细胞生物学实验wang.ppt

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1、一、实验目的一、实验目的1、学习研究细胞凝集反应的方法2、了解细胞发生凝集反应的原因实验实验4细胞凝集反应细胞凝集反应二、实验原理二、实验原理凝集素凝集素:一类可逆结合特异糖基的蛋白质，与糖的一类可逆结合特异糖基的蛋白质，与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。分裂的调控有关。细胞凝集：凝集素与细胞表面的糖分子连接，在细细胞凝集：凝集素与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成胞间形成“桥桥”，加入与凝集素互补的糖分子可，加入与凝集素互补的糖分子可以抑制细胞间的凝集反应以抑制细胞间的凝集反应性质：性质：为糖蛋白为糖蛋白(少数例外少数例

2、外)凝集反应所必需的金属离子：凝集反应所必需的金属离子：Ca2+和和Mg2+所含糖种类在动物、植物和微生物中不同所含糖种类在动物、植物和微生物中不同特异性：特异性：一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力，如：的能力，如：刀豆素与刀豆素与D吡喃糖基甘露糖结合吡喃糖基甘露糖结合;麦芽素与麦芽素与N乙酰糖胺结合乙酰糖胺结合;菜豆凝集素与菜豆凝集素与N乙酰乳糖胺结合乙酰乳糖胺结合功能：功能：1.参与细胞的识别和粘着参与细胞的识别和粘着2.在植物生长的各个阶段，凝集素以不同的方式在植物生长的各个阶段，凝集素以不同的方式保护植物免受害虫的侵害保护植物免受

3、害虫的侵害3.作为氮源：凝集素在储藏器官和繁殖器官中的作为氮源：凝集素在储藏器官和繁殖器官中的含量尤其丰富含量尤其丰富凝集素的应用：凝集素的应用：1.作为细胞分化和成熟的标记作为细胞分化和成熟的标记2.作为细胞特殊类型的标记作为细胞特殊类型的标记3.作为肿瘤诊断的标记作为肿瘤诊断的标记三、实验材料与用品三、实验材料与用品实验材料：马铃薯块茎，韭菜叶片试剂：(1)磷酸缓冲液：pH7.2(2)生理盐水：0.9氯化钠无菌水溶液(3)硫酸铵(4)石英砂仪器与器材：离心机，光学显微镜研钵，药匙，纱布，离心管，带刻度,滴管，烧杯，玻璃棒，量桶，载玻片，盖玻片，滤纸，吸水纸。四、实验方法四、实验方法2%鸡红

4、细胞悬液制备鸡红细胞悬液制备以无菌方法抽取鸡翅下静脉血液（5mL注射器用1%肝素溶液浸润）1mL，用生理盐水洗3次，每次1500r/min，离心5min，最后按沉淀压积的红细胞体积用生理盐水配成2红细胞悬液。称取土豆去皮块茎4g，切成小块，5mLPBS加石英砂，研磨，浸泡1.5h载玻片上滴一滴浸泡液再滴一滴2红细胞液，充分混匀静置10min低倍显微镜下观察血细胞凝集现象以PBS加2血细胞悬液作为对照实验，低倍显微镜下观察（3）称取韭菜叶片5g，切成小片5mL生理盐水研磨，过滤，离心（5000r/min）20min，留上清液上清液加相应硫酸铵至60%饱和度（边加入边用玻璃棒搅拌至完全溶解），离心

5、（5000r/min）20min，沉淀用1ml磷酸缓冲液溶解载玻片上滴一滴韭菜凝集素再滴一滴2红细胞液，充分混匀静置10min低倍显微镜下观察血球凝集现象不同饱和度硫酸胺沉淀蛋白质表五、实验报告及作业五、实验报告及作业1.绘图表示血细胞凝集现象，并说明原因。绘图表示血细胞凝集现象，并说明原因。2.植物细胞凝集素在鸡红细胞凝集过程中起植物细胞凝集素在鸡红细胞凝集过程中起什么作用？什么作用？3.哪些因素影响细胞凝集反应？哪些因素影响细胞凝集反应？1.掌握徒手切片的方法2.观察叶绿体的自发荧光和次发荧光3.熟悉荧光显微镜的使用方法一、实验目的一、实验目的实验实验7：叶绿体的荧光原位观察：叶绿体的荧光

6、原位观察二、实验原理荧光:某些物质在定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光荧光显微术:利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。自发荧光:生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，如叶绿索的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。次生荧光:有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光,如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。ArcLamp(汞灯汞灯)Excitation Filter激发滤片激发滤片Emission Filter吸收滤片吸收滤片荧光显微镜荧光显微镜三、实验材料

7、与用品：三、实验材料与用品：实验材料：烟草、大葱叶片试剂：0.01%吖啶橙0.9氯化钠溶液仪器与器材：普通显微镜，荧光显微镜刀片，眼科镊子（直头），载玻片，盖薄片，滴管，砂布，四、实验方法四、实验方法:1、普通显微镜观察叶绿体形态1)徒手切片:用刀片将新鲜的叶片削出一斜面沿斜面切下一薄层完整组织，置于载玻片上滴加0.9NaCl溶液加盖片后轻压置显微镜下观察，观察记录细胞中叶绿体的形态、数目和分布状况普通显微镜观察叶绿体形态2)表皮条撕表皮滴加0.9NaCl溶液加盖片后轻压置显微镜下观察，观察记录细胞中叶绿体的形态、数目和分布状况2、叶绿体自发荧光观察相同方法制备叶片徒手切片和表皮条置荧光显微镜

8、下用蓝光激发光照射标本观察记录细胞中叶绿体的形态、数目和分布状况。3、徒手切片叶绿体次生荧光观察相同方法制备叶片徒手切片和表皮条相同方法制备叶片徒手切片和表皮条滴加滴加0.01%吖啶橙，染色吖啶橙，染色1分钟分钟洗去余液，加盖玻片洗去余液，加盖玻片置荧光显微镜下观察，用紫外激发光照射标本，记录细胞中叶置荧光显微镜下观察，用紫外激发光照射标本，记录细胞中叶绿体的形态、数目和分布状况。绿体的形态、数目和分布状况。五、注意事项五、注意事项:1.吖啶橙为有毒物质，使用时注意不要涂到皮肤、实验台给其它器皿上。用过的载玻片放到指定地点统一处理。2.使用荧光显微镜时要正确操作3.吖啶橙易分解，染色时要致黑暗

9、处，观察时动作要快。五、实验报告及作业五、实验报告及作业加入吖啶橙染色后，叶绿体和细胞核各发出什么颜色的荧光？为什么？吖啶橙:可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。一、实验目的一、实验目的1.掌握考马斯亮蓝R250染细胞骨架的方法。2.认识细胞内细胞骨架的网状结构实验实验8植物细胞骨架的观察植物细胞骨架的观察二、实验原理二、实验原理植物细胞用适当浓度的植物细胞用适当浓度的TritonX-100处理后，可处理后，可破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白质却破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白质却保护完好。保护完好。戊二醛固定能较好地保存细

10、胞骨架成分，考马斯戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，考马斯亮蓝亮蓝R250是一种蛋白质染料。处理后的材料固定是一种蛋白质染料。处理后的材料固定和染色后，用光学显微镜观察，可以见到网状的和染色后，用光学显微镜观察，可以见到网状的细胞骨架结构。细胞骨架结构。三、实验材料与用品：三、实验材料与用品：实验材料：实验材料：洋葱鳞叶，烟草叶片洋葱鳞叶，烟草叶片试剂：试剂：(1)0.2考马斯亮蓝R250染色液：(2)磷酸缓冲液，pH6.8(3)M缓冲液：50mmolL咪唑，50mmol/L氯化钾，0.5mmolL氯化镁,1mmol/LEGTA,0.1mmol/LEDTA,1mmolL巯基乙醇(DTT)，p

11、H7.2。(4)1%TrionX-100：M缓冲液配制。(5)3%戊二醛：磷酸缓冲液配制。仪器与器材：显微镜1.5ml离心管，直头眼科镊子，滴管，载玻片，盖玻片，滤纸，吸水纸。四、实验操作四、实验操作：撕洋葱内侧表皮若干片撕洋葱内侧表皮若干片置于置于PBS中，使其下沉中，使其下沉吸去吸去PBS，加，加1ml1%TritonX-100，20-30min吸去吸去1%TritonX-100，用，用Mbuffer洗洗3次，每次次，每次2分钟分钟用用3%戊二醛固定戊二醛固定20-30min吸去戊二醛，用吸去戊二醛，用PBS洗洗3次，每次次，每次2min加少量加少量0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色染色10-15min用蒸馏水洗用蒸馏水洗2次，吸干次，吸干镜检镜检五、实验报告及作业五、实验报告及作业1、画出所观察到的细胞骨架图2、为什么用TritonX-100的缓冲液处理材料？