第二章-蛋白质培训讲学.ppt

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1、第二章-蛋白质 蛋白质是遗传信息的执行者或生物功能的主要体现者蛋白质是遗传信息的执行者或生物功能的主要体现者 （1 1）酶的催化作用）酶的催化作用 （2 2）调节作用）调节作用(多肽类激素多肽类激素)（3 3）运输功能）运输功能 （4 4）运动功能）运动功能 （5 5）免疫保护作用）免疫保护作用(抗体、干扰素抗体、干扰素)（6 6）接受、传递信息的受体）接受、传递信息的受体 蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成碳碳 50 50氢氢 7 7氧氧 23 23氮氮 16%16%硫硫 03 03其它其它 微量微量1mg1mg氮氮6.25mg6.25mg蛋白质蛋白质第一节第一节 氨基酸氨基酸一、氨基酸的结构

2、与分类一、氨基酸的结构与分类一、氨基酸的结构与分类一、氨基酸的结构与分类(2)(2)除除甘氨酸甘氨酸外外,其它所有氨基酸分子中的其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳碳原子都为不对称碳原子原子,所以：所以：A.A.氨基酸都具有旋光性。氨基酸都具有旋光性。B.B.每一种氨基酸都具有每一种氨基酸都具有D-D-型和型和L-L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-L-型。型。1.1.氨基酸的结构氨基酸的结构 氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸脯氨酸外，这些天然氨

3、基酸在结构上的共同特点为：(1)(1)与羧基相邻的与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸氨基酸 COOHH2N CH -碳原子基团 R R基团-氨基酸基本结构通式L-甘油醛甘油醛D甘油醛甘油醛L氨基酸氨基酸D氨基酸氨基酸注意：注意：构型与旋光构型与旋光方向二者没有直接对方向二者没有直接对应的关系。各种应的关系。各种L L氨氨基酸中有的为左旋，基酸中有的为左旋，有的为右旋，即使同有的为右旋，即使同一种一种L L氨基酸，在不氨基酸，在不同溶剂中测定时，其同溶剂中测定时，其比旋光值和旋光方向比旋光值和旋光方向也会不同。也会不同。2.2.2.2.常见氨基酸的

4、分类常见氨基酸的分类常见氨基酸的分类常见氨基酸的分类 极性极性AAAA（1 1）按）按R R基团的极性分基团的极性分 非非极性极性AAAA 脂肪族脂肪族AA AA （2 2）按）按R R基团的化学结构分基团的化学结构分 芳香族芳香族AAAA 杂环族杂环族AAAA3.人体所需的八种必需氨基酸人体所需的八种必需氨基酸 人体必不可少，而机体内又不能合成的，必须从食物中补充的人体必不可少，而机体内又不能合成的，必须从食物中补充的氨基酸，称必需氨基酸。氨基酸，称必需氨基酸。赖氨酸赖氨酸(Lys)(Lys)缬氨酸缬氨酸(Val)(Val)蛋氨酸蛋氨酸(Met)(Met)色氨酸色氨酸(Trp)(Trp)亮氨

5、酸亮氨酸(Leu)(Leu)异亮氨酸异亮氨酸(Ile)(Ile)苏氨酸苏氨酸(Thr)(Thr)苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)(Phe)酸性酸性AAAA碱性碱性AAAA非解离非解离AAAA（3 3）从营养学角度分）从营养学角度分非必需非必需AAAA必需必需AAAA 4.蛋白质代谢中还存在的氨基酸蛋白质代谢中还存在的氨基酸鸟氨酸（鸟氨酸（OrnOrn）瓜氨酸（瓜氨酸（CitCit）胱氨酸胱氨酸 二二.氨基酸的重要理化性质氨基酸的重要理化性质1.1.1.1.一般物理性质一般物理性质一般物理性质一般物理性质(1)(1)溶解性：溶解性：常见氨基酸均为无色结晶常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异。其形状

6、因构型而异。各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。(2)(2)熔点：熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。(3)(3)味感：味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。(4)(4)旋光性：旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)(5)光吸收：光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)由于酪氨酸

7、、苯丙氨酸和色氨酸的R基团含有苯环共轭双键系统，有吸收光的能力。n n酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸 maxmax275nm275nm，275=1.4x10275=1.4x103 3;n n苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸 maxmax257nm257nm，257=2.0 x10257=2.0 x102 2;n n色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸 maxmax280nm280nm，280=5.6x10280=5.6x103 3;蛋白质由于含有这些氨基酸，一般最大光吸收在波长蛋白质由于含有这些氨基酸，一般最大光吸收在波长280nm280nm处，处，因此利用紫外分光光度计能很方便地测定蛋白质的含量。因此利用紫外

8、分光光度计能很方便地测定蛋白质的含量。2.2.2.2.氨基酸的离解性质氨基酸的离解性质氨基酸的离解性质氨基酸的离解性质n n氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸同同同同时时时时含含含含有有有有碱碱碱碱性性性性的的的的氨氨氨氨基基基基和和和和酸酸酸酸性性性性的的的的羧羧羧羧基基基基，是是是是一一一一种种种种两两两两性性性性电电电电解解解解质质质质。在在在在结结结结晶晶晶晶形形形形态态态态或或或或在在在在水水水水溶溶溶溶液液液液中中中中，并并并并不不不不是是是是以以以以游游游游离离离离的的的的羧羧羧羧基基基基或或或或氨氨氨氨基基基基形形形形式式式式存存存存在在在在，而是离解成两性离子。而是离解成两性离子。而是

9、离解成两性离子。而是离解成两性离子。n n在在在在两两两两性性性性离离离离子子子子中中中中，氨氨氨氨基基基基是是是是以以以以质质质质子子子子化化化化(-NH(-NH(-NH(-NH3 3 3 3+)形形形形式式式式存存存存在在在在，羧羧羧羧基基基基是是是是以以以以离离离离解解解解状态状态状态状态(-COO(-COO(-COO(-COO-)存在。存在。存在。存在。n n在不同的在不同的在不同的在不同的pHpHpHpH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。条件下，两性离子的状态也随之发生变化。条件下，两性离子的状态也随之发生变化。条件下，两性离子的状态也随之发生变化。净电荷净电荷+1 0 -1 正

10、离子正离子 两性离子两性离子 负离子负离子 3.3.3.3.氨基酸的等电点氨基酸的等电点氨基酸的等电点氨基酸的等电点 当调节氨基酸溶液的当调节氨基酸溶液的pHpH值，使氨基酸分子中所含的值，使氨基酸分子中所含的-NH-NH3 3+和和-COOCOO-数目正好相等，即净电荷为数目正好相等，即净电荷为0 0，在电场中既不向阴极移动，在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时氨基酸所处溶液的也不向阳极移动，此时氨基酸所处溶液的pHpH值即为值即为氨基酸的等电氨基酸的等电点点，简称，简称pIpI。在等电点时，氨基酸的溶解度最小，容易沉淀，利用这一性质可以分离制备某些氨基酸。侧链不含离解基团的中性氨基

11、酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI=(pK1+pK2)/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR)/2 碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR)/2 净电荷为零净电荷为零在电场中不移动在电场中不移动带正电荷带正电荷在电场中移向负极在电场中移向负极在电场中移向正极在电场中移向正极带负电荷带负电荷pH pIpH=pI 氨基酸的氨基酸的 带电状态和在电场中的状况：带电状态和在电场中的状况：脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮生成黄色化合物。此反应非常灵敏，根据紫色的深浅，在570nm波长（或根据黄色深浅在440nm

12、波长）下测定光吸收值，就可测定样品中氨基酸含量。采用纸层析、离子交换层析和电泳等技术分离氨基酸时，常用茚三酮溶液做显色剂，以定性和定量测定氨基酸。4.4.氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质(1)(1)与茚三酮的反应（颜色反应）与茚三酮的反应（颜色反应）H2ONH3CO2RCHO2NH33H2O紫色化合物紫色化合物(2)(2)与甲醛反应与甲醛反应n n反应特点反应特点反应特点反应特点A.A.A.A.为为为为-NH-NH-NH-NH2 2 2 2的反应的反应的反应的反应B.B.B.B.在常温，中性条件，甲醛与在常温，中性条件，甲醛与在常温，中性条件，甲醛与在常温，中性条件，甲醛与-NH-NH-NH-

13、NH2 2 2 2很快反应，生成羟甲很快反应，生成羟甲很快反应，生成羟甲很快反应，生成羟甲基氨基酸，释放氢离子。基氨基酸，释放氢离子。基氨基酸，释放氢离子。基氨基酸，释放氢离子。n n应用：氨基酸定量分析应用：氨基酸定量分析应用：氨基酸定量分析应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定）甲醛滴定法（间接滴定）甲醛滴定法（间接滴定）甲醛滴定法（间接滴定）A.A.A.A.直接滴定，终点直接滴定，终点直接滴定，终点直接滴定，终点pHpHpHpH过高（过高（过高（过高（12121212），没有适当指示剂。），没有适当指示剂。），没有适当指示剂。），没有适当指示剂。B.B.B.B.与甲醛反应，滴定终点在与

14、甲醛反应，滴定终点在与甲醛反应，滴定终点在与甲醛反应，滴定终点在9 9 9 9左右，可用酚酞作指示剂。左右，可用酚酞作指示剂。左右，可用酚酞作指示剂。左右，可用酚酞作指示剂。C.C.C.C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1 1 1 1：1 1 1 1）D.D.D.D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。+H+HCHOHCHO n n反应特点反应特点A.

15、A.为为-NH-NH2 2的反应的反应B.B.氨基酸氨基酸-NH-NH2 2的一个的一个H H原子可被烃基取代原子可被烃基取代(卤代烃卤代烃)C.DNP-C.DNP-氨基酸为黄色，稳定。氨基酸为黄色，稳定。D.D.多肽或蛋白质多肽或蛋白质N N端氨基酸的端氨基酸的-NH-NH2 2也能与也能与DNFBDNFB反应，生成反应，生成DNPDNP多肽或多肽或DNPDNP蛋白质。蛋白质。n n应用：鉴定多肽或蛋白质的应用：鉴定多肽或蛋白质的N-N-末端氨基酸末端氨基酸(3)(3)(3)(3)与与与与2,4-2,4-2,4-2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFBDNFB

16、DNFB）反应）反应）反应）反应首先由首先由首先由首先由SangerSangerSangerSanger应用，确定了胰岛素的一级结构应用，确定了胰岛素的一级结构应用，确定了胰岛素的一级结构应用，确定了胰岛素的一级结构A.A.A.A.肽分子与肽分子与DNFBDNFB反应，得反应，得DNP-DNP-肽肽B.B.B.B.水解水解水解水解DNP-DNP-DNP-DNP-肽，得肽，得肽，得肽，得DNP-NDNP-NDNP-NDNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸端氨基酸及其他游离氨基酸端氨基酸及其他游离氨基酸端氨基酸及其他游离氨基酸C.C.C.C.分离分离分离分离DNP-DNP-DNP-DNP-氨基酸氨基酸

17、氨基酸氨基酸D.D.D.D.层析法定性层析法定性DNP-DNP-氨基酸，得出氨基酸，得出N N端氨基酸的种类端氨基酸的种类 (4)与异硫氰酸苯酯（与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应）的反应+a.a.a.a.肽链（肽链（肽链（肽链（N N N N端氨基酸）与端氨基酸）与端氨基酸）与端氨基酸）与PITCPITCPITCPITC偶联，生成偶联，生成偶联，生成偶联，生成PTC-PTC-PTC-PTC-肽（苯胺基硫甲酰肽）。肽（苯胺基硫甲酰肽）。肽（苯胺基硫甲酰肽）。肽（苯胺基硫甲酰肽）。b.b.b.b.环化断裂：最靠近环化断裂：最靠近环化断裂：最靠近环化断裂：最靠近PTCPTCPTCPTC基的肽键断裂，

18、生成基的肽键断裂，生成基的肽键断裂，生成基的肽键断裂，生成PTC-PTC-PTC-PTC-氨基酸和少一残基氨基酸和少一残基氨基酸和少一残基氨基酸和少一残基的肽链，同时的肽链，同时的肽链，同时的肽链，同时PTC-PTC-PTC-PTC-氨基酸环化生成氨基酸环化生成氨基酸环化生成氨基酸环化生成PTH-PTH-PTH-PTH-氨基酸（苯乙内酰硫脲）。氨基酸（苯乙内酰硫脲）。氨基酸（苯乙内酰硫脲）。氨基酸（苯乙内酰硫脲）。c.c.c.c.分离分离分离分离PTH-PTH-PTH-PTH-氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸,用层析法鉴定，确定肽链的用层析法鉴定，确定肽链的用层析法鉴定，确定肽链的用层析法鉴定，确定肽

19、链的N N N N端氨基酸种类。端氨基酸种类。端氨基酸种类。端氨基酸种类。d.d.d.d.此法也叫此法也叫此法也叫此法也叫“Edman”“Edman”“Edman”“Edman”反应，反应，反应，反应，“多肽顺序自动分析仪多肽顺序自动分析仪多肽顺序自动分析仪多肽顺序自动分析仪”就是根据这个就是根据这个就是根据这个就是根据这个原理。原理。原理。原理。弱碱酸 第二节第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构蛋白质是由一条或多条多肽蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，

20、通常是将分子量在蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在60006000道尔顿以上的多肽称为蛋道尔顿以上的多肽称为蛋白质。白质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大,从大约从大约60006000到到10000001000000道尔顿甚至更大。道尔顿甚至更大。一一.基本问题基本问题-肽肽一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键肽键，所形成的化合物称为肽肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基氨基酸残基。n n在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺

21、序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序序称为氨基酸顺序n n通常在多肽链的一端含有一个游离的通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端氨基，称为氨基端或或N-N-端；在另一端含有一个游离的端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或羧基，称为羧基端或C-C-端。端。n n氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨基酸端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰胺丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰胺 Ser-Val-Tyr-Asp-Gln Ser-Val-Ty

22、r-Asp-Gln1.1.多肽多肽 2.2.天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽等。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽等。CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGly NH2SSCysTyrGlnAsnCysProSSPheArg

23、Gly NH2 催产素催产素 加压素加压素 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽二二二二.蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 1.1.蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primary structure)(Primary structure)蛋白质分子中氨基酸残基从蛋白质分子中氨基酸残基从N N末端到末端到C C末端的排列顺序，末端的排列顺序，即氨基酸的序列，是蛋白质最基本的结构。即氨基酸的序列，是蛋白质最基本的结构。2.2.蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构

24、的测定的测定(1)测定蛋白质的一级结构的要点测定蛋白质的一级结构的要点a.测定蛋白质中氨基酸组成。测定蛋白质中氨基酸组成。b.蛋白质的蛋白质的N端和端和C端的测定。端的测定。c.应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂，各自得到一系应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂，各自得到一系列大小不同的肽段。列大小不同的肽段。d.分离提纯所产生的肽，并测定它们的序列。分离提纯所产生的肽，并测定它们的序列。e.从有重叠结构的各个肽的序列中推断出蛋白质中全部的氨基酸排列顺序从有重叠结构的各个肽的序列中推断出蛋白质中全部的氨基酸排列顺序。(2)(2)测定步骤测定步骤测定

25、步骤测定步骤 多肽链的拆分多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。可用质分子，必须先进行拆分。可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基亚基).).测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过通过通过通过测定末端氨基酸残基的摩尔数，即可确定测定末端氨基酸残基的摩尔数，即可确定测定末端氨基酸残基的摩尔数，即可确定测定末端氨基酸残基的摩尔数，即可确定多肽链的数目多肽链的数目多肽链的数目多肽链的数目。二硫键

26、的断裂二硫键的断裂二硫键的断裂二硫键的断裂：肽链通过二硫键交联在肽链通过二硫键交联在肽链通过二硫键交联在肽链通过二硫键交联在一起。可在一起。可在一起。可在一起。可在8mol/L8mol/L8mol/L8mol/L尿素或尿素或尿素或尿素或6mol/L6mol/L6mol/L6mol/L盐酸胍存盐酸胍存盐酸胍存盐酸胍存在下，用过量的在下，用过量的在下，用过量的在下，用过量的 -巯基乙醇处理，使二硫巯基乙醇处理，使二硫巯基乙醇处理，使二硫巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生

27、成的巯基，以防止它重新被氧化。成的巯基，以防止它重新被氧化。成的巯基，以防止它重新被氧化。成的巯基，以防止它重新被氧化。巯基的保护巯基的保护CH2COClO A.A.SangerSanger法法法法B.B.EdmanEdman法法法法分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端 c.c.c.c.氨肽酶法：氨肽酶法：氨肽酶法：氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的的的的N-N-N-N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所端逐个的向里水解。根据不同的反应

28、时间测出酶水解所端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的量作动力学曲线，从而知道蛋白质的量作动力学曲线，从而知道蛋白质的量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-N-N-N-末端残基顺序。最常末端残基顺序。最常末端残基顺序。最常末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为用的氨肽酶是亮氨酸氨

29、肽酶，水解以亮氨酸残基为用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-N-N-N-末端的末端的末端的末端的肽键速度最大。肽键速度最大。肽键速度最大。肽键速度最大。D.D.D.D.肼解法：肼解法：肼解法：肼解法：此法是多肽链此法是多肽链此法是多肽链此法是多肽链C-C-C-C-端氨基酸分析法。多肽与肼在端氨基酸分析法。多肽与肼在端氨基酸分析法。多肽与肼在端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，无水条件下加热，无水条件下加热，无水条件下加热，C-C-C-C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的端氨基酸即从肽链上解离出来，

30、其余的端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与的物质而与的物质而与的物质而与C-C-C-C-端氨基酸分离。端氨基酸分离。端氨基酸分离。端氨基酸分离。E.E.E.E.羧肽酶法：羧肽酶法：羧肽酶法：羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-C-C-端逐个端逐个端逐

31、个端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的从而知道蛋白质的从而知道蛋白质的从而知道蛋白质的C-C-C-C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,CA,B,CA,B,C和和和和Y Y Y Y；A A A A和和和和B B B B来自

32、胰脏；来自胰脏；来自胰脏；来自胰脏；C C C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y Y Y来自面包酵母。羧肽酶来自面包酵母。羧肽酶来自面包酵母。羧肽酶来自面包酵母。羧肽酶A A A A能水解除脯能水解除脯能水解除脯能水解除脯氨酸氨酸氨酸氨酸,精氨酸和赖氨酸以外的所有精氨酸和赖氨酸以外的所有精氨酸和赖氨酸以外的所有精氨酸和赖氨酸以外的所有C-C-C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B B B只能水解精氨酸只能水解精氨酸只能水解精氨酸只能水解精氨酸和赖氨酸为和赖氨酸为和赖氨酸为和赖氨酸为C-C-C-C-末端残基的肽键。末端残基的肽键。末

33、端残基的肽键。末端残基的肽键。多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段：可采用两种或多种不同的断可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解的方法有：分离开来。多肽的选择性降解的方法有：a.a.a.a.酶解法酶解法酶解法酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶。胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶。b.b.b.b.化学法化学法化学法化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸

34、的羧基所形成的肽键。测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨利用两套或多套肽段的氨利用两套或多套肽段的氨利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。序。序。序。三三.蛋白质的空间结构蛋白质的空间结构1.1.蛋白质的二级结构蛋白

35、质的二级结构 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构(Secondary structure)(Secondary structure)主要是指蛋白质多主要是指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式。它只涉及肽链主链的构象及链内或肽链本身的折叠和盘绕方式。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有链间形成的氢键。主要有-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角和无规则卷曲。转角和无规则卷曲。（1 1）多肽链折叠的）多肽链折叠的空间限制空间限制肽键的特点是氮原子上的孤肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共振对电子与羰基具有明显的共振相互作用，形成共振杂化体。相互作用，形成共振杂化体。肽键中的肽键

36、中的C-NC-N键具有部分双键键具有部分双键性质，不能自由旋转。性质，不能自由旋转。组成肽键的原子处于同一平组成肽键的原子处于同一平面，此平面称为肽平面。其中面，此平面称为肽平面。其中C CO O与与N NH H以及两个以及两个C C均呈反均呈反式构型。式构型。R R侧链基团处于肽平面的外侧，侧链基团处于肽平面的外侧，影响构象的主要是影响构象的主要是R R侧链。侧链。n多肽链中的各个肽平面围绕同一多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，可以是左轴旋转，形成螺旋结构，可以是左手螺旋，也可以是右手螺旋。天然手螺旋，也可以是右手螺旋。天然蛋白质中的蛋白质中的-螺旋螺旋一般是右手螺一般是右手

37、螺旋。螺旋一周，沿轴上升的距离即旋。螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为螺距为0.54nm,0.54nm,含含3.63.6个氨基酸残基；个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离两个氨基酸之间的距离0.15nm.0.15nm.n肽链内形成氢键，氢键的取向几肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的酰胺基团的-CO-CO基与第四个氨基酸基与第四个氨基酸残基酰胺基团的残基酰胺基团的-NH-NH基形成氢键。基形成氢键。n由于脯氨酸的亚氨基参与形成肽由于脯氨酸的亚氨基参与形成肽键后，氮原子上已没有氢原子，无键后，氮原子上已没有氢原子，无法形成氢键，使法形成氢

38、键，使螺旋中断，形螺旋中断，形成成“结节结节”。左手和右手螺旋左手和右手螺旋（2 2）构象单元）构象单元-螺旋螺旋 -折叠折叠 -折叠是由两条或多条几乎完折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。呈锯齿桩折叠构象。-折叠有两种类型。一种为平行折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的式，即所有肽链的N-N-端都在同一边。端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。链的方向相反。在在-折叠中，折叠中，-碳原子总是处于碳原子总是处于折叠

39、的角上，氨基酸的折叠的角上，氨基酸的R R基团处于基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为氨基酸之间的轴心距为0.35nm 0.35nm。-折叠结构的氢键主要是由两条折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。与链的长轴接近垂直。-转角转角在在-转角部分，由四个氨基酸残转角部分，由四个氨基酸残基组成基组成.四个形成转角的残基中，第三四个形成转角的残基中，第三个一般均为

40、甘氨酸残基弯曲处的第个一般均为甘氨酸残基弯曲处的第一个氨基酸残基的一个氨基酸残基的-C=O -C=O 和第四个残和第四个残基的基的 N-H N-H 之间形成氢键，形成一个之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。存在于球状蛋白分子中。无规则卷曲无规则卷曲无规则卷曲也叫自由回转，没有一定规律的松散肽链结无规则卷曲也叫自由回转，没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象不同的蛋白质，自由回转的数量和链间氢键维持其构象不同的蛋白质，自由

41、回转的数量和形式各不相同分两类：形式各不相同分两类：紧密环紧密环 连接条带连接条带超二级结构和超二级结构和结构域结构域（）超二级结构（）超二级结构在蛋白质分子中，由在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级合体。几种类型的超二级结构：结构：；超二级结构在结构层次上高于二超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的级结构，但没有聚集成具有功能的结构域结构域（）结构域（）结构域 对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链

42、往往由两个或两个以上相对对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的、在空间上能辨认的三维实体缔合成三级结构，独立的、在空间上能辨认的三维实体缔合成三级结构，这种相对独这种相对独立的三维实体就称结构域。立的三维实体就称结构域。结构域通常是几个超二级结构的组合，充当三级结构的配件。对于结构域通常是几个超二级结构的组合，充当三级结构的配件。对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。域。结构域一般由结构域一般由100200100200个氨基酸残基组成，但大小范围可达个氨基酸残基组成，但大小范围可达

43、40 40400 400 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上结构域之间由结构域之间由“铰链区铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水在蛋白质分子

44、内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构是指多肽蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，从而生成特步盘旋、折叠，从而生成特定的空间结构。包括主链和定的空间结构。包括主链和侧链的所有原子的空间排布。侧链的所有原子的空间排布。一般非极性氨基酸残基埋在一般非极性氨基酸残基埋在分子内部，它们之间的疏水分子内部，它们之间的疏水作用维系并稳定已经形成的作用维系并稳定已经形成的三级结构，极性氨基酸残基三级结构，极

45、性氨基酸残基在分子表面，赋予蛋白质亲在分子表面，赋予蛋白质亲水的性质。水的性质。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 许多蛋白质是由两个或两个以上独立的三级许多蛋白质是由两个或两个以上独立的三级结构通过非共价键结合成的多聚体，称为结构通过非共价键结合成的多聚体，称为寡聚寡聚蛋白蛋白。寡聚蛋白中的每个独立三级结构单元称。寡聚蛋白中的每个独立三级结构单元称为为亚基亚基。蛋白质的四级结构是指亚基的种类、蛋白质的四级结构是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用和亚基间的相互作用。如，血红蛋白的四级结。如，血红蛋白的四级结构得测定由佩

46、鲁茨构得测定由佩鲁茨19581958年完成，其结构要点为：年完成，其结构要点为：球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基两个两个亚基，两个亚基，两个亚基亚基亚基：亚基：141141个残基；个残基；亚基：亚基：146146个残基个残基分子量分子量65 00065 000含四个血红素辅基含四个血红素辅基亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部在分子内部一级结构一级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三级结构三级结构亚基亚基四级结构四级结构 a盐键（离子键）b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键氢键、范德华力、疏

47、水相互作用力、离子键，均为次级键氢键、范德华力、疏水相互作用力、离子键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要疏水相互作用力对维持三级结构特别重要二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定配位键：两个原子由单方提供共用电子对形成的共价键，金属离子往往以配位键：两个原子由单方提供共用电子对形成的共价键，金属离子往往以共价键和蛋白质连接。共价键和蛋白质连接。四蛋白质分子中的共价键与次级键四蛋白质分子中的共价键与次级键第三节第三节 蛋白质分子结

48、构与功能的关系蛋白质分子结构与功能的关系一一.蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系 研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的氨研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的氨基酸残基与生物功能的关系。基酸残基与生物功能的关系。1.1.一级结构的变异与分子病一级结构的变异与分子病镰刀形细胞贫血病镰刀形细胞贫血病l患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S）l它与正常的血红蛋白（它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于）的差别：仅仅在于链的链的N-末端第末端第6位残基发生了变位残基发生了变化化l（

49、Hb-A）第）第6位残基是极性谷氨酸残基，（位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基）中换成了非极性的缬氨酸残基l使血红蛋白细胞在氧气缺乏时收缩成镰刀形，易胀破发生溶血，输氧能力下降，引使血红蛋白细胞在氧气缺乏时收缩成镰刀形，易胀破发生溶血，输氧能力下降，引起贫血症状。起贫血症状。l这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性2.2.一级结构的局部断裂与蛋白质一级结构的局部断裂与蛋白质的激活的激活 体内的某些蛋白质分子初合成时，体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质

50、原白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为称为前胰岛素原前胰岛素原前胰岛素原前胰岛素原的的N-N-末端有一段肽链，称末端有一段肽链，称为信号肽为信号肽.信号肽被切去，剩下的是信号肽被切去，剩下的是胰岛素原胰岛素原。胰岛素原胰岛素原比胰岛素分子多一段比胰岛素分子多一段C C肽，肽，只有当只有当C C肽被切除后才成为有肽被切除后才成为有5151个残基，个残基，分分A A、B B两条链的胰