期调控蛋白（细胞周期调控蛋白（cellcycle-regulatingprotein)四、细胞周期的调控四、细胞周

17、期的调控2）细胞周期调控蛋白的种类）细胞周期调控蛋白的种类A、CDK类蛋白激酶：类蛋白激酶：CDK与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故名细胞周期素与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故名细胞周期素依赖性蛋白激酶依赖性蛋白激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)。作用：作用：CDK可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。在动物中已知在动物中已知7种种CDK，CDK1-7。B、细胞周期素细胞周期素（cyclin)特点：在细胞周期中呈周期性变化。特点：在细胞周期中呈周期性变化。作用：能与作用：能与CDK结合，激活结合，激活CDK，间接调节细胞周期

18、运行。间接调节细胞周期运行。已知已知30余种，在脊椎动物中为余种，在脊椎动物中为cyclinA1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。等。Cyclins与与CDKs结合后，结合后，CDKs才具有活性，它们两者才具有活性，它们两者的结合使细胞周期有序进行。具体结合方式如下：的结合使细胞周期有序进行。具体结合方式如下：C、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)CKI对细胞周期起负调控作用，分为：对细胞周期起负调控作用，分为：Ink4:P16ink4a,P15ink4b,P18ink4c,P19ink4d。特特异异性性抑抑制制cdk4-cyclinD1

19、,cdk6-cyclinD1。Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑抑制制大大多多数数CDK的的激激酶酶活活性性。P21cip1还还能能与与DNA聚聚合合酶酶的的辅辅助助因因子子PCNA结合，直接抑制结合，直接抑制DNA的合成。的合成。作用机制：未完全清楚，大多数作用机制：未完全清楚，大多数CKI是通过直接与是通过直接与Thr160/161磷磷酸化后的酸化后的CDK-cyclin复合物密切结合，直接抑制其蛋白激酶活性。复合物密切结合，直接抑制其蛋白激酶活性。现较为肯定的是现较为肯定的是p21，其调控水平在基因转录的层面，当其调控水平在基因转录的层面，当DNA损损伤和细胞衰老

20、时，具有转录因子作用的伤和细胞衰老时，具有转录因子作用的p53增高，抑制其蛋白激酶活增高，抑制其蛋白激酶活性，阻滞细胞周期的进行。性，阻滞细胞周期的进行。CDKactivating活性位点活性位点活性位点活性位点抑制位点抑制位点抑制位点抑制位点由于某些环境因素的作用细胞周期出现故障或差错，由于某些环境因素的作用细胞周期出现故障或差错，这些信号可是细胞停留在某些点上，称为限制点。这些信号可是细胞停留在某些点上，称为限制点。主要检验点：主要检验点：G1/S限制点：限制点：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？细胞体积是否足够大？在酵母中称在酵母中称s

21、tart点，在哺乳动点，在哺乳动物中称物中称R点点(restrictionpoint)。S期限制点：期限制点：DNA复制是否完成？复制是否完成？G2/M限制点：限制点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大是否损伤？细胞体积是否足够大？中中-后期限制点：纺锤体组装限制点后期限制点：纺锤体组装限制点。2、细胞周期限制点（、细胞周期限制点（checkpoint）Four checkpoints3、调控细胞周期的内、外源信号系统、调控细胞周期的内、外源信号系统单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增殖与信号途径单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增殖与信号途径有关。有关。A、生长因子：生长

22、因子：是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（mitogen），），如如EGF、NGF。作用方式：旁分泌。作用方式：旁分泌。信号通路：信号通路：ras途径，途径，cAMP途径、磷脂酰肌醇途径。途径、磷脂酰肌醇途径。B、抑素（抑素（chalone)是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖起抑制作用的糖蛋白，与膜上的受体结合，引起信号转换及起抑制作用的糖蛋白，与膜上的受体结合，引起信号转换及在胞内传递，影响细胞周期相关的蛋白的表达。在胞内传递，影响

23、细胞周期相关的蛋白的表达。具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。作用于作用于G1期的抑素可阻止细胞进入期的抑素可阻止细胞进入S期，称期，称S因子。因子。作用于作用于G2期的抑素可阻止细胞进入期的抑素可阻止细胞进入M期，称期，称M因子。因子。五、五、细胞周期得以进行的两大机制细胞周期得以进行的两大机制 细细胞胞周周期期得得以以进进行行的的核核心心机机制制是是在在一一系系列列cyclin时时相相起起伏伏的的调调控控下下，相相应应的的CDK依依次次激激活活，驱驱使使细细胞胞通通过过G1,S,G2期期，达达到到M期期，细细胞胞一一分分为为二二，实实现现忠忠

24、于于亲亲代代的的细胞复制。细胞复制。这这一一过过程程的的顺顺利利完完成成取取决决于于是是否否启启动动（启启动动机机制制）和和能能否否忠忠于于运运行行（监监控控机机制制），达达到到忠忠实实复复制制，是是细细胞胞周期调控的两大生物学机制。周期调控的两大生物学机制。1、细胞周期的启动机制、细胞周期的启动机制细细胞胞周周期期能能否否启启动动进进行行细细胞胞增增殖殖，主主要要的的调调控控点点在在G1期期，它它决决定定细胞是否通过细胞是否通过G1期进入期进入S期。期。这这一一调调控控点点首首先先在在芽芽殖殖酵酵母母的的研研究究中中被被认认识识，人人们们称称其其为为“起起始始点点”（START）。一一旦旦细

25、细胞胞通通过过start,它它们们势势必必进进入入S期期，完完成成整整个个细细胞胞分分裂裂周周期期。因因此此start有有人人称称之之为为酵酵母母细细胞胞周周期期的的“决决定定点点”。在在人人体体细细胞胞增增殖殖中中，在在G1期期存存在在相相似似的的调调控控机机制制。在在G1期期较较晚晚时时，也也有有一一个个决决定定点点，称称为为“限限制制点点”（restrictionpoint），与与酵酵母母的的START功功能能类类似似，不不同同的的是是，人人类类细细胞胞是是否否通通过过“限限制制点点”，进进入入细细胞胞周周期期，主主要要受受与与细细胞胞增增殖殖有有关关的的细细胞胞外外生生长长因因子子的的

26、调调控控，而而不不是是营营养养素素。只只要要有有相相应应的的生生长长因因子子存存在在，细细胞胞就就能能通通过过R点点进进入入S期期，完完成成整整个个细细胞胞周周期期。回回到到G0/1期期。相相反反，如如果果细细胞胞在在G1期期就就缺缺乏乏相相应应的的生生长长因因子子，细细胞胞周周期期的的运运行行将将停停止止在在R点点，此此时时细细胞进入胞进入“安静状态，称之为安静状态，称之为G0期。期。连接信号转导与细胞周期有两条途径，一是连接信号转导与细胞周期有两条途径，一是cyclinD/CDK4，二是二是cyclinE/CDK2。二者都是二者都是G1期进行的限速步骤，即期进行的限速步骤，即cyclinD

27、或或cyclinE的过度表达，均能缩短的过度表达，均能缩短G1期时间或加速期时间或加速G1期进行期进行2、细胞周期的监控机制、细胞周期的监控机制A.DNA损伤检测点损伤检测点抑抑癌癌基基因因p53在在人人类类细细胞胞周周期期G1期期检检测测点点起起着着关关键性作用。还存在键性作用。还存在G2期检测点。期检测点。B.时相次序监测点时相次序监测点MPF(有有丝丝分分裂裂促促进进因因子子)，可可以以诱诱导导所所有有细细胞胞周周期时相的细胞核发生染色体凝集。期时相的细胞核发生染色体凝集。SPF(S期期促促进进因因子子)，只只能能诱诱发发G1期期细细胞胞进进入入S期期而不能使而不能使G2期细胞进入期细胞

28、进入M期。期。六、细胞周期的界面机制六、细胞周期的界面机制1、细胞周期与、细胞周期与DNA修复修复所所有有的的真真核核细细胞胞中中都都高高度度保保守守者者这这一一整整套套完完整整的的精精密密机机制制，承承担担着着DNA损损伤伤、错错误误地地发发现现，并并将将其其信信号号传传递递给给相相应应的的机机制制，去去阻阻滞滞细细胞胞周周期期的的运运行行，并并同同时时进进行行DNA损损伤伤的的修修复复。然然后后视视修修复复情情况况，细细胞胞基基因因的的突突变变。决决定定继继续续分分裂裂或或死死亡亡，执执行行一一系系列列细细胞胞的重要生命活动。的重要生命活动。DNA修复方式修复方式切除修复切除修复错配修复错

29、配修复:将局部一段错配的寡核苷酸链切除，重新合成之将局部一段错配的寡核苷酸链切除，重新合成之碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复全基因组切除修复全基因组切除修复转录切除修复转录切除修复2、细胞周期与细胞凋亡、细胞周期与细胞凋亡细胞凋亡存在有细胞周期特异性，不同因素诱导的细胞细胞凋亡存在有细胞周期特异性，不同因素诱导的细胞凋亡发生在细胞周期不同的时相凋亡发生在细胞周期不同的时相3、细胞周期与细胞分化、细胞周期与细胞分化细胞周期不仅与细胞增殖、细胞凋亡有关，还调控着细细胞周期不仅与细胞增殖、细胞凋亡有关，还调控着细胞分化胞分化1、细胞周期与肿瘤的关系、细胞周期与肿瘤的关系A.目目前

30、前从从多多方方面面对对肿肿瘤瘤进进行行了了深深入入研研究究（流流行行病病学学、病病因因学学、遗遗传传），肿肿瘤瘤是是多多因因素素，多多步步骤骤，多多阶阶段段的的。但但是是肿肿瘤瘤的的恶恶性性增增生生从从生生物物学学角角度度看看，主主要要表表现现在在两两方方面面：一一是是肿肿瘤瘤细细胞胞的的不不灭灭性性，即即细细胞胞凋凋亡亡障障碍碍；二二是是细细胞胞增增殖殖失失控控，程程序序发发生生紊紊乱乱，只只是增殖超常加快。这两方面均已成为肿瘤发生发展研究的热点。是增殖超常加快。这两方面均已成为肿瘤发生发展研究的热点。B.通通过过研研究究发发现现了了1.存存在在于于正正常常细细胞胞内内的的原原癌癌基基因因发

31、发生生错错误误转转变变为为癌癌基基因因2.一一些些基基因因失失活活后后正正常常细细胞胞转转变变为为癌癌细细胞胞抑抑癌癌基基因因。经经过过70年年代代的的癌癌基基因因时时代代，80年年代代的的抑抑癌癌基基因因时时代代90年年代代的的多多基基因因时时代代或或癌癌基基因因蛋蛋白白网网络络时时代代，提提出出了了一一系系列列的的理理论论：肿肿瘤瘤多多步步骤骤里里论论、DNA修修复复理理论论、细细胞胞凋凋亡亡理理论论，进进一一步步阐阐明明细细胞胞周周期核心机制、细胞周期启动机制、细胞周期检测点机制。期核心机制、细胞周期启动机制、细胞周期检测点机制。七、肿瘤与细胞周期七、肿瘤与细胞周期2、肿瘤细胞中细胞周期

32、检控机制的破坏肿瘤细胞中细胞周期检控机制的破坏A.细胞周期中检测细胞周期中检测DNA损伤的检测点至少有两处：损伤的检测点至少有两处：一一处处在在G1-S过过渡渡期期：控控制制进进入入S期期的的检检测测点点，防防止止DNA受受损损细细胞进入胞进入S期的期的DNA复制。复制。另另一一处处在在G2-M过过渡渡期期：控控制制进进入入M期期的的检检测测点点，防防止止受受损损的的DNA和未完成复制的和未完成复制的DNA进入有丝分裂。进入有丝分裂。B.这这些些DNA损损伤伤检检测测点点的的主主要要机机制制有有二二：一一是是p53依依赖赖性性机机制制，另另一一是是p53非非依依赖赖性性机机制制每每一一个个完完

33、整整的的检检测测点点应应由由四四部部分分组组成成，即即发发现现或或传传感感器器（detect或或sensor）、制制动动或或拘拘留留（stoporarrest）、修修 复复（repair）、决决 定定（decision，divide ordeath）。理理论论上上说说监监测测点点的的任任何何一一部部分分出出了了问问题题，都都会会导导致致功功能能的的异异常常，结结果果是是遗遗传传不不稳稳定定，基基因因受受损损的的细细胞胞存存活活和和复复制制或或细细胞胞遗遗传传物物质质的的改改变变，如如此此细细胞胞多多步步骤骤进进化化，最最终终成成为为失控性生长的肿瘤细胞。失控性生长的肿瘤细胞。3、肿瘤细胞中细胞

34、周期驱动机制的破坏、肿瘤细胞中细胞周期驱动机制的破坏细细胞胞周周期期监监测测点点功功能能的的减减弱弱，导导致致突突变变基基因因的的累累积积和和正正常常细细胞胞的的进进化化，只只有有当当这这些些累累积积的的突突变变基基因因破破坏坏了了细细胞胞周周期期驱驱动动机机制制，细细胞才能进入失控性生长的境界。胞才能进入失控性生长的境界。人们把细胞周期驱动机制比作一辆汽车或引擎，驱使其运行的因人们把细胞周期驱动机制比作一辆汽车或引擎，驱使其运行的因素好比素好比“油门油门”；制动器运行的机制犹如；制动器运行的机制犹如“刹车刹车”。持续地踏住。持续地踏住“油门油门”或或“刹车刹车”失灵，终将失控。这正是致变因素

35、导致基因失灵，终将失控。这正是致变因素导致基因突变，检测点基因突变，突变基因累积，驱动机制失控的必然结突变，检测点基因突变，突变基因累积，驱动机制失控的必然结果。果。C.肿肿瘤瘤的的发发生生发发展展过过程程中中，监监控控机机制制破破坏坏的的典典型型例例子子是是P53基基因因的的突突变变。大大约约50%的的人人类类肿肿瘤瘤都都存存在在P53基基因因的的突突变变，说说明明DNA损伤检测点在肿瘤的发生、发展中，具有重要的位置。损伤检测点在肿瘤的发生、发展中，具有重要的位置。From:British J.Cancer 87:129-1331:222-231MutationofG1/Sregulator

36、sinhumancancer八、常用的细胞周期检测方法八、常用的细胞周期检测方法1.流式细胞术流式细胞术A.PI(碘化丙锭碘化丙锭),可以与细胞内可以与细胞内DNA和和RNA结合结合,采用采用RNA抑制剂将抑制剂将RNA消消化后化后,通过流式细胞术检测到的与通过流式细胞术检测到的与DNA结合的结合的PI的荧光强度直接反映了细的荧光强度直接反映了细胞内胞内DNA含量的多少。含量的多少。B.由于细胞周期各时相的由于细胞周期各时相的DNA含量不同含量不同,因此因此,通过流式细胞术通过流式细胞术PI染色法对细染色法对细胞内胞内DNA含量进行检测时含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为可以将细胞周期

37、各时相区分为G1/G0期期,S期和期和G2/M期期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率并可通过特殊软件计算各时相的百分率:G1/G0期具有二倍体细胞的期具有二倍体细胞的DNA含量含量(2N),G2/M期具有四倍体细胞的期具有四倍体细胞的DNA含量含量(4N),S期的期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。含量介于二倍体和四倍体之间。C.值得注意的是值得注意的是,PI不能通过细胞膜完整的细胞不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞如活细胞和早期凋亡细胞),在标本制备时在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使才能使PI进入细胞

38、内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。的冷乙醇。将肿瘤细胞以将肿瘤细胞以1106接种于接种于60mm培养板，培养板，80汇合后传代。汇合后传代。2472小时后用胰酶消化收集细胞，小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加洗两遍，弃上清，加入入70预冷乙醇中，吹打均匀，预冷乙醇中，吹打均匀，4固定固定12小时以上。小时以上。PBS洗涤去乙醇，洗涤去乙醇，1000rpm,5min，洗两遍。洗两遍。0.5mlPBS重悬细胞，加入重悬细胞，加入PI和和RNaseA至终浓度至终浓度50g/ml，37温浴温浴30min。用流式细胞仪

39、测定周期。用流式细胞仪测定周期。PI：碘化丙啶，以碘化丙啶，以PBS配成配成1mg/ml，4保存。保存。RNaseA：10mg/mlD D、方法：方法：G2MGG0 0GG1 1s0 200 400 600 8001000GG0 0GG1 1sG2MDNA AnalysisDNA AnalysisDNA contentCount2 2N N4 4N NNormal Cell CycleNormal Cell Cycle Purdue University Cytometry LaboratoriesG1S phaseG2MG112 1DNA content The Cell CycleDNA

40、content by flow cytometryDeconvolution into cell cycle phasesG0/1G2/MSEventsMeasurement of sub G0/1 apoptotic particlesDNA contentEventsEventsG0/1G2/MSApoptosis4hr,control28hr,irradiatedG1:94.1%S:1.5%G2/M:4.4%G1:94.1%S:1.1%G2/M:4.8%G1:60.6%S:34.9%G2/M:4.5%G1:96.6%S:1.6%G2/M:1.8%10%1%90%4%28hr,contro

41、l28hr,aphidicolinOhr6hr12hr18hr24hr93.5%86.5%58.5%21.0%2%Inductionofp21resultsinparallellossofNPATfoci,down-regulationofhistonegeneexpressionandinhibitionofSphaseentry(1)2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr24 hr0 hrG1:47.2%S:34.2%G2/M:18.7%G1:46.3%S:34.9%G2/M:18.8%G1:51.9%S:29.8%G2/M:18.4%G1:56.1%S:23.9%

42、G2/M:20.1%G1:57.8%S:17.8%G2/M:24.5%G1:58.5%S:12.5%G2/M:29.0%G1:60.2%S:6.8%G2/M:33.0%G1:60.0%S:3.9%G2/M:36.1%G1:62.1%S:2.4%G2/M:35.5%B.A.2、BrdU掺入法掺入法(Sphase)A、原理：原理：在含有在含有5溴脱氧尿嘧啶核苷（溴脱氧尿嘧啶核苷（5Bromodeoxyuriding，BrdU）的培养基中，的培养基中，BrdU能取代胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（能取代胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（TdR）而渗入而渗入到新复制的到新复制的DNA子链中，子链中，B、染色要点：短时标记染

43、色要点：短时标记C、主要用于检测生长中的细胞主要用于检测生长中的细胞(S期期)G0G1SG2PrometaphaseAnaphaseCellcycle-dependentchangeofNPATlociinWI38cells3、CFSE标记法标记法A.CFSE：羧羧 基基 荧荧 光光 素素 二二 醋醋 酸酸 盐盐 琥琥 珀珀 酰酰 亚亚 胺胺 酯酯(5-or6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)-3,6-O,O-diacetylfluorescein)B.基基本本原原理理：CFSE能能够够轻轻易易穿穿透透细细胞胞膜膜，在在活活细细胞胞内内与与胞胞内内蛋蛋白白共共价价结结合合

44、，水水解解后后释释放放出出绿绿色色荧荧光光。在在细细胞胞分分裂裂增增殖殖过过程程中中，它它的的荧荧光光强强度度会会随随着着细细胞胞的的分分裂裂而而逐逐级级递递减减，标标记记荧荧光光可可平平均均分分配配至至两两个个子子代代细细胞胞中中，因因此此其其荧荧光光强强度度是是亲亲代代细细胞胞的的一一半半，根根据据这这一一特特性性，它它可可被被用用于于检检测测细细胞胞增增殖殖，细细胞胞周周期期的的估估算算及及细细胞胞分分裂裂等等方方面面。CFSE进进入入细细胞胞后后定定位位于于细细胞胞膜膜、细细胞胞质质和和细细胞胞核核，在在细细胞胞核核的的荧荧光光染染色色最最强强，并并证证实实CFSE不不影影响响细细胞胞

45、的的增增殖殖能能力力。此此方方法法操操作作简简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。C.另另外外，CFSE标标记记的的细细胞胞用用于于体体内内观观察察可可以以长长达达数数周周之之久久，它它常常被被用用来来做做活活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。CD4+CD25-T/APC/anti-CD3CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T/APC/anti-CD3九、细胞周期同步化九、细胞周期同步化1、自然同步化、自然同步化1)多核体：如：粘菌、疟原虫。多核体：如：粘菌、疟原虫。2)某些

46、水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。3)增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。细胞同步化细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化经人为处理造成的细胞周期同步化2、人工同步化、人工同步化1)选择同步化选择同步化A.有丝分裂选择法：有丝分裂选择法：M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。器壁收集。优点：操作简单

47、，同步化程度高，细胞不受药物伤害。优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%2%）。）。B.细胞沉降分离法：细胞沉降分离法：M期细胞体积大，可用离心分离。期细胞体积大，可用离心分离。优点：可用于任何悬浮培养的细胞。优点：可用于任何悬浮培养的细胞。缺点：同步化程度较低。缺点：同步化程度较低。2)诱导同步化诱导同步化A.A.DNADNA合成阻断法：选用合成阻断法：选用DNADNA合成的抑制剂，可逆地抑制合成的抑制剂，可逆地抑制DNADNA合成。合成。常用常用TDRTDR双阻断法：双阻断法：在细胞处于对数生长期的培

48、养基中加入过量在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TDRTDR（Hela Hela 2mol/L2mol/L；CHO 7.5mol/LCHO 7.5mol/L）。）。S S期细胞被抑制，停在期细胞被抑制，停在G1/SG1/S交界交界处。移去处。移去TDRTDR，释放时间大于释放时间大于TSTS时，再次加入过量时，再次加入过量TDRTDR。优点：同步化程度高优点：同步化程度高缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。B.B.中期阻断法中期阻断法用秋水仙素等细胞分裂抑制剂将细胞阻断在中期。用秋水仙素等细胞分裂抑制剂将细胞阻断在中期。优点：无非均衡生长现象，优点：无非均衡生长现象，缺点：可逆性较差。缺点：可逆性较差。C.C.血清饥饿法血清饥饿法