育种出发菌的分离筛选.ppt

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1、第五章第五章 育种出发菌的分离筛选育种出发菌的分离筛选1.1.向向菌种保藏机构索取菌种保藏机构索取有关的菌株。有关的菌株。菌种来源的途径菌种来源的途径国内外著名的菌种保藏机构有：国内外著名的菌种保藏机构有：CCCCM CCCCM(中国微生物保藏管理委员会）中国微生物保藏管理委员会）ATCCATCC(美国典型菌种保藏中心）美国典型菌种保藏中心）NCTC NCTC(英国国家典型菌种保藏所英国国家典型菌种保藏所)IFO IFO(大阪发酵研究所大阪发酵研究所)2.2.从从一些发酵制品中分离一些发酵制品中分离目的菌株。容易筛选到较理想目的菌株。容易筛选到较理想的菌株。的菌株。3.3.由由自然界采集样品自

2、然界采集样品中获得。如土壤、水、动植物中获得。如土壤、水、动植物 体等，从中进行分离筛选。容易发现新的菌株资源。体等，从中进行分离筛选。容易发现新的菌株资源。2022/12/162菌株分离与筛选菌株分离与筛选1.菌株分离菌株分离(separation)：是将是将样品样品中混杂生长的各中混杂生长的各种微生物通过种微生物通过分离技术分离技术区分开，区分开，获得所需微生物获得所需微生物的的过程。过程。2.菌株筛选菌株筛选(screening)：在目的菌株分离的基础上，在目的菌株分离的基础上，结合常规结合常规生产性能测定生产性能测定，选择选择目的产物合成能力相目的产物合成能力相对高的菌株的过程。对高的

3、菌株的过程。2022/12/163菌菌株株分分离离和和筛筛选选2022/12/164第一节第一节 含微生物样品的采集含微生物样品的采集第二节第二节 含微生物样品的富集培养含微生物样品的富集培养第三节第三节 微生物的分离微生物的分离第四节第四节 野生菌株筛选和目的产物鉴定野生菌株筛选和目的产物鉴定主要内容主要内容2022/12/165第一节第一节 含微生物样品的采集含微生物样品的采集2022/12/166含微生物样品的采集含微生物样品的采集一、从土壤中采样一、从土壤中采样1 根据土壤特点采集根据土壤特点采集 土壤有机质含量和通气状况土壤有机质含量和通气状况2022/12/167典型的土壤层次结构

4、典型的土壤层次结构典型的土壤层次结构典型的土壤层次结构A soil profile B堆积枯枝落叶，下部已初步分堆积枯枝落叶，下部已初步分解解腐殖质含量高，与矿物颗粒紧腐殖质含量高，与矿物颗粒紧密结合形成暗色土层密结合形成暗色土层物质淋失，颜色较浅物质淋失，颜色较浅淋滤层淋移物质在沉积层沉积，淋滤层淋移物质在沉积层沉积，多形成核状、柱状、棱状结多形成核状、柱状、棱状结构，较紧实构，较紧实土层较深，受成土因素影响土层较深，受成土因素影响小，保持母质特性小，保持母质特性2022/12/168不同土壤类型2022/12/169 地理条件地理条件 南南方方土土壤壤比比北北方方土土壤壤中中的的微微生生物

5、物数数量量和和种种类类都要多都要多。季节条件季节条件 秋季是采样的良好季节秋季是采样的良好季节 土壤的酸碱度土壤的酸碱度 2022/12/1610 2 土壤中采样的方法土壤中采样的方法选点选点取土取土装袋装袋标记标记用取样铲，将表层用取样铲，将表层5 5cmcm左右的浮土除去，左右的浮土除去，取取5-255-25cmcm处的土样处的土样10-2510-25g g，记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件境条件2022/12/1611二、根据微生物生理特点采样二、根据微生物生理特点采样 根据微生物营养类型根据微生物营养类型 微微生生物物的的营营养

6、养需需要要和和代代谢谢类类型型与与其其生生长长环环境境有着很大的相关性。有着很大的相关性。在筛选一些在筛选一些具有特殊性能具有特殊性能的微生物时，需根据的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。根据微生物的生理特性根据微生物的生理特性2022/12/1612局部环境条件。如：海洋、肠道、温泉、堆肥局部环境条件。如：海洋、肠道、温泉、堆肥 极端环境条件。极端环境条件。在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，高碱、高盐或高辐射强度的环境下，

7、也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端环境微生物。这类微生物被称为极端环境微生物。三、特殊环境下采样三、特殊环境下采样2022/12/1613第二节第二节 含微生物样品的富集培养含微生物样品的富集培养2022/12/1614 富富集集(enrichment)enrichment)培培养养：是是在在目目的的微微生生物物含含量量较较少少时时，根根据据微微生生物物的的生生理理特特点点，设设计计一一种种选选择择性性培培养养基基，并并创创造造有有利利的的生生长长条条件件，使使目目的的微微生生物物在在合合适适的的环环境境下下迅迅速速生生长长繁繁殖殖，由由原原来来自自然然条条件件下下的的劣劣势势种种变变成

8、成人人工工环环境境下下的的优优势势种种，以利分离到所需要菌株的过程。，以利分离到所需要菌株的过程。富集培养主要根据微生物的碳源、氮源、富集培养主要根据微生物的碳源、氮源、pHpH、温度、温度、需氧情况等生理因素加以控制。需氧情况等生理因素加以控制。2022/12/1615一、控制培养基的营养成分一、控制培养基的营养成分 二、控制培养条件二、控制培养条件 通通过过对对pH、温温度度及及通通气气量量等等其其他他一一些些条条件件的的特特殊殊要要求求加以控制培养，达到有效的分离目的。加以控制培养，达到有效的分离目的。如如 pH 细菌、放线菌：一般要求偏碱细菌、放线菌：一般要求偏碱(pH7.2-7.5)

9、，霉菌和酵母菌：要求偏酸霉菌和酵母菌：要求偏酸(pH4.5-6)。2022/12/1616三、抑制不需要的菌类三、抑制不需要的菌类 通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，达到富集的目的。的数量，使目的微生物的比例增加，达到富集的目的。如：如：硫乙醇酸钠造成厌氧环境，利于厌氧菌生长。硫乙醇酸钠造成厌氧环境，利于厌氧菌生长。抗生素可抑制细菌生长，用于培养霉菌。抗生素可抑制细菌生长，用于培养霉菌。2022/12/1617第三节第三节 微生物的分离微生物的分离2022/12/1619一、好气微生物的分离一、好气微

10、生物的分离分离的方法很多，可分为分离的方法很多，可分为“菌落纯菌落纯”和和“菌株纯菌株纯”。1 1 稀释涂布法稀释涂布法2022/12/16202 2 划线分离法划线分离法2022/12/16213 3 利用生化反应进行分离利用生化反应进行分离饱浸含某种指示饱浸含某种指示剂的固体培养基剂的固体培养基的滤纸片变色圈的滤纸片变色圈 固体培养基中渗入溶解性固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。质形成透明圈。利用某种营养缺陷型微生利用某种营养缺陷型微生物作为指示菌，若待筛选

11、物作为指示菌，若待筛选菌具有将前体物转化成营菌具有将前体物转化成营养物的能力，指示菌就能养物的能力，指示菌就能围绕该菌生长。围绕该菌生长。待筛选的菌株能待筛选的菌株能分泌产生某些能分泌产生某些能抑制指示菌生长抑制指示菌生长的物质的物质 指示剂直接掺入或喷洒固体指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液碘液 2022/12/1622变色圈法：变色圈法：2022/12/1623透明圈法透明圈法2022/12/1624脂酶产生菌的分离：脂酶产生菌的分离：可采用固体平板可采用固体平板变色圈法变色圈法。甘油三丁酸脂甘油三丁

12、酸脂为底物，为底物，罗丹明罗丹明 B B 为指示剂，观察为指示剂，观察荧光圈荧光圈；制制备备维维多多利利亚亚蓝蓝乳乳脂脂琼琼脂脂培培养养基基(pH pH 7.0 7.0)，将将样样品品涂涂布布在平板上培养，阳性反应由粉红色变为在平板上培养，阳性反应由粉红色变为蓝色蓝色。改改良良双双层层法法：平平皿皿底底层层倒倒一一层层营营养养琼琼脂脂，把把一一片片浸浸有有被被维维多多利利亚亚蓝蓝染染色色的的乳乳脂脂的的圆圆纸纸片片铺铺在在上上面面，然然后后覆覆盖盖一一薄薄层层含含样样品营养琼脂，保温培养，阳性反应为品营养琼脂，保温培养，阳性反应为蓝色蓝色。2022/12/16254 组织分离法组织分离法是从一

13、些罹病组织或特殊组织中分离菌株的方法。是从一些罹病组织或特殊组织中分离菌株的方法。对一般患病组织的分离方法对一般患病组织的分离方法取样取样无菌水洗涤无菌水洗涤表面消毒表面消毒无菌水洗涤表面无菌水洗涤表面植入平板，培养植入平板，培养镜检，分离纯化镜检，分离纯化2022/12/1626 食用菌孢子分离法食用菌孢子分离法a.a.多孢子分离法多孢子分离法 孢子采集装置孢子采集装置2022/12/1627NT-88NE NT-88NE 显微显微操作系统：(NARISHIGE)适用于各种用适用于各种用途：转基因、途：转基因、遗传工程、人遗传工程、人工受精、胚胎工受精、胚胎移植、和电生移植、和电生理学方面。

14、理学方面。b.b.单孢子分离法单孢子分离法2022/12/16285 特殊菌类特殊菌类环保菌的分离环保菌的分离 在分离某类污染物或废弃物的降解微生物时，通在分离某类污染物或废弃物的降解微生物时，通常采用常采用以该物质为唯一碳源或氮源的培养基以该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集进行富集培养，经过几个月的富集培养后，通过划线或涂布的培养，经过几个月的富集培养后，通过划线或涂布的方法进行在分离平板上分离、筛选。方法进行在分离平板上分离、筛选。该法在分离苯胺、该法在分离苯胺、DDTDDT、甲基对硫磷（甲基对硫磷（MPMP）、）、石油、石油、甲胺磷等污染物降解菌时取得良好效果。甲胺磷等污染物降解菌时

15、取得良好效果。注意：环境污染物一般对微生物的生长有抑制作用，需注意：环境污染物一般对微生物的生长有抑制作用，需要根据不同情况设计合理的筛选模型。要根据不同情况设计合理的筛选模型。2022/12/1629二、厌气菌的分离二、厌气菌的分离 加还原剂加还原剂 焦性没食子酸法焦性没食子酸法 平皿厌气培养法平皿厌气培养法 试管厌气培养法试管厌气培养法 玻璃板隔绝空气培养法玻璃板隔绝空气培养法 生物吸氧法生物吸氧法2022/12/1630厌氧培养袋厌氧培养袋厌氧培养罐厌氧培养罐厌氧工作站厌氧工作站厌氧操作仪器厌氧操作仪器2022/12/1631第四节 野生菌株筛选和目的产物鉴定2022/12/1632一、

16、初筛一、初筛 定义：从大量分离到的微生物中将能合成目的产物定义：从大量分离到的微生物中将能合成目的产物的微生物筛选出来的过程。筛选的方法有以下两种：的微生物筛选出来的过程。筛选的方法有以下两种：1 1 平板筛选平板筛选 用于在分离纯化阶段用于在分离纯化阶段随机挑选随机挑选的菌株，用选择性平板的菌株，用选择性平板进行定性测定。进行定性测定。特点：快速，简捷，效率高。特点：快速，简捷，效率高。2022/12/16332 2 摇瓶发酵筛选摇瓶发酵筛选 用于经过定性筛选的菌种，通过摇瓶发酵进一步测用于经过定性筛选的菌种，通过摇瓶发酵进一步测定菌株相互之间产物活性的差异。定菌株相互之间产物活性的差异。特

17、点：比较接近发酵罐培养条件。特点：比较接近发酵罐培养条件。接种发酵接种发酵制作制作含指示菌或底物含指示菌或底物的琼脂平板的琼脂平板琼脂平板打孔琼脂平板打孔加发酵液加发酵液测透明圈测透明圈2022/12/1634二、复筛二、复筛 将将初初筛筛得得到到的的菌菌株株进进行行发发酵酵罐罐发发酵酵，然然后后精精确确分分析析（如如：电电泳泳、色色谱谱、质质谱谱等等精精密密仪仪器器）测测定定其其确确切切的的产产量水平，从而确定用于生产的菌株的过程。量水平，从而确定用于生产的菌株的过程。复筛的工作：复筛的工作：优化培养基成分；优化培养基成分；注意各种培养条件注意各种培养条件对菌体量或产物量的影响，并对各种影响因子进行组合对菌体量或产物量的影响，并对各种影响因子进行组合实验，初步掌握该菌的适合培养条件。实验，初步掌握该菌的适合培养条件。三、筛选结果评价三、筛选结果评价2022/12/16352022/12/1636思考题1、菌株分离和筛选的一般过程是什么？2、利用生化反应进行菌株分离的主要方法有哪些？2022/12/1637